李英英，陳曦，宋鐵英

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 生物技術(shù)研究所，福建 福州 350003)

不同生長(zhǎng)速度的大黃魚腸道菌群結(jié)構(gòu)的差異

李英英，陳曦，宋鐵英

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 生物技術(shù)研究所，福建 福州 350003)

為分析腸道菌群結(jié)構(gòu)變化對(duì)大黃魚Pseudosciaenacrocea生長(zhǎng)速度的影響，采用高通量測(cè)序的方法，對(duì)生長(zhǎng)條件相同、生長(zhǎng)速度不同的兩組大黃魚腸道菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：生長(zhǎng)緩慢組魚腸道內(nèi)菌群OTUs和菌群多樣性指數(shù)Chao1顯著高于生長(zhǎng)正常組(P<0.05)，但兩組間Shannon指數(shù)差異不顯著(P>0.05)；變形菌門Proteobacteria、厚壁菌門Firmicutes、梭桿菌門Fusobacteria和擬桿菌門Bacteroidetes為大黃魚腸道內(nèi)的優(yōu)勢(shì)菌群，其中變形菌門在兩組魚腸道內(nèi)的相對(duì)豐度超過50%；兩組大黃魚腸道菌群結(jié)構(gòu)變化主要集中在變形菌門、放線菌門Actinobacteria和藍(lán)細(xì)菌門Cyanobacteria；科水平上的細(xì)菌相對(duì)豐度比較結(jié)果顯示，變形菌門內(nèi)的鞘脂單胞菌科Sphingomonadaceae、柄桿菌科Caulobacteraceae、叢毛單胞菌科Comamonadaceae、假單胞菌科Pseudomonadaceae和莫拉氏菌科Moraxellaceae在兩組魚腸道內(nèi)的相對(duì)豐度差異顯著(P<0.05)，其中莫拉氏菌科在生長(zhǎng)緩慢組魚腸道內(nèi)的含量顯著高于生長(zhǎng)正常組(P<0.05)。研究表明，不同生長(zhǎng)速度的大黃魚腸道菌群結(jié)構(gòu)存在差異，生長(zhǎng)緩慢組魚腸道內(nèi)菌群種類多于生長(zhǎng)正常組；變形菌門內(nèi)菌群變化與大黃魚生長(zhǎng)密切相關(guān)，莫拉氏菌科在魚腸道內(nèi)含量的變化可能是引起大黃魚生長(zhǎng)變慢的主要原因。

大黃魚；腸道菌群；高通量測(cè)序

腸道微生物對(duì)機(jī)體具有提供屏障、促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)吸收、增強(qiáng)免疫力等作用[1]，與機(jī)體健康密切相關(guān)。腸道菌群結(jié)構(gòu)分析是研究腸道微生物的基礎(chǔ)，傳統(tǒng)方法如平板分離培養(yǎng)、變性梯度凝膠電泳(DGGE)[2-3]、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)[4]等，只能檢測(cè)某些特定的菌群，靈敏度有限，具有較大局限性。近年來，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，以16S rDNA基因?yàn)榘袑?duì)象進(jìn)行高通量測(cè)序，可以全面分析腸道的菌群結(jié)構(gòu)，且靈敏度較高[5]，已成為腸道微生態(tài)菌群研究的首選方式。

大黃魚Pseudosciaenacrocea養(yǎng)殖中，常出現(xiàn)同一批魚苗在飼喂條件、生活環(huán)境等相同的情況下，個(gè)體差異明顯，部分魚苗生長(zhǎng)速度緩慢的現(xiàn)象。筆者在前期的研究中已經(jīng)證實(shí)，該現(xiàn)象可能與大黃魚的腸道微生物有關(guān)[6]。因此，本研究中用高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)相同飼養(yǎng)條件、不同生長(zhǎng)速度的兩組大黃魚腸道菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行深入的測(cè)定分析，以了解腸道菌群結(jié)構(gòu)變化與大黃魚生長(zhǎng)速度間的關(guān)系，旨在為深入研究大黃魚的腸道菌群結(jié)構(gòu)，并進(jìn)一步優(yōu)化養(yǎng)殖條件等提供數(shù)據(jù)資料。

