文麗君++尤曉光

摘 要：以固相合成法合成VEGF125-136小肽及隨機(jī)小肽，并用ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其活性；同時(shí)用CY5.5標(biāo)記VEGF125-136小肽，并進(jìn)行細(xì)胞熒光實(shí)驗(yàn)，從而為進(jìn)一步的靶向?qū)Ρ葎┑暮铣杉坝跋裨\斷提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：VEGF125-136小肽 CY5.5 固相合成 靶向

中圖分類(lèi)號(hào)：R73 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1672-3791（2017）09（b）-0199-04

VEGF是最主要的血管生成促進(jìn)因子，在人類(lèi)的多種腫瘤中均有過(guò)度表達(dá)[1]，其中VEGF165促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及瘤區(qū)血管生成作用最大[2]。細(xì)胞膜上的VEGF受體2（vascular endothelial growth factor receptor-2，簡(jiǎn)稱(chēng)VEGFR 2）高表達(dá)于腫瘤新生的血管內(nèi)皮細(xì)胞及多種惡性腫瘤細(xì)胞表面膜上（如鼻咽癌、喉癌、肺癌、胃癌、肝癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、膀胱癌、腎上腺皮質(zhì)腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、淋巴瘤、白血病等），而在其它細(xì)胞中表達(dá)極低或不表達(dá)。因此，VEGFR2（KDR/flk-1）成為腫瘤靶向成像研究的重要靶點(diǎn)之一。

VEGF外顯子6編碼的12肽QKRKRKKSRYKS，經(jīng)研究證實(shí)，與KDR結(jié)合的能力最強(qiáng)，由于此小肽體內(nèi)無(wú)生物學(xué)活性，具有良好的組織滲透性、代謝穩(wěn)定性及可耐受多種修飾等特點(diǎn)[4]，可與VEGF165競(jìng)爭(zhēng)腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞及多種腫瘤細(xì)胞膜上VEGFR-2受體結(jié)合位點(diǎn)，故小肽QKRKRKKSRYKS有可能取代VEGF分子用于腫瘤的靶向顯像研究。本文以固相合成法合成實(shí)驗(yàn)組VEGF125-136小肽QS及對(duì)照組隨機(jī)小肽QK，并用ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其活性，同時(shí)用CY5.5標(biāo)記VEGF125-136小肽，并進(jìn)行細(xì)胞外靶向?qū)嶒?yàn)，從而為進(jìn)一步的靶向?qū)Ρ葎┑暮铣杉坝跋裨\斷提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

Wang樹(shù)脂（吉爾生化上海有限公司）；Fmoc保護(hù)氨基酸單體（吉爾生化上海有限公司）；1-羥基苯并三氮唑（HO Bt）、2-（1H一苯并三氮唑1，1，3，3一四甲基脲六氟磷酸鹽（HBTU）、N，N一二異丙基乙胺（DIPEA）、三氟乙酸（TFA）、三異丙基硅烷（TIS）、N，N一二甲基甲酰胺（DMF）、二氯甲烷（DCM）（阿拉燈試劑）哌啶、無(wú)水乙醚、甲醇（西亞試劑）；VEGFR一抗（abcam）；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的VEGFR二抗（abcam）；顯色液（Novobio）；96孔酶標(biāo)板（spl）DMEM高糖培養(yǎng)基（Sigma）；胎牛血清（Sigma）；BEL-7402細(xì)胞（ATCC）；細(xì)胞培養(yǎng)瓶（Sigma）；細(xì)胞爬片（北京凱樂(lè)思科技有限公司）；相合成器（杭州歐爾柏維科技有限公司）；離心機(jī)（湖南恒諾儀器設(shè)備有限公司）；Agilent1100-Bruker Esquire HCT型液相色譜儀（美國(guó)布魯克公司）；X Series（X7）型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（美國(guó)賽默飛世爾公司）；酶標(biāo)儀（美國(guó)biotek酶標(biāo)儀）；CO2恒溫培養(yǎng)箱（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；inVia Reflex型共聚焦熒光顯微鏡（Renishaw公司）。

1.2 VEGF125-136小肽及隨機(jī)小肽合成

VEGF125-136小肽（QS：Gln-Lys-Arg-Lys-Arg-Lys-Lys-Ser-Arg-Tyr-Lys-Ser）的合成：選取Fmoc-ser（tbu）-wang resin的樹(shù)脂1.0g，放入固相合成器內(nèi)，加入10mL DFM，通氮?dú)鈹嚢?h，抽濾；加入20%哌啶5mL，通氮?dú)鈹嚢?min，去除樹(shù)脂上的FMOC保護(hù)基團(tuán)，抽濾后分別加入DCM與DFM 5mL清洗，Kaiser試劑檢測(cè)氨基托保護(hù)情況，所用樹(shù)脂變藍(lán)或黑色表明托保護(hù)充分；接第二個(gè)氨基酸：稱(chēng)取C端第二個(gè)氨基酸FMOC-lys（boc）-OH，檢測(cè)氨基托保護(hù)，抽濾后加入縮合劑HBTU 0.660g

