卞智慧，于瑞蓮，魏思敏，蔣文，邵佳蔚，喻振，許金國，呂高虹（南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南京210023）

蟬花、蛹蟲草和冬蟲夏草藥材中脂肪酸含量的比較研究Δ

卞智慧＊，于瑞蓮#，魏思敏，蔣文，邵佳蔚，喻振，許金國，呂高虹（南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南京210023）

目的：建立同時測定蟬花、蛹蟲草和冬蟲夏草藥材中脂肪酸含量的方法，并比較上述藥材中脂肪酸含量的差異。方法：采用氣相色譜-質(zhì)譜法。色譜條件：色譜柱為TG-5MS毛細(xì)管柱，載氣為氮?dú)?，流速?.2 mL/min，進(jìn)樣口溫度為290℃，不分流進(jìn)樣，開閥時間為1 min，進(jìn)樣量為1μL；質(zhì)譜條件：離子源為電噴霧電離源，離子源溫度/傳輸線溫度為280℃，色譜柱初始溫度為80℃（程序升溫），電離電壓為70 eV，溶劑延遲時間為5 min，掃描質(zhì)量范圍為m/z 30～400。結(jié)果：十四烷酸、十五烷酸、軟脂酸、棕櫚油酸、十七碳酸、十七碳烯酸、十八烷酸、油酸甲酯、亞油酸、花生酸、花生一烯酸、花生二烯酸、二十碳三烯酸、二十一碳酸、山萮酸、二十三碳酸、木焦油酸檢測質(zhì)量濃度線性范圍分別為1.400～44.520μg/mL（r＝0.999 8）、2.091～93.721μg/mL（r＝0.999 7）、3.146～85.856μg/mL（r＝0.998 2）、1.664～61.444μg/mL（r＝0.998 7）、1.773～64.983μg/mL（r＝0.999 5）、1.781～68.421μg/mL（r＝0.999 7）、1.706～55.606μg/mL（r＝0.999 8）、1.439～47.989μg/mL（r＝0.999 6）、1.738～66.908μg/mL（r＝0.999 6）、2.086～94.206μg/mL（r＝0.999 5）、1.356～44.966μg/mL（r＝0.999 4）、1.444～56.814μg/mL（r＝0.999 7）、1.375～52.335μg/mL（r＝0.999 8）、1.512～60.312μg/mL（r＝0.999 5）、1.450～59.760μg/mL（r＝0.999 7）、1.427～58.757μg/mL（r＝0.999 1）、1.269～58.109μg/mL（r＝0.999 3）；定量限≤1 764.71 ng/mL，檢測限≤529.42 ng/mL；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD＜2.0%；加樣回收率為84.87%～108.93%（RSD為0.19%～2.23%，n＝6）。蟬花、蛹蟲草和冬蟲夏草藥材中分別含有17、16、16種脂肪酸，上述藥材中不飽和脂肪酸含量均高于飽和脂肪酸含量；其中人工栽培蟬花藥材樣品中各種脂肪酸含量大多高于其他藥材樣品。結(jié)論：該方法操作簡單，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性較好，可用于蟬花、蛹蟲草和冬蟲夏草藥材中脂肪酸含量的同時測定；從脂肪酸含量角度講，上述3種藥材中人工栽培蟬花藥材品質(zhì)較優(yōu)。

蟬花；蛹蟲草；冬蟲夏草；脂肪酸；氣相色譜-質(zhì)譜法

蟬花Isaria cicadae、蛹蟲草Cordyceps militaris和冬蟲夏草C.sinensis同屬麥角菌科蟲草類中藥材。蟬花是我國傳統(tǒng)的一種名貴藥材，又名蟬草、蟬茸和胡蟬等，其藥用部位是子座及寄主昆蟲的尸體（菌核）[1]，野外采摘時，去掉表面泥土，曬干研成粉末即可藥用。蟬花在我國主要分布于云南、江蘇、浙江、福建、四川等省區(qū)，也見于南亞、歐洲、北美等地[2]，作為古籍中記載的唯一可以替代冬蟲夏草的藥材，有著較高的藥用價值和廣闊的市場前景[3]。蟬花含有腺苷、蟲草酸、脂肪酸、麥角甾醇等有效成分[4-5]。脂肪酸是部分已知蟲草類中藥材中的重要活性成分之一，根據(jù)其碳?xì)渲麈溕咸細(xì)滏I飽和與否可以分為三類，即飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸、多不飽和脂肪酸[6-7]。飽和脂肪酸包括軟脂酸、硬脂酸、花生酸等，不飽和脂肪酸包括油酸、亞油酸、亞麻酸等。