1 材料與方法

1.1材料

試驗(yàn)用大黃魚采自福州市連江縣下嶼某近海網(wǎng)箱養(yǎng)殖漁場(chǎng)，取生長(zhǎng)300 d的大黃魚30尾，于冰盒內(nèi)保存帶回實(shí)驗(yàn)室。所有魚取自同一網(wǎng)箱，由同一批魚苗在相同飼養(yǎng)條件下養(yǎng)殖。所用飼料均為冰鮮料。

1.2方法

根據(jù)體魚質(zhì)量將所取大黃魚分成兩組，生長(zhǎng)緩慢組體質(zhì)量為10～40 g，生長(zhǎng)正常組體質(zhì)量為60～100 g，每組設(shè)3個(gè)平行。無菌條件下解剖取魚腸道(包括其內(nèi)容物)，準(zhǔn)確稱取腸道200 mg(由于所選大黃魚單尾魚的腸道及其內(nèi)容物質(zhì)量不足200 mg，因此，本試驗(yàn)中采用混樣，每一樣品含4尾魚的腸道)。將合并后的樣品在冰上研磨后移至2 mL離心管中，然后按照糞便基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)[天根生化科技(北京)有限公司]說明書提供的方法進(jìn)行腸道微生物DNA提取。提取到的DNA基因組樣品用超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度和質(zhì)量，再用5 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢查DNA片段是否完整，檢驗(yàn)合格的樣品由北京諾禾致源生物科技有限公司進(jìn)行微生物16S擴(kuò)增子高通量測(cè)序，并對(duì)測(cè)序得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

1.3數(shù)據(jù)分析

將測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)，經(jīng)過拼接、過濾得到有效數(shù)據(jù)，再按照97%的相似性進(jìn)行OTU聚類分析，得到每個(gè)樣品的OTUs，每個(gè)OTU代表不同的物種。魚體腸道內(nèi)微生物的豐度和多樣性用α多樣性指數(shù)Chao1和Shannon來表示：Chao1指數(shù)為微生物豐度的指標(biāo)之一，在生態(tài)學(xué)中常用來估算物種總數(shù)；Shannon指數(shù)常被用來估算樣品中微生物多樣性，Shannon指數(shù)越大，說明物種分布的越均勻，多樣性越高。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS 16.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)，若各處理組間差異達(dá)到顯著性水平，則進(jìn)行LSD多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1腸道細(xì)菌的多樣性分析

兩組魚腸道細(xì)菌多樣性測(cè)序數(shù)據(jù)見表1，生長(zhǎng)緩慢組魚腸道內(nèi)的OTU數(shù)目、Chao1指數(shù)均顯著高于生長(zhǎng)正常組(P<0.05)，說明生長(zhǎng)緩慢組與正常組相比，腸道內(nèi)菌群種類較多，豐度指數(shù)較高。兩組的Shannon指數(shù)無顯著性差異(P>0.05)，說明兩組間腸道菌落分布多樣性差異不明顯。

表1 腸道細(xì)菌的多樣性指數(shù)Tab.1 Diversity indices of bacterial community in the gut

注：同列中標(biāo)有不同小寫字母者表示組間有顯著性差異(P<0.05)，標(biāo)有相同小寫字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05)，下同
Note:The means with different letters within the same column are significant differences at the 0.05 probability level, and the means with the same letters within the same column are not significant differences, et sequentia

2.2門分類水平下腸道菌群結(jié)構(gòu)分析

經(jīng)過測(cè)序和比較，結(jié)果顯示，兩組魚腸道內(nèi)豐度較高(相對(duì)豐度≥0.5%)的8類菌門分別為變形菌門Proteobacteria、厚壁菌門Firmicutes、梭桿菌門Fusobacteria、擬桿菌門Bacteroidetes、棲熱菌門Thermi、酸桿菌門Acidobacteria、放線菌門Actinobacteria和藍(lán)細(xì)菌門Cyanobacteria，其相對(duì)豐度如表2所示。其中，變形菌門、厚壁菌門、梭桿菌門和擬桿菌門含量遠(yuǎn)高于其他菌門，為大黃魚腸道內(nèi)優(yōu)勢(shì)菌門；變形菌門在生長(zhǎng)正常組魚腸道內(nèi)的含量高于緩慢組，而厚壁菌門、梭桿菌門、擬桿菌門在正常組魚腸道內(nèi)的含量低于緩慢組，但兩組間均無顯著性差異(P>0.05)；兩組間放線菌門和藍(lán)細(xì)菌門有顯著性差異(P<0.05)。

