鄭串，馬艷，潘連德

(上海海洋大學(xué) 省部共建水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306)

過氧乙酸與異噻唑啉酮合劑對黃絲藻藻華的抑制及南美白對蝦養(yǎng)殖安全性研究

鄭串，馬艷，潘連德

(上海海洋大學(xué) 省部共建水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306)

為尋找一種環(huán)保、高效、安全的抑藻產(chǎn)品，并保證用藥安全，利用過氧乙酸(PAA)和異噻唑啉酮(Isothiazolone)配伍對黃絲藻Tribonemasp.進(jìn)行了藻華抑制效果的研究，采用靜態(tài)生物毒性試驗(yàn)的方法，研究了配伍用藥對池塘中南美白對蝦仔蝦(0.043 5 g±0.000 8 g)和幼蝦(2.576 8 g±0.024 0 g)的毒性。結(jié)果表明：過氧乙酸和異噻唑啉酮配伍時具有協(xié)同作用，可以提高抑藻效果，過氧乙酸和異噻唑啉酮質(zhì)量濃度比為1.00 mg/L∶0.60 mg/L(配比5∶3)時除藻效果最優(yōu)，96 h時對黃絲藻的抑制率可達(dá)97.40%，協(xié)同指數(shù)為0.14，對黃絲藻超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)具有先誘導(dǎo)后抑制的效果，可使丙二醛(MDA)大量積累；過氧乙酸和異噻唑啉酮配伍對南美白對蝦仔蝦和幼蝦的安全質(zhì)量濃度比分別為0.21 mg/L∶0.12 mg/L和1.17 mg/L∶0.70 mg/L。研究表明，過氧乙酸與異噻唑啉酮配伍對池塘中的黃絲藻藻華具有良好的抑制效果，但在仔蝦養(yǎng)殖階段要謹(jǐn)慎使用，避免產(chǎn)生藥害。

過氧乙酸；異噻唑啉酮；黃絲藻藻華；南美白對蝦；抗氧化酶

近年來，隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖密度的提高和生活污水的大量排放，水體富營養(yǎng)化程度日益加劇，并由此引發(fā)了一系列生態(tài)環(huán)境問題[1]。如絲狀藻藻華大量暴發(fā)，其在稻田養(yǎng)蝦、種草養(yǎng)蟹、養(yǎng)魚池塘[2]和人工景觀[3]等水體均有發(fā)生。黃絲藻Tribonemasp.是形成絲狀藻藻華最常見的種類之一，在春、秋季大量繁殖，常因腐爛而影響水質(zhì)，從而限制了養(yǎng)殖對象的正常生長和活動，為養(yǎng)殖生產(chǎn)帶來了一定程度的困擾，特別在蝦蟹養(yǎng)殖中表現(xiàn)尤為突出[2,4]。目前，生產(chǎn)上常使用銅制劑來控制藻華，有研究指出，使用硫酸銅濃度達(dá)到2.40 mg/L時，才能有效抑殺黃絲藻[2]，在此過程中，不僅藥物用量大，而且對環(huán)境二次污染嚴(yán)重。因此，亟待開發(fā)出綠色環(huán)保高效的抑藻產(chǎn)品。

過氧乙酸(Peracetic acid，PAA)別名過醋酸、過氧化乙酸，是一種強(qiáng)氧化性有機(jī)酸[5-6]，具有易降解、無殘留、對水體不會造成二次污染的特點(diǎn)[7-8]。有研究指出，過氧乙酸對小球藻Chlorellavulgaris和黃絲藻均具有較好的抑殺效果[6,9]，有望開發(fā)成綠色的除藻劑，但在實(shí)際應(yīng)用過程中用藥量較大，易造成藥害。異噻唑啉酮(Isothiazolone)作為一種廣譜殺生劑，對細(xì)菌、真菌和藻類均有較強(qiáng)的殺滅能力，具有高效、低毒、在水中易降解等特點(diǎn)[10-11]。本研究中，利用過氧乙酸和異噻唑啉酮綠色環(huán)保的抑藻特性，控制和去除黃絲藻藻華，為提高抑藻效率，減少用藥量，研究了配伍用藥的抑藻效果；并為確保用藥安全，進(jìn)一步研究了配伍用藥對水體中兩種規(guī)格南美白對蝦Litopenaeusvannamei的毒性，以期在實(shí)現(xiàn)安全用藥的前提下，提高除藻效率，并為控制絲狀藻藻華藥物的選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1材料

