近紅外漫反射光譜法結(jié)合PLS法快速測定紅景天藥材中水分和紅景天苷的含量Δ

目的：建立快速測定紅景天藥材中水分和紅景天苷含量的方法。方法：采用烘干法測定藥材中水分含量（作為參考值）；采用高效液相色譜法測定藥材中紅景天苷含量（作為參考值）。采用近紅外漫反射光譜（NIR）分析技術(shù)結(jié)合偏最小二乘法（PLS）建立預(yù)測藥材中水分和紅景天苷含量的定量模型：根據(jù)參考值，采集83批藥材樣品，分別以二階導(dǎo)數(shù)法聯(lián)合Savitsky Golay濾波法、一階導(dǎo)數(shù)法聯(lián)合Norris Derivative濾波法預(yù)處理光譜，藥材樣品中水分和紅景天苷含量預(yù)測最佳波段分別為7 343.60～6 865.34、5 183.72～4 890.59 cm－1和7 050.47～4 327.48 cm－1。結(jié)果：藥材樣品中紅景天苷含量測定方法學(xué)考察符合要求。水分和紅景天苷定量模型的校正集相關(guān)系數(shù)分別為0.968 9、0.920 3，校正均方差分別為0.273 0、0.085 0；驗證集的相關(guān)系數(shù)分別為0.977 1、0.930 0，驗證均方差分別為0.222 0、0.075 5。結(jié)論：該方法快速、準(zhǔn)確、簡便、無污染，可用于紅景天藥材中水分和紅景天苷含量的快速測定。

近紅外漫反射光譜技術(shù)；紅景天；水分；紅景天苷；偏最小二乘法

紅景天為景天科珍稀植物大花紅景天Rhodiolae crenulata（Hook.f.et Thoms.）H.Ohba的干燥根和根莖，素有“高原人參”“北極玫瑰”之稱，具有補氣清肺、益智養(yǎng)心、收澀止血、消腫散瘀之功效[1]。現(xiàn)代藥理研究表明，紅景天苷是其主要的活性成分，具有抗腫瘤、抗氧化、抗骨質(zhì)疏松、保護心腦血管、保護肝腎等多種藥理作用[2-5]。然而，目前市售紅景天藥材因其品種、產(chǎn)地、貯藏年限等差異，其紅景天苷含量存在顯著差異，如長鞭紅景天幾乎不含紅景天苷[6]。同時，紅景天藥材中富含多糖類成分，含水量過高時極易生霉、蟲蛀變質(zhì)，使其有效成分含量降低，影響臨床療效。2015年版《中國藥典》（一部）紅景天項下明確規(guī)定，紅景天苷含量不低于0.50%，水分不超過12.0%。藥典收載的測定方法雖然準(zhǔn)確可靠，但存在操作煩瑣、耗時較長、消耗大量溶劑等不足之處。因此，建立一種簡單、快速、準(zhǔn)確的同步測定紅景天藥材中水分和紅景天苷含量的新方法是一項亟待解決的重要任務(wù)。

近年來，隨著計算機和化學(xué)計量學(xué)軟件的發(fā)展，近紅外漫反射光譜（Near infrared reflectance spectroscopy，NIR）分析技術(shù)可實現(xiàn)對樣品的簡單快速、準(zhǔn)確高效、無損、無污染含量檢測，且綠色環(huán)保，現(xiàn)已廣泛用于中藥材品種、產(chǎn)地、真?zhèn)?、加工炮制等定性判別和有效成分定量分析等領(lǐng)域[7-11]。目前，僅見少量文獻對紅景天藥材的品種進行定性判別[12]；尚未見研究紅景天藥材中水分和紅景天苷含量的NIR定量分析。為此，本研究以烘干法測定水分，以高效液相色譜法（HPLC）測定紅景天苷含量，作為參考值，采用NIR技術(shù)結(jié)合偏最小二乘法（Partial least squares，PLS）建立了快速測定紅景天藥材中水分和紅景天苷含量的定量模型，以期為紅景天藥材的質(zhì)量評價提供參考。