表2 門分類水平下不同生長(zhǎng)速度的兩組大黃魚腸道菌群相對(duì)豐度Tab.2 Relative abundance of bacterial communities at phylum level in the gut of large yellow croaker Pseudosciaena cracea in two groups with different growth rates %

2.3科分類水平下腸道菌群結(jié)構(gòu)分析

在科水平下對(duì)兩組魚腸道菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，在已明確的195個(gè)科中，豐度較高的科共有13個(gè)(≥1%)，差異性分析結(jié)果顯示，有5個(gè)科在兩組魚腸道內(nèi)的相對(duì)豐度有顯著性差異(P<0.05)，它們?cè)趦山M魚腸道內(nèi)的相對(duì)豐度如表3所示。其中，鞘脂單胞菌科Sphingomonadaceae、柄桿菌科Caulobacteraceae、叢毛單胞菌科Comamonadaceae、假單胞菌科Pseudomonadaceae在生長(zhǎng)正常組腸道內(nèi)的含量高于緩慢組，只有莫拉氏菌科Moraxellaceae在生長(zhǎng)緩慢組腸道內(nèi)的含量高于正常組。

表3 科分類水平下不同生長(zhǎng)速度的兩組大黃魚腸道菌群相對(duì)豐度Tab.3 Relative abundance of bacterial communities at family level in the gut of large yellow croaker Pseudosciaena cracea in the two groups with different growth rates %

3 討論

3.1不同生長(zhǎng)速度的兩組大黃魚腸道菌群豐度和多樣性比較

正常動(dòng)物腸道內(nèi)均分布有大量微生物菌群，經(jīng)過長(zhǎng)期演化，這些腸道菌群與機(jī)體的健康及營(yíng)養(yǎng)吸收聯(lián)系及其密切[7]。腸道菌群受宿主膳食、基因型、年齡、疾病、益生菌、藥物和生活環(huán)境等多種因素影響[8]，是一個(gè)動(dòng)態(tài)的平衡。按照與宿主的關(guān)系，可將動(dòng)物腸道內(nèi)的菌群分為3類：益生菌、致病菌和機(jī)會(huì)致病菌，一般情況下，機(jī)會(huì)致病數(shù)量最多，益生菌次之，致病菌最少[9]。當(dāng)機(jī)體遭受強(qiáng)烈應(yīng)激，或者長(zhǎng)時(shí)間大劑量使用抗生素、糖皮質(zhì)激素或免疫抑制劑等，均會(huì)使腸黏膜受損，腸道的屏障功能和免疫功能作用下降，此時(shí)腸道內(nèi)的致病菌和機(jī)會(huì)致病菌會(huì)趁機(jī)大量增殖，造成腸道菌群失調(diào)[10]。本研究中采用高通量測(cè)序的方法，分析了同等生活條件下生長(zhǎng)速度差異明顯的兩組魚腸道菌群結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，生長(zhǎng)緩慢組魚腸道內(nèi)菌群OTUs和多樣性指數(shù)Chao1顯著高于正常組，說明生長(zhǎng)緩慢組魚腸道內(nèi)菌群種類多于生長(zhǎng)正常組。作者在前期研究中[6]發(fā)現(xiàn)，生長(zhǎng)緩慢組魚腸黏膜損傷嚴(yán)重，腸道內(nèi)弧菌和酵母菌數(shù)量高于生長(zhǎng)正常組。由此可以認(rèn)為，生長(zhǎng)緩慢組魚腸道健康狀況較差，正常情況下，生長(zhǎng)被抑制的菌群趁機(jī)過度繁殖，造成生長(zhǎng)速度不同的兩組魚腸道菌群多樣性方面表現(xiàn)出差異。