目前，對脂肪酸的分析方法主要有氣相色譜-火焰離子化檢測法、氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）等。GC-MS法具有快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛用于藥物分析、油脂化學(xué)成分分析等方面[8-9]。本試驗(yàn)建立GC-MS法同時測定蟬花、蛹蟲草、冬蟲夏草藥材中十四烷酸（C14.0）、十五烷酸（C15.0）、軟脂酸（C16.0）、棕櫚油酸（C16.1）、十七碳酸（C17.0）、十七碳烯酸（C17.1）、十八烷酸（C18.0）、油酸甲酯（C18.1N9C）、亞油酸（C18.2N6C）、花生酸（C20.0）、花生一烯酸（C20.1）、花生二烯酸（C20.2）、二十碳三烯酸（C20.3N6）、二十一碳酸（C21.0）、山萮酸（C22.0）、二十三碳酸（C23.0）、木焦油酸（C24.0）的含量，并對上述藥材中脂肪酸含量的差異進(jìn)行比較，以期為蟲草類中藥材的質(zhì)量控制提供技術(shù)支持[10]。

1 材料

1.1 儀器

1310 ISQ型GC-MS儀（美國Thermo Finniga公司）；RE-200型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；AG135型精密電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。

1.2 試劑

脂肪酸甲酯混合對照品（批號：CDAA-251019M，純度：＞99%）、十九烷酸甲酯對照品（批號：S2257B21589，純度：＞99%）均購自美國Nu-Chek公司；甲醇為色譜純，正己烷、氯仿、鹽酸均為分析純，水為純化水。

1.3 藥材

人工栽培蟬花藥材由南京中醫(yī)藥大學(xué)于瑞蓮副教授提供；野生蟬花藥材、蛹蟲草藥材、冬蟲夏草藥材購自南京文德大藥房，均經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)于瑞蓮副教授鑒定為真品。

2 方法與結(jié)果

2.1 試驗(yàn)條件與系統(tǒng)適用性考察

2.1.1色譜條件色譜柱：TG-5MS毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；載氣：氮?dú)?；流速?.2 mL/min；進(jìn)樣口溫度：290℃；不分流進(jìn)樣；開閥時間：1 min；進(jìn)樣體積：1μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件離子源：電噴霧電離源；離子源溫度/傳輸線溫度：280℃；色譜柱溫度：初始溫度80℃，程序升溫（80℃保持1 min，以10℃/min的速率升溫至200℃；以5℃/min的速率升溫至250℃；以2℃/min的速率升溫至270℃，保持3 min）；電離電壓：70 eV；溶劑延遲時間：5 min；掃描質(zhì)量范圍：m/z 30～400。

在上述試驗(yàn)條件下，理論板數(shù)以C17.0峰計(jì)＞5 000；各待測峰之間分離良好，詳見圖1。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液取脂肪酸甲酯混合對照品25 mg，一次性加正己烷溶解制成脂肪酸甲酯質(zhì)量濃度為500μg/mL的混合對照品母液，凍存；精密量取上述混合對照品母液2 mL，置于10 mL量瓶中，加正己烷溶解并定容，制成脂肪酸甲酯質(zhì)量濃度為100μg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液取藥材樣品適量，60℃烘干，粉碎，過60目篩，取樣品粗粉80～100 mg，置于15 mL離心管中，加5%鹽酸溶液-甲醇（1∶1，V/V）2 mL、氯仿-甲醇3 mL、十九烷酸甲酯對照品溶液（內(nèi)標(biāo)液，10μg/mL）100μL，置于85℃水浴鍋中水浴加熱1 h；加熱完成后，待溫度降至室溫，再加正己烷1 mL，振蕩萃取2 min，靜置1 h；取上清液100μL，置于1 mL量瓶中，加正己烷定容；經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，4℃下密封貯藏，即得。