試驗(yàn)用黃絲藻藻華和南美白對蝦均取自上海海洋大學(xué)濱海養(yǎng)殖基地的南美白對蝦養(yǎng)殖池塘。

過氧乙酸(15%)由索爾維有限公司提供；異噻唑啉酮(14%)購自上海三博水化學(xué)有限公司；丙酮(分析純)和碳酸鎂(分析純)均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、丙二醛(MDA)和考馬斯亮藍(lán)蛋白試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.2方法

1.2.1 培養(yǎng)條件 黃絲藻選取顏色鮮亮翠綠的藻絲體，分離純化后在光照培養(yǎng)箱中利用BG11培養(yǎng)基，在光照強(qiáng)度為2000 lx、光暗比為12 h∶12 h、溫度為22 ℃條件下充氣培養(yǎng)。從每組取0.50 g的黃絲藻藻絲體置于250 mL透明錐形瓶中，加入BG11培養(yǎng)基至250 mL進(jìn)行試驗(yàn)。

選取體表干凈、健康活力的南美白對蝦個體，在試驗(yàn)室中暫養(yǎng)備用，仔蝦和幼蝦的體質(zhì)量分別為(0.043 5±0.000 8)、(2.576 8±0.024 0) g。養(yǎng)殖用水取自上海海洋大學(xué)濱海養(yǎng)殖基地南美白對蝦養(yǎng)殖池塘，水溫為(22±1) ℃，pH為(7.40±0.10)，溶解氧為(5.00±0.30) mg/L，總氨氮為(0.03±0.01) mg/L。試驗(yàn)前2 d停食。從每組取相同規(guī)格的南美白對蝦20尾于25 cm×30 cm×30 cm的玻璃缸中進(jìn)行試驗(yàn),并加入黃絲藻藻華1.0 g以模仿池塘環(huán)境。

1.2.2 單一藥物對黃絲藻的抑制試驗(yàn) 根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，按等對數(shù)間距設(shè)定藥物的濃度梯度，每種藥物設(shè)7個濃度組和1個空白對照組，記為1～7組和對照組(表1)，每組設(shè)3個重復(fù)，試驗(yàn)周期為96 h，測定每組葉綠素a總量和藥物對黃絲藻的抑制率。

表1 兩種藥物的質(zhì)量濃度Tab.1 Test concentrations of two drugs

1.2.3 配伍用藥對黃絲藻的抑制試驗(yàn) 根據(jù)單一藥物抑制效果和預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)定過氧乙酸(1.40、1.20、1.00 mg/L)和異噻唑啉酮(0.60、0.50、0.40 mg/L)兩種藥物配伍濃度比例，并設(shè)置空白對照組，每組設(shè)3個重復(fù)，試驗(yàn)周期為96 h，測定每組葉綠素a總量、藥物對黃絲藻的抑制率和協(xié)同指數(shù)，確定最適配伍濃度。

1.2.4 配伍用藥對黃絲藻藻絲體抗氧化酶活性和脂質(zhì)過氧化程度的影響 通過定量分析黃絲藻藻絲體的SOD、CAT活性和MDA含量來評價抗氧化酶活性和脂質(zhì)過氧化程度。根據(jù)確定的最適藥物配伍濃度對黃絲藻藻絲體進(jìn)行脅迫，并設(shè)置空白對照組，每組設(shè)3個重復(fù)，試驗(yàn)周期為96 h，每隔24 h測定1次。

1.2.5 配伍用藥對南美白對蝦的毒性試驗(yàn) 根據(jù)確定的最適藥物配伍濃度及預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，按等對數(shù)間距設(shè)定過氧乙酸和異噻唑啉酮配伍濃度。其中，仔蝦毒性試驗(yàn)中，氧乙酸和異噻唑啉酮的6個配伍濃度(mg/L∶mg/L)分別為0.67∶0.40、1.00∶0.60、1.50∶0.90、2.25∶1.35、3.38∶2.03、5.07∶3.35；幼蝦毒性試驗(yàn)中，兩種藥物的6個配伍濃度(mg/L∶mg/L)分別為2.25∶1.35、3.38∶2.03、5.07∶3.05、7.61∶4.58、11.42∶6.87、17.12∶10.31。采用靜態(tài)生物毒性試驗(yàn)方法[12]分別對南美白對蝦仔蝦和幼蝦進(jìn)行毒性試驗(yàn)，并設(shè)置空白對照組，每組設(shè)3個重復(fù)，每24 h更換1次藥液，前24 h連續(xù)觀察對蝦的活動情況，試驗(yàn)過程中記錄24、48、72、96 h對蝦的死亡率，及時撈出死亡個體，死亡標(biāo)準(zhǔn)為玻璃棒輕觸蝦體腹部不產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)[13]。