1 材料

1.1 儀器

AntarisⅡ型傅里葉變換NIR儀，包括InGaAs檢測器、標(biāo)準(zhǔn)石英杯、RESULTTM光譜采集軟件和TQ Analyst 9.1分析軟件（美國Thermo Scientific公司）；Alliance 2695型HPLC儀，包括四元梯度泵、二極管陣列檢測器、真空脫氣機、自動進樣器、柱溫箱，EmpowerⅡ色譜工作站（美國Waters公司）；KQ-5200DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Milli-Q型超純水制備儀（美國Millipore公司）；FW80型高速萬能粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）；DH-101-0型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（天津市中環(huán)實驗電爐有限公司）；BT125D型電子分析天平（德國Sartorius公司）；22331型高速離心機（德國Eppendorf公司）。

1.2 試劑

紅景天苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110818-201206，純度：99.8%）；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

1.3 藥材

83批紅景天藥材分別購自四川、西藏、安徽等地藥材市場（見表1），由中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所李化副研究員鑒定為真品。藥材自然晾干，粉碎，過40目篩，自封袋密封保存于防潮柜中。

表1 紅景天藥材來源Tab 1 Sources of R.Crenulatae

2 方法與結(jié)果

2.1 水分含量（參考值）測定

參照2015年版《中國藥典》（四部）“通則0832”項下的水分測定法中第二法“烘干法”[13]對紅景天藥材樣品中的水分含量進行測定，測得83批藥材樣品的水分含量在4.09%～8.57%范圍內(nèi)，詳見表2。

表2 藥材樣品中水分和紅景天苷含量測定結(jié)果（n＝3）Tab 2 Results of content determination of moisture and salidroside in samples（n＝3）

2.2 紅景天苷含量（參考值）測定

2.2.1色譜條件色譜柱：Diamonsil C1（8250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水（15∶85，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：275 nm；柱溫：30℃；進樣量：10 μL。色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram

2.2.2 對照品溶液的制備精密稱取紅景天苷對照品適量，加甲醇制成紅景天苷質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備取藥材樣品粉末約0.5 g，精密稱定，置于25 mL具塞錐形瓶中，精密加甲醇10 mL，

密塞，稱定質(zhì)量，超聲（功率：100 W，頻率：40 kHz）處理30 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，放置30 min，取上清液2 mL，置于離心管中，以離心半徑7.2 cm、10 000 r/min離心10 min，取上清液，即得。2.2.4方法學(xué)考察按相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進行方法學(xué)考察，結(jié)果，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗中紅景天苷峰面積的RSD均＜3%，表明儀器精密度、溶液穩(wěn)定性、方法重復(fù)性均較好。

2.2.5 樣品含量測定取83批藥材樣品各適量，分別按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量，結(jié)果見表2。

2.3 NIR定量模型建立與驗證

2.3.1 NIR的采集取藥材樣品粉末約5 g，置于石英樣品杯中，混合均勻，等力壓平（樣品厚度及緊密度力求保持一致），采用積分球漫反射系統(tǒng)，以空氣為參比，扣除背景采集NIR。采集條件：分辨率為16 cm－1，掃描范圍為10 000～4 000 cm－1，NIR掃描累積次數(shù)64次，單次掃描時間為0.5 s，溫度為25～30℃，相對濕度為20%～25%。83批藥材樣品的近紅外原始光譜疊加圖見圖2。

圖2 83批藥材樣品的近紅外原始光譜疊加圖Fig 2 Superposed near-infrared spectra of 83 batches of samples

2.3.2 校正集和驗證集樣品的選擇將表2中藥材樣品水分和紅景天苷含量分布情況，輸入TQ Analyst 9.1分析軟件中，剔除與參考值偏差較大的樣本，分別剔除了1個和4個異常點；再選取3/4的樣本作為校正集，1/4的剩余樣本作為驗證集，且驗證集含量范圍處于校正集含量范圍之內(nèi)[14]，詳見表3。

表3 校正集和驗證集藥材樣品中指標(biāo)成分的含量范圍Tab 3 Distribution of the index content components of samples in calibration and validation set