3.2門和科水平上不同生長(zhǎng)速度的兩組大黃魚腸道菌群結(jié)構(gòu)比較

通過測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，大黃魚腸道內(nèi)主要菌門有變形菌門、厚壁菌門、梭桿菌門和擬桿菌門，這與文獻(xiàn)中記載的其他水生動(dòng)物，如牙鲆[11]、草魚、鯽、鳙[12]、櫛孔扇貝[13]、海參[14]等腸道內(nèi)的優(yōu)勢(shì)菌門及含量略有差異。造成這種差異的原因可能是由于水生動(dòng)物腸道菌群結(jié)構(gòu)受水質(zhì)和餌料等因素影響較大[8]，而不同水生動(dòng)物生活的水質(zhì)和餌料均不相同，因此，其腸道內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)差異較大。對(duì)兩組魚腸道含量超過0.5%的8種菌門進(jìn)行組間比較發(fā)現(xiàn)，生長(zhǎng)正常組魚腸道內(nèi)放線菌門和藍(lán)細(xì)菌門含量顯著高于生長(zhǎng)緩慢組(表2)。放線菌門包含的很多菌種可分泌抗生素和酶[15-16]，在動(dòng)物腸道和海洋微生態(tài)系統(tǒng)中均有重要作用，有研究結(jié)果表明，放線菌門可作為衡量動(dòng)物腸道健康的部分依據(jù)[17]。藍(lán)細(xì)菌是光合化能類原核生物，在自然界中分布廣泛，普遍存在于海水[18-19]和淡水[20-21]中，因水產(chǎn)動(dòng)物腸道內(nèi)菌群受水體中微生物影響，在海水[12]和淡水動(dòng)物[22]腸道內(nèi)都會(huì)包含少量的藍(lán)細(xì)菌。但是由于這兩種菌門所占的比例較小，其變化與大黃魚生長(zhǎng)速度的關(guān)聯(lián)需要進(jìn)一步深入研究。

變形菌門在兩組魚腸道中的含量均達(dá)到一半以上，其含量遠(yuǎn)超過其他菌門；在科水平對(duì)兩組魚腸道菌群進(jìn)行比較的結(jié)果顯示，兩組魚腸道內(nèi)菌群相對(duì)豐度差異顯著的5個(gè)科都屬于變形菌門(表3)，由此可以認(rèn)為，變形菌門內(nèi)菌群變化與大黃魚生長(zhǎng)密切相關(guān)。變形菌門是細(xì)菌中較大的一個(gè)門類，廣泛分布于土壤[23]、污水[24]、動(dòng)物[25]、植物[26]和人類體內(nèi)[27]，既包含了一些無機(jī)化能和光合種類，也包含很多病原菌，科研和醫(yī)學(xué)上很多較重要的菌類都屬于變形菌門，如腸桿菌科Enterobacteraceae[28]、弧菌科Vibrionaceae[29]和假單胞菌科Pseudomonadaceae[30]等。由于變形菌門內(nèi)菌群種類繁多，對(duì)宿主的作用復(fù)雜，因此，要研究變形菌門對(duì)大黃魚魚體生長(zhǎng)的具體影響還需要進(jìn)一步的研究來證實(shí)。

