趙學(xué)偉，李明，梁峻，劉繼晨，孫雪瑩，馬悅欣

(1.獐子島集團(tuán)股份有限公司,遼寧 大連 116001;2.大連海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧 大連 116023)

1株蝦夷扇貝苗種培育用益生菌的篩選及其對(duì)幼體存活和生長的影響

趙學(xué)偉1，李明1，梁峻1，劉繼晨2，孫雪瑩2，馬悅欣2

(1.獐子島集團(tuán)股份有限公司,遼寧 大連 116001;2.大連海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧 大連 116023)

為篩選出蝦夷扇貝Patinopectenyessoensis苗種培育用潛在益生菌，采用培養(yǎng)方法從蝦夷扇貝幼體及養(yǎng)殖水環(huán)境中共分離出300株細(xì)菌，經(jīng)過產(chǎn)淀粉酶、纖維素酶和蛋白酶能力測定，及以燦爛弧菌為指示菌株的拮抗活性測定，從中篩選出既能產(chǎn)酶又拮抗?fàn)N爛弧菌Vibriosplendidus的W115菌株。溶血試驗(yàn)結(jié)果顯示，W115菌株不產(chǎn)生溶血素, 不具有潛在的致病性；以終濃度為1×106cells/mL的W115菌株浸浴感染受精后48 h 的扇貝幼體49 d，結(jié)果顯示，該菌株對(duì)扇貝幼體是安全的；16S rRNA基因序列同源性分析表明，W115菌株與埃氏假交替單胞菌Pseudoalteromonasespejiana相似性為100%；將該菌株以終濃度1×104cells/mL和1×106cells/mL添加在蝦夷扇貝苗種培育水體中，以不加潛在益生菌為對(duì)照組，每組設(shè)3個(gè)平行，養(yǎng)殖扇貝幼體至出庫(共49 d)，在第11天(殼頂幼體期)、26天 (匍匐幼體期)、49天(稚貝期)時(shí)測定并計(jì)算幼體存活率和特定生長率(SGR)，結(jié)果顯示，1×104cells/mL組3個(gè)時(shí)期幼體的存活率和第26天匍匐幼體及第49天稚貝的SGRs均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，而1×106cells/mL組3個(gè)時(shí)期幼體的存活率和SGRs與對(duì)照組均無顯著性差異(P>0.05)。研究表明，埃氏假交替單胞菌W115菌株可促進(jìn)蝦夷扇貝幼體的存活和生長。

蝦夷扇貝; 苗種培育；益生菌；篩選；存活；生長

蝦夷扇貝Patinopectenyessoensis為冷水性貝類，具有生長快、味道鮮美、經(jīng)濟(jì)價(jià)值高等特點(diǎn)，是中國北方主要的貝類養(yǎng)殖品種，其產(chǎn)量近年來增長迅猛[1]。然而，在蝦夷扇貝育苗過程中通常因?yàn)橹虏【母腥?，?dǎo)致苗種大量死亡，制約了蝦夷扇貝養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展[2]。在雙殼貝類苗種培育過程中，使用抗菌藥物來防治細(xì)菌性疾病較為普遍[3]，但容易導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生抗藥性[4]。而益生菌作為抗生素替代品在扇貝幼體養(yǎng)殖中的應(yīng)用已引起國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注[5-6]。研究表明，益生菌可提高紫扇貝Argopectenpurpuratus和海灣扇貝Argopectenirradians幼體的成活率[5,7]。目前，關(guān)于蝦夷扇貝苗種培育過程中使用益生菌的報(bào)道較少[6]。本研究中，從蝦夷扇貝幼體及苗種培育池中篩選出1株潛在益生菌，并研究其對(duì)扇貝幼體存活和生長的影響，旨在為益生菌在蝦夷扇貝大規(guī)模菌種培育中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1材料

在蝦夷扇貝苗種培育過程中，用無菌篩絹網(wǎng)收集受精卵、擔(dān)輪幼蟲、D型幼蟲、殼頂幼蟲和稚貝5個(gè)發(fā)育時(shí)期的幼體，同時(shí)取苗種培育水樣。

將0.1 g用無菌海水漂洗過的幼體與適量無菌海水混合后勻漿。對(duì)勻漿液及苗種培育水樣進(jìn)行梯度稀釋，在2216E平板上分離純化，獲得純培養(yǎng)[8-9]。