1.2.6 抑制率及協(xié)同指數(shù)的測定與計算 采用葉綠素a總量評價對黃絲藻的抑制效果[14]，試驗(yàn)過程中用濾布對黃絲藻進(jìn)行過濾，離心后稱重，采用丙酮法測定葉綠素a含量[15]，以質(zhì)量濃度的對數(shù)(x)和抑制率的機(jī)率值(y)計算毒力回歸方程及半數(shù)有效濃度(EC50)[16]。黃絲藻藻絲體形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化通過顯微鏡進(jìn)行觀察。各指標(biāo)計算公式分別為

(1)

抑制率=(對照組葉綠素a總量-試驗(yàn)組葉綠素a總量)/對照組葉綠素a總量×100%,

(2)

協(xié)同指數(shù)SI=Ca/CA+Cb/CB。

(3)

其中:SI[10]為配伍用藥效果；Ca和Cb分別為藥物A和B配伍達(dá)到某一抑制率時藥物A和B 的濃度；CA和CB分別為藥物 A和B 單獨(dú)使用時達(dá)到相同抑制率時的濃度；SI>1時表示沒有協(xié)同效應(yīng),SI<1時表示有協(xié)同效應(yīng)，SI=1時表示兩者只有加和作用[17]。

1.2.7 SOD、CAT活性和MDA含量的測定 參照實(shí)驗(yàn)室已有的試驗(yàn)方法[2],每隔24 h取0.10 g黃絲藻藻絲體，加入預(yù)冷的磷酸緩沖溶液(pH 7.8)，在冰浴條件下，用超聲波細(xì)胞粉碎儀進(jìn)行破碎，在4 ℃下以8000 r/min 離心20 min，收集上清液，參照試劑盒說明書測定SOD、CAT活性和MDA含量，24 h內(nèi)測定完畢。

1.2.8 半數(shù)致死濃度和安全濃度的計算 采用寇氏法(Karber)[13]計算藥物對南美白對蝦的半數(shù)致死濃度(LC50)和安全濃度(SC)，計算公式為

LC50=Xm-d(∑P-0.5)，

(4)

(5)

其中：Xm為最大劑量的常用對數(shù)；d為相鄰劑量組比值的常用對數(shù)；P為死亡率；∑P為各組死亡率之和。

1.3數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用SPSS 20.0和Excel 2000軟件處理，并進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)，采用Duncan’s法進(jìn)行多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1藻絲體形態(tài)結(jié)構(gòu)變化

試驗(yàn)結(jié)束時，利用顯微鏡對試驗(yàn)組藻絲體進(jìn)行觀察，可以發(fā)現(xiàn)藻絲體的形態(tài)結(jié)構(gòu)均發(fā)生了較大的變化(圖1)，高濃度試驗(yàn)組錐形瓶底部均出現(xiàn)白色絮狀沉淀(圖2)。這說明兩種藥物對黃絲藻均有一定的抑制效果。由圖1可見，黃絲藻藻絲體細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)完整，均未遭到破壞，而經(jīng)藥物脅迫的試驗(yàn)組藻絲體葉綠素被破壞，帶狀結(jié)構(gòu)減少，細(xì)胞結(jié)構(gòu)出現(xiàn)自溶現(xiàn)象，葉綠體由綠變白，且配伍用藥對藻細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞最為嚴(yán)重，細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本消失。