（1.74mmol，379.24g/mol）和HOBt 0.235g（1.74 mmol，135.13g/mol），溶于10mL DMF中，再在該溶液中加入DIEA 0.449g（3.48mmol，129g/mol），通氮?dú)鈹嚢?h，抽干Kaiser試劑檢測(cè)，所有樹(shù)脂變?yōu)榘咨虻S色表明反應(yīng)完全，如還有樹(shù)脂為黑色或藍(lán)色，表面反應(yīng)不充分，重復(fù)接第二個(gè)氨基酸，直至所有樹(shù)脂變?yōu)榘咨虻S色為止；接后續(xù)氨基酸：Fmoc-Tyr-OH，F(xiàn)moc-Arg-OH，F(xiàn)moc-Ser-OH，F(xiàn)moc-Lys-OH，F(xiàn)moc-Lys-OH，F(xiàn)moc-Arg-OH，F(xiàn)moc-Lys-OH，F(xiàn)moc-Arg-OH，F(xiàn)moc-Lys-OH，F(xiàn)moc-Gln-OH，抽干Kaiser試劑檢測(cè)，所有樹(shù)脂變?yōu)榘咨虻S色表明反應(yīng)完全；DFM清洗三次，加入甲醇5min2次，抽干備用；取0.2g樹(shù)脂TFA96.5%+triisobutylsilane1.0%+water2.5%2mL反應(yīng)5h，取燒瓶加入乙醚真空抽濾沉淀，HPLC純化，離心后質(zhì)譜檢測(cè)。

同樣方法合成隨機(jī)小肽（QK：Gln-Lys-Tyr-Ser-Lys-Gln-Lys-Ser-Ser-Gln-Lys-Lys）。

1.3 VEGF125-136小肽QS及隨機(jī)小肽QK活性檢測(cè)

取微球小肽QS：Gln-Lys-Arg-Lys-Arg-Lys-Lys-Ser-Arg-Tyr-Lys-Ser及QK：Gln-Lys-Tyr-Ser-Lys-Gln-Lys-Ser-Ser-Gln-Lys-Lys各100mg入多肽合成管內(nèi)。用1%BSA 2mL封閉，室溫2h；抽濾后，加入VEGFR一抗20ug/200mL，37℃，孵育2h；加入PBS 5mL，多次抽濾后，加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的VEGFR2二抗20ug/200mL，37℃水育1h；多次抽濾后，加入PBS 5mL，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組移液器各取100uL入96孔酶標(biāo)板內(nèi)；每孔加底物A與B液各50uL，37℃水育15min（避光）；50ul終止液終止反應(yīng)；于450nm處測(cè)定OD值，判斷陰陽(yáng)性結(jié)果。endprint

1.4 cy5.5-VEGF125-136小肽及cy5.5-隨機(jī)小肽合成

將103mgVEGF小肽（QKRKRKKSRYKS）與125mg隨機(jī)小肽（QKYSKQKKSSQKQK）放入固相合成器中標(biāo)記A與B，錫紙包好，piperidine氨基脫保護(hù)3次；于每管內(nèi)加CY5.5-NHS25mg，DIPEA500uL，室溫反應(yīng)3h（400轉(zhuǎn)/分）；真空抽濾，DCM與DMF清洗3次；TFA96.5%+triisobutylsilane1.0%+water2.5%5mL反應(yīng)5h；取燒瓶A與B加入乙醚真空抽濾沉淀VEGF小肽與隨機(jī)小肽。；HPLC洗脫純化：0～10min，20～40%乙腈，10～25min，40%～98%乙腈；LS/MS的洗脫條件80%乙腈，0～1min，干燥。

1.5 cy5.5-VEGF125-136小肽及cy5.5-隨機(jī)小肽體外靶向?qū)嶒?yàn)

1.5.1免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)BEL-7402肝癌細(xì)胞VEGFR2受體表達(dá)情況

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的BEL-7402肝癌細(xì)胞，0.25%胰酶消化后制備單層細(xì)胞爬片；PBS沖洗爬片2次，4%多聚甲醛室溫固定10～15min，吹干；PBS沖洗4次后加入0.1mmol/mL30uLFITC-VEGFR-2抗體，37℃避光溫育2h；PBS漂洗4次，DAPI（1∶2000）復(fù)染細(xì)胞核5～10min；PBS漂洗4次，在玻片上滴加一滴防熒光猝滅劑，蓋玻片封片，激光共聚焦顯微鏡觀察VEGFR-2受體表達(dá)情況。

1.5.2 細(xì)胞熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CY5.5-VEGF125-136體外靶向性能