1.2方法

1.2.1 試驗(yàn)菌株的產(chǎn)酶能力 采用點(diǎn)種法測定菌株的產(chǎn)淀粉酶、纖維素酶和蛋白酶能力。將試驗(yàn)菌株分別于培養(yǎng)基平板上點(diǎn)種淀粉培養(yǎng)基、產(chǎn)纖維素酶培養(yǎng)基和海水酪素瓊脂，15 ℃下培養(yǎng)，4 d后加入盧氏碘液以后，若菌落周圍出現(xiàn)無色透明圈則表示淀粉被分解，可確定為產(chǎn)淀粉酶陽性，反之則為陰性；加入剛果紅溶液以后，若菌落周圍出現(xiàn)無色透明的暈圈者為產(chǎn)纖維素酶陽性，無暈圈則為陰性；7 d后菌落周圍出現(xiàn)透明圈者為產(chǎn)蛋白酶陽性，反之則為陰性。以水解圈直徑(Dh)與菌落直徑(Dc)之比(Dh/Dc)初步判定產(chǎn)酶能力[10]。

1.2.2 試驗(yàn)菌株的拮抗活力 將指示菌蝦夷扇貝幼體大量死亡的致病菌燦爛弧菌VibriosplendidusV1菌株[2]接種于2216E液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，取適當(dāng)稀釋菌液0.l mL涂布于2216E平板上，然后用接種環(huán)點(diǎn)種具有產(chǎn)酶能力的供試菌，15 ℃下培養(yǎng)24 h后，觀察菌落周圍是否產(chǎn)生抑菌圈，以抑菌圈直徑(Di)與菌落直徑(Dc)之比(Di/Dc)初步判定供試菌株的拮抗活力；在涂布V1菌株的2216E固體平板上放牛津杯，將有拮抗活力菌株接種于2216E液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)(15 ℃)，36 h后離心(5000 r/min，10 min)，取上清液200 μL注入牛津杯，15 ℃下培養(yǎng)48 h后觀察抑菌現(xiàn)象。

1.2.3 溶血試驗(yàn) 將待測菌株和陽性對(duì)照(V1菌株)點(diǎn)種于5%羊血瓊脂平板，15 ℃下培養(yǎng)48 h，根據(jù)菌落周圍透明圈的形成來判斷溶血素的產(chǎn)生。

1.2.4 潛在益生菌的毒性試驗(yàn) 將篩選的潛在益生菌(W115菌株)接種到2216E液體種子培養(yǎng)基中，震蕩培養(yǎng)過夜(20 ℃，150 r/min)，將種子接種到2216E液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)16 h(20 ℃，150 r/min)，離心后(5000 r/min，10 min)，細(xì)胞用生理鹽水重懸，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。

將受精后48 h的健康扇貝幼體置于6個(gè)盛有50 L沙濾海水的塑料桶中，初始密度為(9.33±1.53) 個(gè)/mL，其中，試驗(yàn)組3桶，水中添加W115菌株，使菌濃度達(dá)到1×106cells/mL，另外3桶為對(duì)照組，水中不添加潛在益生菌。靜水充氣飼養(yǎng)，試驗(yàn)期間水溫為14～16 ℃，pH為7.8～8.2，鹽度為31.5～32.5，每天早上換水25 L并吸底，然后投餌(叉鞭金藻Dicrateriainornata、新月菱形藻Nitzschiaclosterium和青島大扁藻Platymonashelgolandica)并加菌, 持續(xù)49 d，對(duì)幼體進(jìn)行密度測定并計(jì)算死亡率(%)，計(jì)算公式為

死亡率=(A0-At)/A0×100%。

其中：At為試驗(yàn)第t天時(shí)的幼體密度(ind./mL)；A0為幼體初始密度(ind./mL)。

1.2.5 潛在益生菌的初步鑒定 將篩選得到的潛在益生菌菌株接種到2216E液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，提取細(xì)菌基因組DNA，16S rRNA基因PCR擴(kuò)增及PCR產(chǎn)物的測序方法同文獻(xiàn)[10]。將獲得的DNA序列在EzBioCloud(http://www.ezbiocloud. net/eztaxon)提供的公共數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行序列同源性比對(duì)，從結(jié)果中取相似性最高的序列，初步確定種屬。