注：A為空白對照組藻絲體；B為過氧乙酸(17.09 mg/L)試驗(yàn)組藻絲體；C為異噻唑啉酮(7.50 mg/L)試驗(yàn)組藻絲體；D為配伍比為(過氧乙酸∶異噻唑啉酮)1.00 mg/L∶0.60 mg/L的試驗(yàn)組藻絲體Note：A, the blank control group;B, the test group of peracetic acid(17.09 mg/L);C, the test group of isothiazolinone(7.50 mg/L);D, the test group of the ratio of peracetic acid to isothiazolinone=1.00 mg/L∶0.60 mg/L圖1 96 h后黃絲藻藻絲體顯微結(jié)構(gòu)圖(×40)Fig.1 Microscopic structure of alga Tribonema sp.exposed to the drugs for 96 h(×40)

注：A為過氧乙酸試驗(yàn)組藻絲體，1～7組濃度分別為1.50、2.25、3.38、5.06、7.06、11.39、17.09 mg/L；B為異噻唑啉酮試驗(yàn)組藻絲體，1～7組濃度分別為0.66、0.99、1.48、2.22、3.33、5.00、7.50 mg/LNote：A, the test group of peracetic acid,1-7, the concentrations of 1.50, 2.25, 3.38, 5.06, 7.06, 11.39 mg/L and 17.09 mg/L, respectively; B, the test group of isothiazolinone, 1-7, the concentrations of 0.66, 0.99, 1.48, 2.22, 3.33, 5.00 mg/L and 7.50 mg/L, respectively圖2 96 h后黃絲藻藻絲體外部形態(tài)圖Fig.2 External morphology of the Tribonema sp. exposed to the drugs for 96 h

2.2過氧乙酸對黃絲藻的抑制效果

由圖3可知:過氧乙酸對黃絲藻的抑制率與其濃度呈正相關(guān);當(dāng)過氧乙酸濃度達(dá)到3.38 mg/L時，其對黃絲藻的抑制率為57.5%，產(chǎn)生了一定的抑制效果，隨著過氧乙酸濃度的繼續(xù)升高，抑制效果越好；但當(dāng)濃度達(dá)到7.60 mg/L時，抑制率變化幅度變小，并趨于穩(wěn)定。通過毒力回歸方程(表2)，可計算出過氧乙酸對黃絲藻的半數(shù)有效濃度(EC50)為2.81 mg/L。

圖3 過氧乙酸對藻體的抑制效果Fig.3 Inhibitory effect of peracetic acid on alga Tribonema sp.

2.3異噻唑啉酮對黃絲藻的抑制效果

由圖4可知：異噻唑啉酮對黃絲藻具有明顯的抑制效果，隨著異噻唑啉酮濃度的升高，其對黃絲藻的抑制率也隨之升高；當(dāng)異噻唑啉酮濃度達(dá)到3.33 mg/L時，其對黃絲藻的抑制率達(dá)到82.5%，具有較好的抑藻效果，但隨著濃度的繼續(xù)升高，抑制率變化幅度不大;當(dāng)異噻唑啉酮濃度低于0.99 mg/L時，抑制率低于50%，抑藻效果不明顯。通過毒力回歸方程(表2)，可計算出異噻唑啉酮對黃絲藻的半數(shù)有效濃度(EC50)為1.20 mg/L。

圖4 異噻唑啉酮對藻體的抑制效果Fig.4 Inhibitory effect of isothiazolone on alga Tribonema sp.

表2 兩種藥物抑制黃絲藻的半數(shù)有效濃度Tab.2 The 50% effective concentration(EC50) of two drugs on alga Tribonema sp.

2.4過氧乙酸和異噻唑啉酮配伍用藥最適配比濃度的確定

由表3可知：過氧乙酸和異噻唑啉酮配伍后對黃絲藻表現(xiàn)出協(xié)同抑制效果，但在不同配伍濃度條件下，抑藻效果存在差異；當(dāng)過氧乙酸和異噻唑啉酮的配伍濃度為1.40 mg/L∶0.50 mg/L時，其對黃絲藻的抑制率為78.77%，顯著低于其他配伍濃度組(P<0.05)，協(xié)同指數(shù)為0.46，顯著高于其他配伍濃度組(P<0.05)；當(dāng)過氧乙酸和異噻唑啉酮的配伍濃度分別為1.40 mg/L∶0.60 mg/L、1.00 mg/L∶0.60 mg/L和1.20 mg/L∶0.50 mg/L時，對黃絲藻的抑制率較高，分別為96.94%、97.40%和94.28%，抑藻效果較好，同時，協(xié)同指數(shù)較低，分別為0.19、0.14和0.21，協(xié)同效果較好。綜合分析配伍后的抑藻效果、協(xié)同效果和藥物使用量，將過氧乙酸和異噻唑啉酮配伍濃度1.00 mg/L∶0.60 mg/L確定為抑藻的最適配比。

表3 過氧乙酸和異噻唑啉酮復(fù)配對黃絲藻的作用效果Tab.3 Effect of PAA and isothiazolone in combination on alga Tribonema sp.

