許 健，劉 雁，邢亞群，余美玲#(.蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院藥劑科，安徽 蚌埠 33000； .蚌埠醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院藥劑科，安徽 蚌埠 33000)

*藥師。研究方向：藥動(dòng)學(xué)。E-mail：xujian15855789032@163.com

#通信作者：主管藥師。研究方向：藥動(dòng)學(xué)。E-mail：yumeiling409@sohu.com

超高效液相色譜法測定大鼠血漿中多西他賽的質(zhì)量濃度Δ

許 健1*，劉 雁1，邢亞群2，余美玲1#
(1.蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院藥劑科，安徽 蚌埠 233000； 2.蚌埠醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院藥劑科，安徽 蚌埠 233000)

目的：建立超高效液相色譜法測定大鼠血漿中多西他賽的質(zhì)量濃度，為多西他賽的藥動(dòng)學(xué)研究提供基礎(chǔ)。方法：采用甲醇沉淀法處理大鼠血漿；采用超高效液相色譜法測定多西他賽的質(zhì)量濃度，色譜柱為Hypersll BDS C18柱(2.1 mm×100 mm，3 μm)，檢測波長為230 nm，流動(dòng)相為超純水-甲醇(V∶V=45 ∶55)，流速為0.4 ml/min，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為10 μl。結(jié)果：多西他賽和內(nèi)標(biāo)紫杉醇的保留時(shí)間分別為10.45和7.83 min。多西他賽的線性回歸方程為Y=0.101 8X+0.002 8(R2=0.999 6)，其在0.05～10.00 μg/ml的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，定量下限(S/N=10)為0.05 μg/ml。儀器日內(nèi)和日間精密度均<15%，多西他賽的提取回收率>85%，且在24 h內(nèi)[-80 ℃和室溫(25 ℃)條件下]較穩(wěn)定。結(jié)論：本方法簡便、快捷、靈敏，可用于大鼠血漿中多西他賽質(zhì)量濃度的測定。

超高效液相色譜； 多西他賽； 大鼠

多西他賽為細(xì)胞毒類抗腫瘤藥，最早于紫杉中提取，目前已成為多種化療方案的重要組成部分，單用或與其他藥物聯(lián)合用于非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、胃癌、食管癌、卵巢癌、鼻咽癌、膀胱癌和肝癌等惡性腫瘤的治療，取得了良好的療效，可延緩患者病情，延長其生存時(shí)間[1-5]。高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)廣泛應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域，能夠快速、準(zhǔn)確地對生物樣本中的藥物含量進(jìn)行定量分析，成為了研究藥動(dòng)學(xué)的重要方法。文獻(xiàn)報(bào)道，多西他賽的定量測定多采用HPLC法，方便、靈敏，但分析時(shí)間較長，用于大樣本的測定有一定的局限性，而超高效液相色譜法(ultra performance liquid chromatography，UPLC)在保證準(zhǔn)確和便捷的同時(shí)可縮短分析時(shí)間[6-8]。本研究采用UPLC法測定大鼠血漿中多西他賽的質(zhì)量濃度。

1 材料

1.1儀器

Agilent-1290超高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；AB135-S型十萬分之一電子天平(德國METTLER TOLEDO)；XW-80A微型渦旋混合儀(上海滬西分析儀器廠有限公司)；KQ-300B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī)(長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；LC-4016型低速離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)；DW-86L388A立式超低溫保存箱(青島海爾特種電器有限公司)；BCD-225CHC冰箱(合肥美菱股份有限公司)；Milli-Q Gradient A10超純水系統(tǒng)(密理博貿(mào)易有限公司)。

1.2藥品與試劑

多西他賽標(biāo)準(zhǔn)品(中國食品藥品檢定研究院，純度99.3%，批號(hào)：100666—200401)；多西他賽注射液(齊魯制藥有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國藥準(zhǔn)字H20041129，批號(hào)：5030021TB，規(guī)格：40 mg)；紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品(中國食品藥品檢定研究院，純度99.6%，批號(hào)：100382—201102)；甲醇為色譜純(上海星可高純?nèi)軇┯邢薰?；水為超純水(Milli-Q超純水機(jī)制備)。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康SD大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量180～220 g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[許可證：SCXK(皖)2016-003]。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件

色譜柱為Hypersll BDS C18柱(2.1 mm×100 mm，3 μm)，檢測波長為230 nm，流動(dòng)相為超純水-甲醇(V∶V=45 ∶55)，流速為0.4 ml/min，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為10 μl。