1.2.6 潛在益生菌對(duì)幼體存活和生長的影響 蝦夷扇貝苗種培育過程在獐子島集團(tuán)育苗基地進(jìn)行。幼體受精后48 h進(jìn)行優(yōu)選，優(yōu)選后將幼體隨機(jī)分配到盛有50 L沙濾海水的塑料桶中。設(shè)不添加潛在益生菌的對(duì)照組和添加W115菌株的兩個(gè)濃度組(1×104cells/mL和1×106cells/mL)，每組設(shè)3個(gè)平行。幼體初始密度為(9.33±1.53) 個(gè)/mL，初始?xì)らL為(107.33±4.30) μm，靜水充氣飼養(yǎng)，試驗(yàn)條件及日常管理同毒性試驗(yàn)，按不同生長時(shí)期，分別投喂叉鞭金藻、新月菱形藻和青島大扁藻，每周根據(jù)幼體發(fā)育情況調(diào)整餌料投喂量，在添加潛在益生菌第11天殼頂幼體期、第26天匍匐幼體期(下網(wǎng)簾時(shí))和第49天稚貝期(出庫時(shí))對(duì)幼體進(jìn)行密度測定并計(jì)算存活率(%), 同時(shí)從每個(gè)平行取30個(gè)幼體在顯微鏡下測量殼長，并計(jì)算幼體的特定生長率(SGR，%/d)，計(jì)算公式分別為

存活率=At/A0×100%，

SGR=(lnLt-lnL0)/t×100%。

其中：At為試驗(yàn)第t天時(shí)幼體的幼體密度(ind./mL)；A0為幼體初始密度(ind./mL)；Lt為試驗(yàn)第t天時(shí)幼體的殼長(μm)；L0為幼體初始?xì)らL(μm)；t為試驗(yàn)時(shí)間(d)。

1.3數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS 16.0軟件對(duì)幼體死亡率(對(duì)照組和試驗(yàn)組)數(shù)據(jù)進(jìn)行獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)；對(duì)幼體存活率和特定生長率(對(duì)照組和兩個(gè)W115菌濃度組)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和Tukey多重比較；顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1試驗(yàn)菌株的產(chǎn)酶能力

從扇貝幼體及苗種培育水中分離出300株細(xì)菌，其中167株能產(chǎn)淀粉酶，46株能產(chǎn)纖維素酶，80株能產(chǎn)蛋白酶，28株產(chǎn)3種酶(表1)。

2.2試驗(yàn)菌株的拮抗活力

將28株產(chǎn)3種酶的菌株進(jìn)行拮抗試驗(yàn)，結(jié)果顯示，W115和S76菌株對(duì)病原菌有拮抗作用，其Di/Dc值分別為4.98和1.90。兩菌株36 h發(fā)酵液的抑菌效果見圖1，W115菌株的抑菌活性較高。

表1 產(chǎn)3種酶的菌株Tab.1 Strains producing three enzymes

注:Dh為水解圈直徑；Dc為菌落直徑
Note:Dhdenotes diameter of hydrolysis zone;Dcdenotes colony diameter

2.3試驗(yàn)菌株的溶血活性

依據(jù)拮抗活性結(jié)果，選W115和S76菌株進(jìn)行溶血試驗(yàn)，結(jié)果S76菌株為β-溶血，只有W115菌株不產(chǎn)生溶血素(圖2)。

2.4潛在益生菌的毒性

根據(jù)產(chǎn)酶、拮抗和溶血試驗(yàn)結(jié)果，選取潛在益生菌W115菌株進(jìn)行浸浴試驗(yàn)，結(jié)果顯示，試驗(yàn)組和對(duì)照組幼體死亡率無顯著性差異(P>0.05)(表2)，表明該菌株在1×106cells/mL濃度下對(duì)扇貝幼體安全。

表2 W115菌株對(duì)蝦夷扇貝幼體的致病性Tab.2 Pathogenicity of the strain W115 to Yesso scallop larvae

2.5潛在益生菌的初步鑒定

經(jīng)過產(chǎn)酶、拮抗、溶血和安全性試驗(yàn)，篩選得到1株潛在益生菌W115，16S rRNA基因序列同源性表明，W115菌株與埃氏假交替單胞菌Pseudoalteromonasespejiana的序列相似性為100%。

2.6潛在益生菌對(duì)蝦夷扇貝幼體存活和生長的影響

由表3可見：當(dāng)水體中W115菌株濃度為1×104cells/mL時(shí)，11、26、49 d時(shí)蝦夷扇貝幼體的存活率均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，而1×106cells/mL組3個(gè)時(shí)間的存活率與對(duì)照組均無顯著性差異(P>0.05)。