注：同列中標(biāo)有不同小寫字母者表示組間有顯著性差異(P<0.05)，標(biāo)有相同小寫字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05)
Note:The means with different letters within the same column are significant differences at the 0.05 probability level, and the means with the same letters within the same column are not significant differences

2.5過氧乙酸和異噻唑啉酮配伍用藥對黃絲藻SOD、CAT活性和MDA含量的影響

在過氧乙酸和異噻唑啉酮最適配伍濃度1.00 mg/L∶0.60 mg/L脅迫下，測定了黃絲藻藻絲體的SOD、CAT活性和MDA含量。

2.5.1 配伍用藥對SOD活性的影響 由圖5可知：隨著脅迫時間的延長，試驗(yàn)組黃絲藻SOD活性呈先增加后降低趨勢，對照組變化趨勢與試驗(yàn)組相似，但變化幅度較小；配伍用藥脅迫48 h時，SOD活性升至最大，之后隨著脅迫時間的延長，SOD活性開始逐漸下降；脅迫72 h以上時，試驗(yàn)組SOD活性已低于對照組,并有持續(xù)下降的趨勢。

圖5 配伍用藥對黃絲藻SOD活性的影響Fig.5 Effect of compound drugs on the SOD activity

2.5.2 配伍用藥對CAT活性的影響 由圖6可知：隨著脅迫時間的延長，試驗(yàn)組黃絲藻CAT活性呈先增加后降低趨勢，對照組變化趨勢與試驗(yàn)組相似，但變化幅度較小，對照組黃絲藻在24 h時CAT活性升至最大；配伍用藥脅迫48 h時，試驗(yàn)組黃藻絲CAT活性升至最大，隨著脅迫時間的延長，CAT活性開始逐漸下降；脅迫96 h時，試驗(yàn)組CAT活性已低于對照組，并有持續(xù)下降的趨勢。

圖6 配伍用藥對黃絲藻CAT活性的影響Fig.6 Effect of compound drugs on the CAT activity

2.5.3 配伍用藥對MDA含量的影響 由圖7可知，隨著脅迫時間的延長，試驗(yàn)組黃絲藻MDA含量呈逐漸上升的趨勢，對照組MDA含量變化則不明顯。

圖7 配伍用藥對黃絲藻MDA含量的影響Fig.7 Effect of compound drugs on the MDA contents

2.6過氧乙酸和異噻唑啉酮配伍用藥對南美白對蝦的毒性影響

在不同配伍用藥濃度對仔蝦毒性試驗(yàn)中，通過前24 h的連續(xù)觀察發(fā)現(xiàn)，南美白對蝦仔蝦受脅迫時開始急躁狂游，最后沉底死亡。由表4可知，當(dāng)過氧乙酸和異噻唑啉酮以1.00 mg/L∶0.60 mg/L的濃度配伍時，脅迫24 h時仔蝦開始出現(xiàn)死亡，當(dāng)濃度配伍增加到3.38 mg/L∶2.03 mg/L時，脅迫48 h時仔蝦全部死亡。經(jīng)統(tǒng)計分析，過氧乙酸和異噻唑啉酮配伍用藥對仔蝦的24 h LC50、48 h LC50和安全濃度分別為1.86 mg/L∶1.11 mg/L、1.35 mg/L∶0.80 mg/L和0.21 mg/L∶0.12 mg/L。

由表5可知，在不同配伍用藥濃度對幼蝦的毒性試驗(yàn)中，當(dāng)過氧乙酸和異噻唑啉酮以3.38 mg/L∶2.03 mg/L的濃度配伍時，脅迫24 h時幼蝦開始出現(xiàn)死亡，當(dāng)濃度配伍增加到11.42 mg/L∶6.87 mg/L時，脅迫48 h時幼蝦全部死亡，經(jīng)統(tǒng)計分析，過氧乙酸和異噻唑啉酮配伍用藥對幼蝦的24 h LC50、48 h LC50和安全濃度分別為5.62 mg/L∶3.38 mg/L、4.97 mg/L∶2.99 mg/L和1.17 mg/L∶0.70 mg/L。