2.2溶液的制備

分別精密稱取適量多西他賽、紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品，依次制成100 μg/ml的多西他賽單一成分儲(chǔ)備液和紫杉醇單一成分儲(chǔ)備液，置于4 ℃冰箱，備用。

2.3樣品預(yù)處理

取空白血漿(來自6只健康SD大鼠)100 μl置于1.5 ml EP管(預(yù)先經(jīng)過肝素化處理)中，加入紫杉醇儲(chǔ)備液(100 μg/ml)15 μl作為內(nèi)標(biāo)參考物，加入甲醇300 μl，渦旋振蕩3 min，高速離心(14 000 r/min)10 min，精密吸取上清液200 μl，過微孔濾膜(0.22 μm)，待用。

2.4專屬性考察

分別取大鼠空白血漿、空白血漿+多西他賽對照品、空白血漿+紫杉醇對照品、空白血漿+多西他賽+紫杉醇及大鼠尾靜脈注射多西他賽后3 min的血漿，按照“2.3”項(xiàng)下血樣處理方式處理后再按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，見圖1。

A.空白血漿；B.空白血漿+多西他賽；C.空白血漿+紫杉醇；D.空白血漿+多西他賽+紫杉醇；E.尾靜脈注射多西他賽后的血漿A.blank plasma; B.blank plasma+docetaxel; C.blank plasma+paclitaxel; D.blank plasma+docetaxel+ paclitaxel; E.plasma of tail intravenous injection of docetaxel圖1 UPLC圖Fig 1 UPLC chromatography

2.5標(biāo)準(zhǔn)曲線及定量下限

精密吸取“2.2”項(xiàng)下的多西他賽儲(chǔ)備液，用甲醇稀釋并加至空白血漿中，制成質(zhì)量濃度分別為10、5、2、1、0.5、0.2、0.1和0.05 μg/ml的多西他賽工作液，并按照“2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行處理，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以大鼠血漿中多西他賽質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X，mg/L)，多西他賽與內(nèi)標(biāo)紫杉醇的峰面積比為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y=0.101 8X+0.002 8，R2=0.999 6，見圖2。結(jié)果表明，多西他賽在0.05～10.00 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，大鼠血漿中多西他賽的定量下限(S/N=10)為0.05 μg/ml。

圖2 多西他賽的線性回歸方程Fig 2 Equation of linear regression docetaxel

2.6精密度試驗(yàn)

精密量取多西他賽儲(chǔ)備液加入至空白血漿，制成低、中和高質(zhì)量濃度(0.1、0.5和10.0 μg/ml)的樣品，分別按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析。每個(gè)質(zhì)量濃度平行制備5份樣品，連續(xù)測定3 d，記錄下多西他賽和紫杉醇的峰面積，從而進(jìn)行日內(nèi)和日間精密度驗(yàn)證。結(jié)果表明，日內(nèi)精密度低、中和高質(zhì)量濃度的RSD分別為11.70%、5.46%和3.43%，日間精密度低、中和高質(zhì)量濃度的RSD分別為13.97%、6.71%和4.41%，均<15%，滿足生物樣本的分析要求，見表1。

表1 精密度考察結(jié)果(n=5)

2.7提取回收率試驗(yàn)

大鼠空白血漿中加入不同質(zhì)量濃度的多西他賽儲(chǔ)備液，制成質(zhì)量濃度為0.1、0.5和10.0 μg/ml的生物樣本，每個(gè)質(zhì)量濃度6份，按“2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行樣品預(yù)處理，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算峰面積C1。另取大鼠空白血漿100 μl加甲醇300 μl沉淀蛋白后，再加入適量的多西他賽儲(chǔ)備液，制成質(zhì)量濃度為0.1、0.5和10.0 μg/ml的生物樣本，每個(gè)質(zhì)量濃度6份，按“2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行樣品預(yù)處理，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算峰面積C2。多西他賽提取回收率=C1/C2×100%，見表2。

2.8穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

精密量取多西他賽儲(chǔ)備液加入空白血漿中，制成低、中和高質(zhì)量濃度(0.1、0.5和10.0 μg/ml)的樣品，每個(gè)質(zhì)量濃度平行制備5份，于-80 ℃放置、反復(fù)凍融3次或室溫(25 ℃)放置24 h后，分別按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析。結(jié)果表明，低、中和高質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品在-80 ℃反復(fù)凍融和室溫放置24 h情況下均比較穩(wěn)定，見表3—4。