由表4可見：當(dāng)水體中W115菌株濃度為1×104cells/mL時(shí)，26 d時(shí)蝦夷扇貝匍匐幼體和49 d時(shí)稚貝的特定生長率均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，但11 d時(shí)殼頂幼體和1×106cells/mL濃度組3個(gè)時(shí)期的幼體與對(duì)照組均無顯著性差異(P>0.05)。

表3 不同濃度的W115菌株對(duì)蝦夷扇貝幼體存活率的影響Tab.3 Effects of different concentrations of strain W115 on the survival rate of Yesso scallop larvae %

注：同列中標(biāo)有不同小寫字母者表示組間有顯著性差異 (P<0.05)，標(biāo)有相同小寫字母者表示組間無顯著性差異 (P>0.05), 下同
Note:The means with different letters within the same column are significant differences at the 0.05 probability level, and the means with the same letters within the same column are not significant differences, et sequentia

圖1 W115和S76菌株對(duì)V1菌株的抑制效果Fig.1 Inhibition of strains W115 and S76 to indicator strain V1

表4 不同濃度的W115菌株對(duì)蝦夷扇貝幼體特定生長率的影響Tab.4 Effects of different concentrations of strain W115 on the specific growth rate of Yesso scallop larvae %/d

3 討論

3.1蝦夷扇貝苗種培育用潛在益生菌的篩選

本研究中，依據(jù)產(chǎn)酶能力、拮抗活性、溶血活性和毒性試驗(yàn)結(jié)果，篩選出1株產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶，對(duì)致病菌燦爛弧菌有拮抗活性、不產(chǎn)生溶血素和對(duì)蝦夷扇貝幼體無致病性的潛在益生菌埃氏假交替單胞菌W115菌株。

具有產(chǎn)酶能力的菌株能促進(jìn)養(yǎng)殖動(dòng)物對(duì)餌料的消化，對(duì)養(yǎng)殖動(dòng)物來說是有益菌群[11-12]。從南非鮑Haliotismidae消化道篩選出具有降解蛋白質(zhì)和淀粉的潛在益生菌，可明顯提高鮑腸區(qū)的蛋白酶活力，從而使其對(duì)蛋白的消化和吸收顯著增加[13]。通過產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶和纖維素酶的能力從刺參Apostichopusjaponicus腸道中篩選出3株潛在益生菌，在幼參養(yǎng)殖過程中投喂含3株菌的餌料，可促進(jìn)其消化和/或增強(qiáng)免疫功能[14-17]。產(chǎn)蛋白酶、纖維素酶和淀粉酶等消化酶能力的菌株廣泛存在于貝類的養(yǎng)殖環(huán)境及貝類生物體內(nèi)，如從近江牡蠣Crassostreahongkongensis腸道[18-19]和養(yǎng)殖水體[20]，以及九孔鮑Haliotisdiversicolor腸道中均可分離出高比例的產(chǎn)酶菌株[21]。與前人研究結(jié)果類似，本試驗(yàn)中從幼體及養(yǎng)殖水環(huán)境中分離出產(chǎn)酶菌株的比例高達(dá)97.7%，其作用可能是分解淀粉、纖維素和蛋白質(zhì)為可直接被宿主吸收利用的小分子物質(zhì)。

除了產(chǎn)酶能力外，拮抗病原菌活性常被作為體外篩選潛在益生菌的有效途徑之一，細(xì)菌通過產(chǎn)生抗菌物質(zhì)抑制病原菌生長[22]。從雜色鮑及皺紋盤鮑Haliotisdiscushannai腸道和美洲牡蠣Crassostreavirginica及海灣扇貝消化腺篩選出有效拮抗鮑、牡蠣和扇貝病原體的菌株[23-25]。溶血試驗(yàn)主要用于排除具有潛在致病性菌株[23-24,26]。為確保篩選益生菌的安全性，一般采用體外浸浴或體內(nèi)注射等方法[24-25]檢驗(yàn)其對(duì)宿主的致病性。本試驗(yàn)中采用與前人研究類似的方法，篩選出對(duì)蝦夷扇貝幼體無致病性的潛在益生菌W115菌株。