2.3.3 光譜預(yù)處理方法的選擇以多元散射校正法（MSC）、標(biāo)準(zhǔn)歸一化法（SNV）、一階導(dǎo)數(shù)法（FD）、二階導(dǎo)數(shù)法（SD）、Savitsky Golay（SG）濾波法、Norris Derivative（ND）濾波法等方法預(yù)處理光譜得不同校正集內(nèi)部交叉驗證相關(guān)系數(shù)（R）、校正均方差（RMSECV），詳見表4。

表4 不同光譜預(yù)處理方法對定量模型性能的影響Tab 4 Effects of different pretreatment methods onthe performance of quantitative model

運用TQ Analyst 9.1分析軟件對表4數(shù)據(jù)進行處理，結(jié)合PLS法建立NIR定量分析模型。選擇R、RMSECV為評價指標(biāo)，綜合評價不同模型的準(zhǔn)確性與適用性。其中，RMSECV越小，代表模型的預(yù)測精度越高；R越接近1，表示模型的預(yù)測準(zhǔn)確性越高。結(jié)果表明，分別以SD+SG（7，3）和FD+ND（5，5）預(yù)處理光譜后，水分和紅景天苷定量模型效果最好，可以消除多重光譜偏差，對導(dǎo)數(shù)光譜進行微調(diào)處理，NIR見圖3。

圖3 預(yù)處理后的近紅外光譜Fig 3 Near-infrared spectra after pretreatment

2.3.4 建模波段的選擇建模波段區(qū)間要求包含樣品的大量信息，同時要避免冗余信息，降低噪聲干擾。分別采用SD+SG（7，3）和FD+ND（5，5）對不同的波段進行手動優(yōu)化比較，通過TQ Analyst 9.1分析軟件得到水分和紅景天苷含量預(yù)測最佳波段分別為7 343.60～6 865.34、5 183.72～4 890.59 cm－1和7 050.47～4 327.48 cm－1，詳見表5。

2.3.5 主成分?jǐn)?shù)的選擇主成分?jǐn)?shù)的選擇是否得當(dāng)直接關(guān)系到所建定量模型的性能，故需要對主成分?jǐn)?shù)進行篩選。采用留一交叉驗證法考察主成分?jǐn)?shù)對RMSECV的影響。結(jié)果表明，當(dāng)PLS因子數(shù)分別為6、8時，水分和紅景天苷含量的RMSECV最小，分別為0.335、0.107，即為最佳建模主成分?jǐn)?shù)。

2.3.6 定量模型的建立與驗證在最佳光譜預(yù)處理、建模波段及主成分?jǐn)?shù)優(yōu)化的基礎(chǔ)上，運用TQ Analyst 9.1分析軟件，采用PLS法分別建立水分和紅景天苷的定量模型。模型評價結(jié)果見表6，預(yù)測值與參考值的相關(guān)性見圖4。由表6（表中“RMSEP”為外部驗證均方差）和圖4可知，紅景天藥材中水分和紅景天苷含量NIR預(yù)測值與參考值具有良好的相關(guān)性，表明所建模型穩(wěn)定可靠，可用于待測指標(biāo)成分含量的快速測定。水分和紅景天苷含量的預(yù)測值與參考值的偏差圖（見圖5）顯示，所建定量模型的預(yù)測偏差分別小于0.6%、0.2%。

表5 不同波段對定量模型性能的影響Tab 5 Effects of different spectral ranges on the performance of quantitative model

表6 模型評價結(jié)果Tab 6 Results of model evaluation

圖4 預(yù)測值與參考值的相關(guān)性Fig 4 Correlation between predicted value and refer ence value

本試驗考察了自然疏松與壓實兩種裝樣方式對NIR的影響，發(fā)現(xiàn)兩種方式下所得樣品光譜圖基本一致，故采用常規(guī)的壓實方式進行紅景天藥材NIR的采集。