表4 過氧乙酸和異噻唑啉酮配伍對南美白對蝦仔蝦的毒性試驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Acute toxicity test of PAA and isothiazolone in combination on the post-larval Pacific white leg shrimp Litopenaeus vannamei

表5 異噻唑啉酮和過氧乙酸配伍對南美白對蝦幼蝦的毒性試驗(yàn)結(jié)果Tab.5 Acute toxicity test of PAA and isothiazolone in combination on the juvenile Pacific white leg shrimp Litopenaeus vannamei

3 討論

3.1過氧乙酸對黃絲藻的抑制作用

過氧乙酸作為一種強(qiáng)氧化性酸，既能表現(xiàn)出強(qiáng)氧化性又有極強(qiáng)的酸性。Axelesson等[18]研究表明，水體中氫離子達(dá)到一定濃度后對藻體內(nèi)部結(jié)構(gòu)會有直接的破壞作用。本試驗(yàn)結(jié)果表明，濃度為17.09 mg/L的過氧乙酸在96 h內(nèi)可破壞藻絲體內(nèi)部結(jié)構(gòu)。推測其抑藻機(jī)理可能是酸性作用的結(jié)果。李靜會等[19]研究表明，當(dāng)乙酸濃度達(dá)到26.87 mg/L時，可以有效治理藍(lán)藻水華，王愛卿等[20]研究指出，利用檸檬酸調(diào)節(jié)水體pH值可間接有效控制黃絲藻藻華,這可能與本試驗(yàn)中過氧乙酸的抑藻機(jī)理相似，均是利用酸性來抑制藻類生長。其作用機(jī)理存在兩種推測：其一，葉綠體內(nèi)pH值的降低，阻礙了卡爾文循環(huán)，抑制了藻體的光合作用，從而達(dá)到抑藻效果[21]；其二，碳酸酐酶活性受到酸性破壞，阻礙了CO2的濃縮機(jī)制，從而達(dá)到抑藻效果[22]。陳孝華等[2]研究表明，過氧乙酸對黃絲藻中的SOD、CAT和MDA具有低濃度誘導(dǎo)和高濃度抑制的效果。這與本試驗(yàn)結(jié)果相似，本試驗(yàn)中隨著脅迫時間的延長，過氧乙酸對SOD和CAT具有先促進(jìn)后抑制的效果。SOD和CAT在短時間內(nèi)活性增加以消除氧化脅迫，隨著時間的延長，藻絲體內(nèi)酶系統(tǒng)被破壞，SOD和CAT活性下降，MDA大量積累，達(dá)到抑藻的效果。 因此，推測過氧乙酸利用酸性和強(qiáng)氧化性起到了抑藻效果。

3.2異噻唑啉酮對黃絲藻的抑制作用

異噻唑啉酮作為一種親電子型殺生劑，對細(xì)胞膜和細(xì)胞壁的穿透性極強(qiáng)，能夠抑制細(xì)胞中電子的轉(zhuǎn)移，從而阻礙呼吸鏈中能量代謝，引起細(xì)胞死亡[20，23]。這與本試驗(yàn)結(jié)果一致，并未對細(xì)胞壁膜造成損傷。陳孝華等[2]研究表明，異噻唑啉酮對黃絲藻的96 h EC50為1.20 mg/L，48 h EC50為9.858 mg/L，這與本試驗(yàn)結(jié)果差異較大，這可能與試驗(yàn)設(shè)計和培養(yǎng)條件不同有關(guān)。異噻唑啉酮對球形棕囊藻Phaeoecystisglobosa的72 h EC50為0.54 mg/L[11]，對三角褐指藻Phaeodactylumtriconutum的96 h EC50為1.95 mg/L[24]，對于海水中生長的藻類如塔胞藻Pyramidomonassp.、青島大扁藻Platymonashegolandica、叉鞭金藻Dicrateriainornata和新月菱形藻Nitzschiaceaeclosteriun等在2.40 mg/L條件下的抑制效果較好[25]。雖然不同藻類對異噻唑啉酮的耐受性存在差異，但是異噻唑啉酮在較低濃度條件下就能對常見藻類產(chǎn)生明顯的抑制效果。由此可見，異噻唑啉酮是一種高效的抑藻藥物。

