張立峰，劉燦仿，張東平，陳亞，衛(wèi)茹，褚燕（邢臺醫(yī)學高等專科學校藥學系，河北邢臺054000）

HPLC-ELSD法同時測定復方小酸棗咀嚼片中4種指標性成分的含量Δ

張立峰＊，劉燦仿，張東平，陳亞，衛(wèi)茹，褚燕（邢臺醫(yī)學高等?？茖W校藥學系，河北邢臺054000）

目的：建立同時測定復方小酸棗咀嚼片中4種指標性成分含量的方法。方法：采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法。色譜柱為Grace Brava C18-BDS，流動相為乙腈-水（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，柱溫為25℃，進樣量為20 μL，漂移管溫度為100℃，載氣流速為2.9 L/min。結(jié)果：白樺脂酸、白樺脂醇、茯苓酸、甘草酸檢測質(zhì)量濃度線性范圍分別為44.50～890.0 μg/mL（r＝0.999 3）、20.28～405.6 μg/mL（r＝0.999 7）、20.50～656.0 μg/mL（r＝0.999 7）、10.50～336.0 μg/mL（r＝0.999 6）；精密度、穩(wěn)定性、重復性試驗的RSD＜3.0%；加樣回收率分別為99.44%～101.12%（RSD＝0.57%，n＝6）、99.41%～100.39%（RSD＝0.34%，n＝6）、99.31%～100.46%（RSD＝0.51%，n＝6）、98.96%～101.19%（RSD＝0.84%，n＝6）。結(jié)論：該方法操作簡便，精密度、穩(wěn)定性、重復性較好，可用于復方小酸棗咀嚼片中4種指標性成分含量的同時測定。

高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法；復方小酸棗咀嚼片；白樺脂酸；白樺脂醇；茯苓酸；甘草酸

復方小酸棗咀嚼片處方源于《深師方》，是由酸棗仁、川芎、茯苓、知母、桂心、生姜、炙甘草等7味藥材經(jīng)提取加工而成的中藥復方制劑，具有養(yǎng)血安神、清熱除煩的功效，用于治療虛煩不眠之證[1]。方中酸棗仁養(yǎng)肝血、安心神，為君藥；知母、茯苓寧心安神，為臣藥；川芎調(diào)暢氣機，疏達肝氣，為佐藥；甘草和中緩肝，為使藥；生姜和桂心可補肝腎不足，用于治療心血之虛[2-3]。目前，尚無文獻報道該制劑的質(zhì)量標準。為嚴格控制產(chǎn)品質(zhì)量，筆者以該制劑中白樺脂酸、白樺脂醇、茯苓酸和甘草酸作為指標性成分，進行含量測定研究，為其質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1100型高效液相色譜（HPLC）儀，包括G1322A排氣閥、G1311A泵、G1316A柱溫箱、35900E轉(zhuǎn)換器（美國Agilent公司）；Sedex 75型蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD，日本Shimadzu公司）；XP205型十萬分之一電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；BSA124S型萬分之一電子分析天平（德國Sartorius公司）；SKQ-2200型超聲波清洗儀（上海生析超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑

復方小酸棗咀嚼片（河北國金藥業(yè)有限責任公司，批號：20161101、20161102、20161103，規(guī)格：0.25 g/片）；白樺脂酸對照品（批號：140906，純度：≥98%）、白樺脂醇對照品（批號：141017，純度：≥98%）均購于上海順勃生物工程技術有限公司；甘草酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110731-201317，純度：92.6%）；茯苓酸對照品（成都瑞芬思生物科技有限公司，批號：29070-92-6，純度：98.0%）；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Grace Brava C18-BDS（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0～10 min，15%→25%A；10～20 min，25%A；20～25 min，25%→40%A；25～40 min，40%→60%A）；流速：1.0 mL/min；柱溫：25℃；進樣量：20 μL；漂移管溫度：100℃；載氣流速：2.9 L/min[4-7]。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液取待測成分對照品各適量，精密稱定，加50%乙醇溶液制成白樺脂酸、白樺脂醇、茯苓酸、甘草酸質(zhì)量濃度分別為890.0、405.6、656.0、336.0 μg/mL的單一對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液取樣品20片，研細，混勻，取約0.5 g，精確稱定，置于25 mL具塞錐形瓶中，加50%乙醇溶液20 mL，超聲（功率：100 W，頻率：56 kHz）提取30 min，加50%乙醇溶液定容，搖勻，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對照溶液按復方小酸棗咀嚼片處方和工藝分別制備缺酸棗仁、茯苓、甘草的單一陰性樣品，并按“2.2.2”項下方法制成單一陰性對照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗

取“2.2”項下單一對照品溶液、供試品溶液、單一陰性對照溶液各適量，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，詳見圖1。結(jié)果，理論板數(shù)以白樺脂酸、白樺脂醇、茯苓酸、甘草酸峰計均≥10 000；保留時間分別為22.6、25.1、11.6、19.2 min；分離度＞2.0，各成分基線分離良好。

2.4 線性關系考察

精密量取“2.2.1”項下單一對照品溶液各適量，加50%乙醇溶液稀釋，制成白樺脂酸質(zhì)量濃度分別為44.50、89.00、267.0、356.0、445.0、890.0 μg/mL，白樺脂醇質(zhì)量濃度分別為20.28、40.56、121.7、162.2、202.8、405.6 μg/mL，茯苓酸質(zhì)量濃度分別為20.50、41.00、82.00、164.0、328.0、656.0 μg/mL，甘草酸質(zhì)量濃度分別為10.50、21.00、42.00、84.00、168.0、336.0 μg/mL的系列單一對照品溶液。精密量取上述系列單一對照品溶液各20 μL，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以待測成分質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸。回歸方程與線性范圍見表1。

2.5 精密度試驗

取“2.2.1”項下單一對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，白樺脂酸、白樺脂醇、茯苓酸、甘草酸峰面積的RSD分別為0.20%、0.18%、0.26%、0.16%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

表1 回歸方程與線性范圍（n＝6）Tab 1 Regression equations and liner ranges（n＝6）

取“2.2.2”項下供試品溶液（批號：20161101）適量，分別于室溫下放置0、2、5、10、24 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，白樺脂酸、白樺脂醇、茯苓酸、甘草酸峰面積的RSD分別為2.31%、2.58%、1.37%、2.74%（n＝5），表明供試品溶液室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.7 重復性試驗

精密稱取同一批樣品（批號：20161101）適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，白樺脂酸、白樺脂醇、茯苓酸、甘草酸峰面積的RSD分別為2.23%、2.61%、2.42%、1.38%（n＝6），表明本方法重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗

取已知含量樣品（批號：20161101）適量，每份1 g，共6份，分別加入一定質(zhì)量的待測成分對照品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結(jié)果見表2。

2.9 樣品含量測定

取3批樣品各適量，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量，結(jié)果見表3。

表2 加樣回收率試驗結(jié)果（n＝6）Tab 2 Results of recovery tests（n＝6）

表3 樣品含量測定結(jié)果（n＝3，mg/g）Tab 3 Results of contents determination of samples（n＝3，mg/g）

3 討論

本試驗比較了不同提取溶劑和不同超聲時間的提取效率。結(jié)果顯示，采用50%乙醇溶液進行超聲提取效率優(yōu)于其他溶劑；同時，超聲提取30 min時待測成分峰面積最大。因此，本試驗選擇50%乙醇溶液作提取溶劑，超聲提取30 min制備供試品溶液。

中藥復方制劑所含有效成分較為復雜，在測定含量的情況下較易發(fā)生干擾。本課題組參考文獻[8-14]，經(jīng)多次優(yōu)化確定待測成分。白樺脂酸、白樺脂醇均屬于皂苷類成分，茯苓酸、甘草酸均屬于三萜類成分，上述4種成分由于結(jié)構(gòu)特征在HPLC紫外檢測器上響應值較低，并且相似成分較多，易引起基線漂移。而ELSD屬于質(zhì)量通用型檢測器，只要有物質(zhì)就有響應，特別適合于在紫外無吸收或有末端吸收的化學成分的檢測。因此，本試驗選擇HPLC-ELSD法測定該制劑中有效成分的含量。

綜上所述，本方法操作簡便，精密度、穩(wěn)定性、重復性較好，可用于復方小酸棗咀嚼片中4種指標性成分含量的同時測定。

[1] 王燾.外臺秘要[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1955：92.

[2] 丹波康賴（日）.醫(yī)心方[M].王大鵬，樊友平，校.上海：上?？茖W技術出版社，1998：546-547.