在科水平對(duì)兩組魚腸道菌群相對(duì)豐度進(jìn)行差異性比較的結(jié)果顯示，鞘脂單胞菌科、柄桿菌科、叢毛單胞菌科、假單胞菌科在生長(zhǎng)正常組腸道內(nèi)的含量顯著高于生長(zhǎng)緩慢組，而莫拉氏菌科在生長(zhǎng)緩慢組腸道內(nèi)的含量顯著高于生長(zhǎng)正常組。前4科細(xì)菌均為海水水體常見菌[31-36]，其對(duì)大黃魚營(yíng)養(yǎng)吸收及生長(zhǎng)的影響目前尚不明確；同時(shí)由于大黃魚腸道進(jìn)化不完善，長(zhǎng)度較短且開放，其腸道菌群結(jié)構(gòu)易受上述海水中微生物的影響[37]，因此，該4科菌在腸道內(nèi)的變化與大黃魚生長(zhǎng)速度的關(guān)系需進(jìn)一步研究證明。莫拉氏菌[38]常寄存于人和動(dòng)物器官黏膜上，其科內(nèi)包含多種致病菌，可引起人或動(dòng)物疾病。如：黏膜炎莫拉氏菌可導(dǎo)致人的敗血癥[39]；卡他莫拉氏菌會(huì)引起人的下呼吸道感染[40]；兔莫拉氏菌可寄生于牙鲆心臟血液中，可隨血液循環(huán)至各組織器官，引起牙鲆肝臟、腎臟、脾臟等組織變形，最終導(dǎo)致其死亡[41]。在生長(zhǎng)緩慢組魚腸道內(nèi)莫拉氏菌科的含量遠(yuǎn)高于生長(zhǎng)正常組，意味著生長(zhǎng)緩慢組魚腸道內(nèi)健康及免疫狀況較差，該結(jié)果與作者前期研究結(jié)果一致[6]。因此，作者認(rèn)為，由于生長(zhǎng)緩慢組魚腸道內(nèi)健康狀況較差，正常情況下生長(zhǎng)受抑制的致病菌如莫拉氏菌趁機(jī)過度繁殖，造成魚腸道菌群紊亂，消化吸收能力下降，最終導(dǎo)致魚體生長(zhǎng)緩慢。

4 結(jié)論

生長(zhǎng)速度不同的兩組大黃魚腸道內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)存在差異，生長(zhǎng)緩慢組魚腸道菌群種類多于生長(zhǎng)正常組；腸道細(xì)菌豐度比較結(jié)果顯示，變形菌門內(nèi)菌群變化與大黃魚生長(zhǎng)密切相關(guān)，其中，莫拉氏菌科在魚腸道內(nèi)含量的變化可能是引起大黃魚生長(zhǎng)變慢的主要原因。

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DifferencesinintestinalfloraofculturedlargeyellowcroakerPseudosciaenacroceawithdifferentgrowthrates

LI Ying-ying, CHEN Xi, SONG Tie-ying

(Institute of Biotechnology, Fujian Academy of Agricultural Science, Fuzhou 350003, China)

The intestinal microbiota was analyzed in large yellow croakerPseudosciaenacroceacultured in the same conditions with different growth by the high-throughput sequencing to investigate the relationship between growth rate and intestinal flora. The results showed that there were significantly higher quantities of OTUs and Chao1 in the smaller-sized group than those in the larger-sized group (P<0.05), without significant differences in the quantities of Shannon between the two groups (P>0.05). The dominance of Proteobacteria, Firmicutes, Fusobacteria and Bacteroidete was shown in the microbiota, especially Proteobacteria with more than 50% abundances in both groups. The relative abundance in family level revealed that there were significant differences in Sphingomonadaceae, Caulobacteraceae, Comamonadaceae, Pseudomonadaceae and Moraxellaceae between the two groups (P< 0.05), significantly higher relative abundance of Moraxellaceae in the smaller-sized group than that in the larger-sized one. The finding demonstrated that there were differences in intestinal flora in the fish with different growth rates. There was more species in intestinal bacteria in the smaller-sized group than that in the larger-sized group. The growth of the fish seems to be involved in changes in flora of Proteobacteria, and growth differences of the fish are suggested to be attributed to the variation in amount of intestinal Moraxellaceae.

Pseudosciaenacrocea; intestinal flora; high-throughput sequencing

10.16535/j.cnki.dlhyxb.2017.05.002

2095-1388(2017)05-0509-05

S965.3

A

2016-12-30

福建省農(nóng)科院科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)PI項(xiàng)目(2016PI-22)；福建省公益項(xiàng)目(2015R1019-9，2017R1019-2,2017R1019-7)；福建省農(nóng)科院科技創(chuàng)新項(xiàng)目(PC2017-6)

李英英(1987—)，女，研究實(shí)習(xí)員。E-mail:liyingying80@126.com

宋鐵英(1963—)，女，研究員。E-mail:tieyingsong@163.com