制備BEL-7402細(xì)胞爬片同上，一組實(shí)驗(yàn)組、一組對(duì)照組；實(shí)驗(yàn)組加CY5.5-QS0.1mmol/mL30uL，對(duì)照組加CY5.5-QK30uL，避光37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)2h；所有爬片PBS漂洗4次，DAPI（1∶2000）復(fù)染細(xì)胞核5～10min；所有爬片PBS漂洗4次；在玻片上滴加一滴防熒光猝滅劑，蓋玻片封片；激光共聚焦顯微鏡觀察各組細(xì)胞熒光成像異同。

2 結(jié)果與討論

2.1 VEGF125-136 QS小肽QS及隨機(jī)小肽QK小肽質(zhì)譜分析

固相合成的VEGF125-136 QS小肽為白色粉末，測(cè)質(zhì)譜得其主峰（m/z：[M+3H]+）分子量為605.80，與VEGF125-136小肽理論分子量1815.87相符；固相合成的隨機(jī)小肽QK為白色粉末，測(cè)質(zhì)譜得其主峰（m/z：[M+3H]+）分子量為564.10，與隨機(jī)小肽QK小肽理論分子量1689.95相符，這說(shuō)明合成產(chǎn)物為目標(biāo)物。

2.2 VEGF125-136小肽及隨機(jī)小肽的活性檢測(cè)

本次采用的驗(yàn)證其活性的ELISA實(shí)驗(yàn)，與傳統(tǒng)的 ELISA實(shí)驗(yàn)不同，這也是本研究的創(chuàng)新之處。由于小肽在微球上，是樹(shù)脂小肽，無(wú)法進(jìn)行抗體的傳統(tǒng)96孔酶標(biāo)板包被，但以多肽合成管為反應(yīng)容器，每步反應(yīng)后濾液恰好可用抽濾從多肽合成管中吸出，而樹(shù)脂小肽被濾膜隔離留存在多肽合成管內(nèi)，進(jìn)行下一步反應(yīng)。本次ELISA實(shí)驗(yàn)，兩樣本獨(dú)立t檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組對(duì)照組吸光值差異有顯著性意義，實(shí)驗(yàn)組吸光值較對(duì)照組明顯增高，說(shuō)明合成的VEGF125-136小肽具備結(jié)合VEGFR2受體活性，這是用于后續(xù)靶向?qū)Ρ葎┖铣傻那疤崤c基礎(chǔ)（如表1）。

2.3 cy5.5-VEGF125-136小肽及cy5.5-隨機(jī)小肽質(zhì)譜分析

Cy5.5-QS經(jīng)HPLC分離純化、分析見(jiàn)其主峰單一明顯，雜質(zhì)少，保留時(shí)間15.35min。測(cè)質(zhì)譜得其主峰（m/z： [M+3H]+）分子量為720，與QS-Cy5.5小肽理論分子量2157.16相符；Cy5.5-QK經(jīng)HPLC分離純化、主峰保留時(shí)間10.025min。根據(jù)HPLC面積計(jì)算產(chǎn)物純度為70.25%，測(cè)質(zhì)譜得其主峰（m/z：[M+3H]+）分子量為690，與QK-Cy5.5小肽理論分子量2067.94相符。

2.4 BEL-7402 細(xì)胞體外靶向?qū)嶒?yàn)

細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示BEL-7402細(xì)胞膜表面有大量綠色熒光，VEGFR2受體陽(yáng)性（如圖1）。體外細(xì)胞熒光靶向?qū)嶒?yàn)顯示BEL-7402實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞膜有大量靶向紅色熒光物質(zhì)CY5.5-QS（如圖2），BEL-7402對(duì)照組未見(jiàn)明顯紅色熒光CY5.5-QK（如圖3）。細(xì)胞熒光實(shí)驗(yàn)表明CY5.5-VEGF125-136小肽體外可靶向BEL-7402細(xì)胞膜VEGFR2受體熒光顯像，CY5.5-QK隨機(jī)小肽無(wú)體外靶向成像作用。

3 結(jié)語(yǔ)

本文通過(guò)固相合成法成功合成VEGF125-136小肽及CY5.5-VEGF125-136小肽，并創(chuàng)新性的利用ELISA實(shí)驗(yàn)來(lái)檢驗(yàn)VEGF125-136小肽的活性，結(jié)果表明該小肽具備結(jié)合VEGFR2受體的活性，這是用于后續(xù)靶向?qū)Ρ葎┖铣傻那疤崤c基礎(chǔ)。同時(shí)細(xì)胞熒光實(shí)驗(yàn)表明CY5.5-VEGF125-136小肽能靶向BEL-7402細(xì)胞膜VEGFR2受體熒光顯像，這為進(jìn)一步的靶向?qū)Ρ葎┑暮铣杉坝跋裨\斷提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

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[2] Perroud HA，Rico MJ，Alasino CM，et al. Association between baseline VEGF/sVEGFR-2 and VEGF/TSP-1 ratios and response to metronomic chemotherapy using cyclophosphamide and celecoxib in patients with advanced breast cancer[J]. Indian J Cancer，2013，50（2）：115-121.endprint