本研究利用TQ Analyst 9.1分析軟件，采用NIR技術(shù)結(jié)合PLS法建立了紅景天藥材中水分和紅景天苷的定量模型，結(jié)果表明，該模型專屬性好，準(zhǔn)確性高，可同時實現(xiàn)對其所含水分和紅景天苷含量的快速測定，且與常規(guī)的烘干法和HPLC法相比具有高效、無損、綠色、經(jīng)

3 討論

A.水分；B.紅景天苷A.moisture；B.salidroside

濟等特點，能滿足工業(yè)化生產(chǎn)過程中對大量樣品化學(xué)信息快速、批量檢測的要求。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)所測83批市售紅景天藥材的水分合格率為100%，紅景天苷合格率為70%。

建立NIR定量模型必須選用大量有代表性的樣品。有研究表明，不同產(chǎn)地、海拔、野生或栽培的紅景天藥材中紅景天苷含量差異較大[15-16]。本試驗樣品主要來源于西藏和四川產(chǎn)區(qū)，其NIR信息僅能反映這兩大產(chǎn)區(qū)紅景天藥材的樣品特征，為提高NIR模型的普適性，在后期研究中需要收集其他產(chǎn)區(qū)的藥材樣品，使其更具有代表性，并不斷提升所建NIR模型預(yù)測的準(zhǔn)確性，以擴大其應(yīng)用范圍。

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Rapid Determination of Moisture and Salidroside in Rhodiolae crenulatae by NIR Combined with PLS Algorithm

MOU Qianqian1，2，HE Jingxia1，2，ZHANG Jianqi3，YANG Bin1，LI Xiaofang2，LIU Jiangdi1，TANG Yan1，LI Hua1（1.State Key Laboratory Breeding Base of Genuine Regional Herbs，Institute of Chinese Materia Medica，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，China；2.College of Pharmacy，Chengdu University of TCM，Chengdu 611137，China；3.School of Food and Bio-engineering，Xihua University，Chengdu 610039，China）

OBJECTIVE：To develop a method for rapid determination of moisture and salidroside in Rhodiolae crenulatae.METHODS：The content of moisture was determined by the methods of oven drying（as reference value）；the content of salidroside was determined by HPLC（as reference value）.Near infrared spectroscopy（NIR）combined with partial least squares（PLS）algorithm were adopted to establish quantitative model for the contents of moisture and salidroside.According to reference value，83 samples were collected for preprocessing spectra by Savitsky Golay with second derivative and Norris Derivative with first derivative.The optimal spectrum range of moisture and salidroside were 7 343.60-6 865.34，5 183.72-4 890.59 cm－1and 7 050.47-4 327.48 cm－1，respectively.RESULTS：The content determination methodology of salidroside was in line with the requirement.The correlation coefficients of calibration for moisture and salidroside were 0.968 9 and 0.920 3，and the root mean square errors of calibration were 0.273 0 and 0.085 0，respectively.The correlation coefficients of predication were 0.977 1 and 0.930 0，and the root mean square errors of prediction were 0.222 0 and 0.075 5，respectively.CONCLUSIONS：The method is proved to be simple，rapid，non-destructive and accurate，which can be used for the rapid determination of moisture and salidroside in R.crenulatae．

Near infrared spectroscopy；Rhodiolae crenulatae；Moisture；Salidroside；PLS

牟倩倩1，2＊，賀敬霞1，2，張建琪3，楊濱1，李小芳2，劉江弟1，唐艷1，李化1#（1.中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所道地藥材國家重點實驗室培育基地，北京100700；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，成都611137；3.西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，成都610039）

R927

A

1001-0408（2017）30-4260-05

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.30.22

中醫(yī)藥行業(yè)科研專項項目（No.國中醫(yī)藥科技發(fā)〔2014〕10號）

＊碩士研究生。研究方向：中藥新制劑、新劑型、新技術(shù)。E-mail：qqmou22@163.com

#通信作者：副研究員，博士。研究方向：中藥及其復(fù)方制劑的質(zhì)量評價與藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。E-mail：lihua621@hotmail.com

2016-11-26

2017-04-09）

（編輯：張靜）