3.3過氧乙酸和異噻唑啉酮配伍用藥對黃絲藻的抑制作用

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，過氧乙酸和異噻唑啉酮配伍時會產(chǎn)生顯著的協(xié)同抑藻效果。江濤等[11]研究表明，利用新潔爾滅和異噻唑啉酮以1.3 mg/L∶0.3 mg/L配伍可有效殺滅球形棕囊藻，具有較強(qiáng)的協(xié)同抑藻效果的原因是異噻唑啉酮作為一種親電子型殺生劑可快速聚集到藻細(xì)胞膜上，產(chǎn)生穿透作用，使新潔爾滅快速進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生殺滅效果。洪愛華等[10，26]研究指出，利用碘伏和異噻唑啉酮以1.0 mg/L∶0.15 mg/L復(fù)配時，對球形棕囊藻具有較好的協(xié)同抑制效果，異噻唑啉酮可有效穿透藻細(xì)胞壁，協(xié)同碘伏增強(qiáng)抑藻效果。本試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)過氧乙酸和異噻唑啉酮的濃度配比為1.00 mg/L∶0.60 mg/L時，對黃絲藻的協(xié)同抑制效果較好?；趦煞N藥物的作用機(jī)理，推測當(dāng)兩種藥物配伍使用時，異噻唑啉酮對藻細(xì)胞的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)產(chǎn)生穿透作用，使過氧乙酸能順利進(jìn)入細(xì)胞膜內(nèi)，利用酸性和強(qiáng)氧化性直接破壞細(xì)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)和酶系統(tǒng)，從而加強(qiáng)了抑藻的效果。

3.4過氧乙酸和異噻唑啉酮配伍用藥對SOD、CAT和MDA的影響

在外界氧化因子的作用下，植物體內(nèi)可產(chǎn)生活性氧(ROS)，從而對其產(chǎn)生氧化傷害[2]，而植物體出于對自身的保護(hù)會誘導(dǎo)產(chǎn)生一系列抗氧化酶來清除過多的ROS。本研究中，隨著藥物脅迫時間的延長，SOD、CAT的活性均大幅提高，隨后又開始降低，可能是在藥物脅迫的短時間內(nèi)，誘導(dǎo)黃絲藻產(chǎn)生SOD和CAT以抵御產(chǎn)生的ROS，但隨著脅迫時間的延長，SOD和CAT活性下降至對照組水平以下，可能是黃絲藻在藥物作用下開始死亡的結(jié)果。陳孝華等[2]研究表明，黃絲藻在異噻唑啉酮的脅迫作用下，SOD和CAT活性均呈現(xiàn)出低濃度誘導(dǎo)、高濃度抑制的現(xiàn)象；陸長梅等[27]研究表明，水綿Spirogyrasp.在滲透壓變化和百草枯的脅迫作用下，SOD活性呈現(xiàn)出先升高后降低的變化，這些與本試驗(yàn)結(jié)果相似。MDA作為膜脂過氧化的重要產(chǎn)物，在本試驗(yàn)藥物脅迫作用下一直呈上升趨勢，說明黃絲藻在96 h試驗(yàn)過程中，膜脂過氧化程度不斷加劇。王麗平等[28]研究表明，中肋骨條藻Skeletonemacostatum和三角褐指藻PhaeodactylumtricornutumBohlin在Cu2+脅迫作用下，MDA含量持續(xù)上升,與本試驗(yàn)結(jié)果相似。陳孝華等[2]研究表明，黃絲藻在Cu2+和異噻唑啉酮的脅迫作用下，MDA含量呈現(xiàn)先上升后下降的現(xiàn)象，與本試驗(yàn)結(jié)果不同，可能與藥物種類和濃度設(shè)定有關(guān)。