3 討論

目前已有成熟的HPLC方法用于多西他賽體內(nèi)試驗(yàn)的定量分析[9]。但由于HPLC的分離度較低、分析時(shí)間長，且定量下限高，不適用于多樣本、高精度和重復(fù)性的血藥濃度測定分析。與HPLC相比，UPLC具有分離度高、分析速度快和靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)[10]。故本研究采用UPLC法進(jìn)行測定。

表2 提取回收率結(jié)果(n=6)

表3 凍融穩(wěn)定性結(jié)果(n=5)

表4 室溫穩(wěn)定性結(jié)果(n=5)

有文獻(xiàn)推薦將乙腈和水(加入磷酸改善峰形)作為多西他賽定量分析的流動(dòng)相[11-12]。但預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甲醇-水(V∶V=55 ∶45)可使多西他賽與內(nèi)標(biāo)紫杉醇的峰完全分離，且無拖尾現(xiàn)象，不僅節(jié)省了經(jīng)費(fèi)(甲醇的價(jià)格顯著低于乙腈)，還簡化了實(shí)驗(yàn)過程(流動(dòng)相加入磷酸后需要抽濾)。

色譜分析中常用的定量方法有內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法。外標(biāo)法操作簡單，但誤差較大；內(nèi)標(biāo)法通過加入內(nèi)標(biāo)物質(zhì)能夠校準(zhǔn)和降低由于樣品處理不平行、色譜條件波動(dòng)等引起的系統(tǒng)誤差。內(nèi)標(biāo)的選擇標(biāo)準(zhǔn)一般為與被分析藥物具有類似的物理化學(xué)性質(zhì)、色譜行為并且色譜峰能夠相對分離等，一般推薦選用被分析藥物的同系物。也有采用地西泮作為內(nèi)標(biāo)的文獻(xiàn)報(bào)道[13]。但在本研究色譜條件下，地西泮的保留時(shí)間與多西他賽相近，無法完全分離，且色譜峰具有拖尾現(xiàn)象，故最終選取紫杉醇作為多西他賽的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)。

血漿樣品的處理主要有液液萃取、固相萃取和有機(jī)溶劑沉淀蛋白等3種方法[14]。由于實(shí)驗(yàn)條件所限，排除固相萃取，又通過預(yù)實(shí)驗(yàn)比較了叔丁基甲醚液液萃取和甲醇蛋白沉淀的回收率[15]，發(fā)現(xiàn)甲醇沉淀蛋白可獲得更高的回收率，且操作簡單，故本研究采用甲醇沉淀法處理血漿樣品。

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ContentDeterminationofQualityofDocetaxelinRatPlasmabyUPLCΔ

XU Jian1, LIU Yan1, XING Yaqun2, YU Meiling1
(1.Dept.of Pharmacy, the First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College, Anhui Bengbu 233000, China; 2.Dept.of Pharmacy, the Second Affiliated Hospital of Bengbu Medical College, Anhui Bengbu 233000, China)

OBJECTIVE: To establish establish the content of quality of docetaxel in rat plasma by UPLC, so as to provide basis for pharmacokinetic study of docetaxel. METHODS: The blood samples of rats were treated by methanol precipitation, the content of quality of docetaxel was determined by UPLC. The column was Hypersll BDS C18(2.1 mm×100 mm, 3 μm), the detection wavelength was 230 nm, the mobile phase was ultra-pure water-methyl alcohol (V∶V=45 ∶55) with the flow rate of 0.4 ml/min, column temperature of 30 ℃ and sample size of 10 μl. RESULTS: The retention time of docetaxel and internal standard paclitaxel was 10.45 min and 7.83 min, respectively; the standard curve line of docetaxel wasY=0.101 8X+0.002 8(R2=0.999 6), the linear relationship was good at 0.05-10.00 μg/ml; the lower limit of quantification of docetaxel in rat plasma (S/N=10) was 0.05 μg/ml; the intra-day and inter-day precision were less than 15%; the recovery rate was higher than 85%, and the sample was stable at -80 ℃ and room temperature (25 ℃) for 24 hours. CONCLUSIONS: This method is simple, accurate and flexible, which can be used for content determination of quality of docetaxel in rat plasma.

UPLC; Docetaxel; Rats

安徽省教育廳一般項(xiàng)目(No.KJ2015B067by)

R979.1

A

1672-2124(2017)10-1319-03

DOI 10.14009/j.issn.1672-2124.2017.10.008

2017-06-13)