2.3 線性關(guān)系考察

分別精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對照品母液適量，置于10 mL量瓶中，加正己烷稀釋，制成脂肪酸甲酯質(zhì)量濃度分別為10、50、100、300、500μg/mL的系列混合對照品溶液，均加入“2.2.2”項(xiàng)下內(nèi)標(biāo)液100μL。精密量取上述系列混合對照品溶液各1 μL，按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測定，記錄離子信號相對強(qiáng)度。以脂肪酸甲酯質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)、離子信號相對強(qiáng)度（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸?；貧w方程與線性范圍見表1。

2.4 定量限與檢測限考察

分別精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對照品溶液適量，倍比稀釋，并按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測定，當(dāng)信噪比為10∶1時，得定量限；當(dāng)信噪比為3∶1時，得檢測限，詳見表1。

圖1 提取離子流圖Fig 1 Chromatograms of extraction ion flow

2.5 精密度試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄離子信號相對強(qiáng)度。結(jié)果，各脂肪酸甲酯成分與內(nèi)標(biāo)離子信號相對強(qiáng)度比值的RSD均＜2.0%（n＝6），表明儀器精密度良好。

表1 回歸方程、線性范圍與定量限、檢測限Tab 1 Regression equations，linear ranges，limits ofquantification and limits of detection

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下蛹蟲草藥材供試品溶液適量，分別于室溫下放置0、1、2、4、6、8 h時按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測定，記錄離子信號相對強(qiáng)度。結(jié)果，各脂肪酸甲酯成分與內(nèi)標(biāo)離子信號相對強(qiáng)度比值的RSD均＜2.0%（n＝6），表明供試品溶液室溫放置8 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一批蛹蟲草藥材樣品適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測定，記錄離子信號相對強(qiáng)度。結(jié)果，各脂肪酸甲酯成分與內(nèi)標(biāo)離子信號相對強(qiáng)度比值的RSD均＜2.0%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取蛹蟲草藥材樣品粉末6份，每份50 mg，分別加入一定質(zhì)量的混合對照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測定，記錄離子信號相對強(qiáng)度并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表2。

續(xù)表2Continued Tab 2

2.9 藥材樣品中脂肪酸含量的測定

取藥材樣品各適量，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測定，記錄離子信號相對強(qiáng)度并計(jì)算樣品含量，結(jié)果見表3（表中“0”為低于定量限）。

由表3可知，各蟲草類中藥材中C18.1N9C的含量最高，其次為C18.2N6C。蟬花藥材中含有17種脂肪酸，蛹蟲草和冬蟲夏草藥材中各含有16種脂肪酸，其中，C20.3N6為蟬花藥材所特有，可以用于與蛹蟲草和冬蟲夏草進(jìn)行區(qū)分。

表3 藥材樣品中脂肪酸含量的測定結(jié)果（n＝3，g/kg）Tab 3 Results of content determination of fatty acid in samples（n＝3，g/kg）

3 討論

本試驗(yàn)優(yōu)選出的GC-MS法，對幾種蟲草類中藥材及其不同部位中的脂肪酸（測定脂肪酸甲酯換算得脂肪酸）含量進(jìn)行了定量分析，并進(jìn)行了方法學(xué)考察。結(jié)果顯示，17種脂肪酸的加樣回收率為84.87%～108.93%，RSD為0.19%～2.23%（n＝6），檢測質(zhì)量濃度線性范圍為1.400～94.206 ng/mL（r＞0.999）。

GC-MS分析表明，蟬花、蛹蟲草和冬蟲夏草藥材中所含的脂肪酸均以不飽和脂肪酸（油酸和亞油酸）為主。人工栽培蟬花藥材中各脂肪酸（尤其是油酸和亞油酸）含量較野生品及蛹蟲草、冬蟲夏草藥材高。

綜上所述，本方法操作簡單，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性較好，可用于蟬花、蛹蟲草和冬蟲夏草藥材中的脂肪酸含量的同時測定；從脂肪酸含量角度講，上述3種藥材中人工栽培蟬花藥材品質(zhì)較優(yōu)。