3.5過氧乙酸和異噻唑啉酮配伍用藥對兩種規(guī)格南美白對蝦的毒性比較

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，南美白對蝦仔蝦的用藥安全濃度小于幼蝦的安全濃度，說明幼蝦對藥物具有較強(qiáng)的耐受能力，幼蝦的體質(zhì)量遠(yuǎn)大于仔蝦，出現(xiàn)這種情況可能與對蝦的規(guī)格和抵抗能力有關(guān)。李仁偉等[29]研究表明，南美白對蝦各關(guān)鍵發(fā)育階段對4種常見藥物的敏感性依次為比雙靈>硫酸銅>高錳酸鉀>漂白粉，并且隨著對蝦規(guī)格的增大，對藥物的抵抗能力也逐漸增強(qiáng)，這與本試驗(yàn)結(jié)果相似。還有報道指出，中華絨螯蟹耐苯扎溴銨毒性能力依次為幼蟹>Ⅲ期仔蟹>Ⅰ期仔蟹>河蟹大眼幼體，表明苯扎溴銨對中華絨螯蟹毒性大小與其個體大小成反比關(guān)系[30-31]，在甲醛對中華絨螯蟹毒性的研究[32]中也得到了與本試驗(yàn)相似的結(jié)論。此結(jié)果可為用藥范圍提供參考。

4 結(jié)論

過氧乙酸和異噻唑啉酮配伍使用時對黃絲藻的抑制具有明顯的協(xié)同效果。可在短時間內(nèi)誘導(dǎo)提高黃絲藻SOD和CAT活性，使MDA大量積累。隨著藥物脅迫時間的延長，脂質(zhì)過氧化程度加劇，引起藻細(xì)胞死亡。當(dāng)過氧乙酸和異噻唑啉酮的配伍濃度為1.00 mg/L∶0.60 mg/L時，協(xié)同抑藻效果最為顯著，比起單一用藥，大大減少了用藥量，提高了抑藻的效率。

利用確定的最適配伍比例對水體中兩種規(guī)格的南美白對蝦進(jìn)行毒性試驗(yàn)，結(jié)果表明，在仔蝦階段使用配伍藥物抑藻可能引起對蝦死亡，在幼蝦階段使用配伍藥物抑藻比較安全。因此，在生產(chǎn)中應(yīng)避免在仔蝦階段用藥，以免產(chǎn)生藥害。

此外，今后還可利用配伍藥物對魚、蟹等養(yǎng)殖生物進(jìn)行毒性研究，為藥物的推廣和安全使用提供參考。

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CombinedinhibitioneffectsofperaceticacidandisothiazoloneonalgaTribonemasp.bloomandtheirsafetyonPacificwhitelegshrimpLitopenaeusvannamei

ZHENG Chuan，MA Yan，PAN Lian-de

(Key Laboratory of Exploitation and Utilization of Aquatic Genetic Resources，Ministry of Education，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China)

The combined inhibition effects of peracetic acid and isothiazolone on algaTribonemasp. bloom and acute toxicity of both chemicals to Pacific white leg shrimpLitopenaeusvannameiwith body weight of (0.043 5±0.000 8)g and (2.576 8±0.024 0) g were studied by a static method to search a safe, environmental friend and efficient algae inhibiting products. The results showed that synergistic alga-removal effects of both peracetic acid and isothiazolone were observed, the best at proportion of peracetic acid to isothiazolone=5∶3,with the algaTribonemasp. bloom inhibition rate of 97.40% and the synergistic index of 0.14 in 96 h. The activities of superoxide dismutase (SOD) and catalase(CAT)re were shown to be elevated first and then declined, and the content of malondialdehyde (MDA) to be increased in the alga exposed to the drugs. The safe concentration was found to be the ratio peracetic acid to isothiazolone=0.21 mg/L∶0.12 mg/L for the Pacific white leg shrimp post larvae and 1.17 mg/L∶0.70 mg/L for the juveniles. The findings indicate that peracetic acid and isothiazolone are applied in Pacific white leg shrimp culture ponds with causation even though they have good inhibitory effect onTribonemabloom.

peracetic acid; isothiazolone;Tribonemasp. bloom;Litopenaeusvannamei; antioxidant enzyme

10.16535/j.cnki.dlhyxb.2017.05.005

2095-1388(2017)05-0526-08

S946.3

A

2016-12-09

水產(chǎn)動物遺傳育種上海市協(xié)同創(chuàng)新中心項目(ZF1206)

鄭串(1992—)，男，碩士研究生。E-mail:15001885650@163.com

潘連德(1960—)，男，教授。Email：ldpan@shou.edu.cn