[3] 吳巧敏，趙藝初，韓藝凡，等.基于古今醫(yī)家論著對酸棗仁湯中“酸棗仁”實質(zhì)的思考[J].遼寧中醫(yī)雜志，2016，43（2）：262-264.

[4] 張留記，徐貞貞，屠萬倩.HPLC-ELSD同時測定益心血脂康膠囊中4種皂苷類活性成分[J].中國實驗方劑學雜志，2016，22（11）：89-92.

[5] 陳婷，劉群，莫灼康.HPLC同時測定冬蟲夏草中腺苷、蟲草素和麥角甾醇[J].中國實驗方劑學雜志，2013，19（6）：161-163.

[6] 李玉娟，畢開順.RP-HPLC測定酸棗仁湯中芒果苷和甘草酸的含量[J].中成藥，2104，26（10）：801-804.

[7] 李春英，張曉軍.高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法同時測定四君子丸中的5種有效成分[J].光譜，2010，28（1）：64-67.

[8] 陳香玲，陳紅軍.高效液相色譜法同時測定八珍益母膠囊中10種活性成分含量[J].中南藥學，2016，14（3）：306-309.

[9] 姜瑩.白樺脂酸的研究進展及其應用前景[J].黑龍江生態(tài)工程職業(yè)學院學報，2010，23（4）：32-33.

[10] 涂艷艷.HPLC-DAD-ELSD測定酸棗仁分散片中4種成分含量[J].中國實驗方劑學雜志，2012，18（22）：152-155.

[11] 曹相蘭，周雯，謝憲斌.HPLC-DAD法同時測定酸棗仁皂苷中酸棗仁皂苷A、B和白樺脂酸、白樺脂醇[J].中成藥，2015，37（5）：1013-1016.

[12] 李莉，葉曉川，宋小英.UPLC-DAD-ELSD切換波長法同時測定復方酸棗仁顆粒中8種成分的含量[J].藥物分析雜志，2016，36（10）：1722-1728.

[13] 張巧月，楊浩天，史賀.HPLC-MS法同時測定酸棗仁中9種成分[J].中草藥，2015，46（1）：123-127.

[14] 李云靜，何忠梅.HPLC法同時測定杜仲補天素片中6種成分的含量[J].中國藥房，2017，28（3）：401-404.

Simultaneous Determination of 4 Active Components in Compound Xiaosuanzao Chewable Tablets by HPLC-ELSD

ZHANG Lifeng，LIU Canfang，ZHANG Dongping，CHEN Ya，WEI Ru，CHU Yan（College of Pharmacy，Xingtai Medical College，Hebei Xingtai 054000，China）

OBJECTIVE：To establish the method for the content determination of 4 active components in Compound xiaosuanzao chewable tablets.METHODS：HPLC-ELSD method was adopted.The determination was performed on a Grace Brava C18-BDS column with mobile phase consisted of acetonitrile-water（gradient elution）at the flow rate of 1.0 mL/min.The column temperature was 25℃，and sample size was 20 μL.The drift tube temperature is 100℃，and the carrier gas flow rate is 2.9 L/min.RESULTS：The linear ranges of betulic acid，betulinol，pachymic acid and glycyrrhizic acid were 44.50-890.0 μg/mL（r＝0.999 3），20.28-405.6 μg/mL（r＝0.999 7），20.50-656.0 μg/mL（r＝0.999 7）and 10.50-336.0 μg/mL（r＝0.999 6），respectively.RSDs of precision，stability and reproducibility were all lower than 3.0%.The recoveries were 99.44%-101.12%（RSD＝0.57%，n＝6），99.41%-100.39%（RSD＝0.34%，n＝6），99.31%-100.46%（RSD＝0.51%，n＝6），98.96%-101.19%（RSD＝0.84%，n＝6），respectively.CONCLUSIONS：The method is simple，precise，stable and reproducible，and can be used for simultaneous determination of 4 active components in Compound xiaosuanzao chewable tablets.

HPLC-ELSD；Compound xiaosuanzao chewable tablets；Betulic acid；Betulinol；Pachymic acid；Glycyrrhizic acid

R927.2

A

1001-0408（2017）30-4275-03

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.30.26

河北省高等學?？茖W研究項目（No.ZC2016121）

＊副教授，碩士。研究方向：藥物的研發(fā)及教學。E-mail：1214467005@qq.com

2017-02-20

2017-04-07）

（編輯：張靜）