3.2潛在益生菌對(duì)蝦夷扇貝幼體存活和生長的影響

已有研究表明，通過體外拮抗菌篩選方法已鑒定出在雙殼類幼體養(yǎng)殖上效果較好的益生菌[5,7,25,27]，如弧菌Vibriosp. 11可保護(hù)紫扇貝幼體免受病原菌鰻弧菌Vibrioanguillarum的感染[27]；將混合菌(弧菌Vibriosp. C33+假單胞菌Pseudomonassp. 11+芽孢桿菌Bacillussp. B2)加入到水體中能夠提高紫扇貝幼體存活率，使其在不使用抗生素的情況下順利度過浮游幼體階段[5]；OY15菌株可顯著提高經(jīng)病原菌弧菌B183菌株攻毒后牡蠣幼體存活率[25]；將有益細(xì)菌A18菌株加入到苗種培育水體，可提高海灣扇貝幼苗各個(gè)發(fā)育期的成活率，且以1×104cells/mL組扇貝幼苗成活率最高[7]。將交替單胞菌Alteromonassp. CA2菌株添加于幼體養(yǎng)殖水體中，能提高太平洋牡蠣Crassostreagigas幼體的存活率和生長速度[28]。本研究中，將W115菌株以1×104cells/mL加入到苗種培育水中，能有效提高蝦夷扇貝幼體的存活和生長，這與王祥紅等[7]、Douillet等[28]的研究結(jié)果基本一致。其原因是與該菌株可為扇貝幼體提供營養(yǎng)有關(guān)，還是該菌株與其他細(xì)菌的拮抗與競爭來抑制雜菌生長有關(guān)，有待于進(jìn)一步研究。

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SelectionofoneprobioticstrainforlarvicultureanditseffectsonlarvalsurvivalandgrowthofYessoscallopPatinopectenyessoensis

ZHAO Xue-wei1, LI Ming1, LIANG Jun1，LIU Ji-chen2, SUN Xue-ying2, MA Yue-xin2

(1.Zhangzidao Group Company Limited, Dalian 116001, China; 2.Key Laboratory of Mariculture and Stock Enhancement in North China’s Sea, Ministry of Agriculture, Dalian Ocean University, Dalian 116023, China)

In order to select the potential prbiotics for larviculture of Yesso scallopPatinopectenyessoensis，three hundred bacterial strains were isolated from the Yesso scallop larvae and water of larval rearing tanks by Zobell 2216E. Two strains were screened based on isolates producing a variety of enzymes (amylase, cellulase and protease) and having antagonistic activity against pathogenVibrosplendidus. Hemolysis was tested in two strains and the results showed that strain W115 did not secrete hemolysin, without potential pathogenicity. Forty-eight hours larvae post-fertilization were challenged by strain W115 at 1×106cells/mL for 49 d, confirming that strain W115 was safe for scallop larvae. Similarity analysis of 16S rRNA gene sequences indicated that the strain W115 had 100% similarity toPseudoalteromonasespejiana. Strain W115 was added to seawater in six tanks for larviculture of the Yesso scallop at final concentrations of 1×104cells/mL and 1×106cells/mL, respectively. No potential probiont was added to three control tanks. The larvae were cultured to juvenile before outdoor breeding (49 d in total) and effects of strain W115 on the larval survival rate and the specific growth rate (SGR) were determined on 11th(umbo larvae stage), 26th(creeping larvae stage) and 49th days (juvenile stage). The survival rates and SGRs of the larvae were significantly enhanced on 11th, 26th and 49th days and on 26th and 49th days, respectively, in comparison with the controls when strain W115 was added to seawater at the concentration of 1×104cells/mL (P<0.05), however,there were no significant differences in survival rate and SGR between the 1×106cells/mL concentration treatment and the control group(P>0.05). It is concluded thatPseudoalteromonasespejianaW115 improves the survival and growth of Yesso scallop larvae.

Patinopectenyessoensisi; larviculture； probiotics; selection; survival; growth

10.16535/j.cnki.dlhyxb.2017.05.003

2095-1388(2017)05-0514-06

Q954.4

A

2017-03-06

國家“十二五”科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2013BAD23B01)；獐子島集團(tuán)科研項(xiàng)目(99801214)

趙學(xué)偉(1975—), 男，高級(jí)工程師。E-mail:zhaoxuewei@sina.com

馬悅欣(1963—), 女, 博士, 教授。E-mail:mayuexin@dlou.edu.cn