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Comparative Study on the Contents of Fatty Acids in Isaria cicadae，Cordyceps militaris and Cordyceps sinensis

BIAN Zhihui，YU Ruilian，WEI Simin，JIANG Wen，SHAO Jiawei，YU Zhen，XU Jinguo，LYU Gaohong（College of Pharmacy，Nanjing University of TCM，Nanjing 210023，China）

OBJECTIVE：To establish a method for simultaneous determination of fatty acids in Isaria cicadae，Cordyceps militaris and C.sinensis，and to compare the difference of the contents of fatty acids among above medicinal herbs.METHODS：GCMS method was adopted.Chromatographic condition：the determination was performed on TG-5MS gas phase capillary column with carrier gas of nitrogen at the flow rate of 1.2 mL/min.The inlet temperature was 290℃by splitless sampling；valve opening time was 1 min，and volume of sample was 1μL.Mass spectrometry condition：the ion source is an electrospray ionization source.The temperatures of ion source and transmission line were 280℃，the initial temperature of the chromatographic column was 80℃（gradient elution），ionization voltage was 70 eV.Solvent delay time was 5 min，and scan mass range was m/z 30-400.RESULTS：The linear ranges of tetradecanoic acid，pentadecanoic acid，palmitic acid，palmitoleic acid，heptadecanoic acid，heptadecenoic acid，docosahexaenoic acid，methyl oleate，linoleic acid，arachidonic acid，eicosenoic acid，diolefinic acid，eicosatrienoic acid，heneicosanoic acid，behenic acid，tricosanoic acid，lignoceric acid were 1.400-44.520μg/mL（r＝0.999 8），2.091-93.721μg/mL（r＝0.999 7），3.146-85.856μg/mL（r＝0.998 2），1.664-61.444μg/mL（r＝0.998 7），1.773-64.983μg/mL（r＝0.999 5），1.781-68.421μg/mL（r＝0.999 7），1.706-55.606μg/mL（r＝0.999 8），1.439-47.989μg/mL（r＝0.999 6），1.738-66.908μg/mL（r＝0.999 6），2.086-94.206μg/mL（r＝0.999 5），1.356-44.966μg/mL（r＝0.999 4），1.444-56.814μg/mL（r＝0.999 7），1.375-52.335μg/mL（r＝0.999 8），1.512-60.312μg/mL（r＝0.999 5），1.450-59.760μg/mL（r＝0.999 7），1.427-58.757μg/mL（r＝0.999 1），1.269-58.109μg/mL（r＝0.999 3），respectively.The limit of quantitation was no more than 1 764.71μg/mL，and the limit of detection was no more than 529.42μg/mL.RSDs of precision，stability and reproducibility tests were all lower than 2.0%.The recoveries were 84.87%-108.93%（RSD ranged 0.19%-2.23%，n＝6）.There were 17 fatty acids in C.militaris，16 fatty acids in I.cicadae and 16 fatty acids in C.sinensis.The contents of unsaturated fatty acids in above medicinal herbs were higher than that of saturated fatty acids.The content of fatty acids in artificial cultivated I.cicadae was mostly higher than other medicinal herbs.COCLUSIONS：The method is simple，accurate，stable and reproducible.It can be used for simultaneous determination of fatty acids in I.cicadae，C.militaris and C.sinensis.Above 3 kinds of medicinal materials.From the perspective of fatty acid content，the quality of artificial cultivated I.cicadae is best.

Isaria cicadae；Cordyceps militaris；Cordyceps sinensis；Fatty acid；GC-MS

R932

A

1001-0408（2017）30-4252-05

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.30.20

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.81673918）；江蘇省普通高校專業(yè)學(xué)位研究生創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目（No.SJZZ15-0122）；江蘇省科技項(xiàng)目（No.BY2015008-03）；江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程項(xiàng)目（No.2011ZYX6-006）

＊碩士研究生。研究方向：中藥新藥開發(fā)。E-mail：343793122@qq.com。

#通信作者：副教授，碩士生導(dǎo)師，博士。研究方向：中藥新藥開發(fā)。E-mail：yu3ruilian@126.com

2016-12-03

2017-02-05）

（編輯：張靜）