呂德亮，李敏，吳反修，左然濤，常亞青

(1.大連海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，遼寧 大連 116023; 2.全國水產(chǎn)技術(shù)推廣總站，中國水產(chǎn)學(xué)會，北京 100125)

雌二醇對中間球海膽生長、性腺發(fā)育及膽固醇代謝的影響

呂德亮1，李敏1，吳反修2，左然濤1，常亞青1

(1.大連海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，遼寧 大連 116023; 2.全國水產(chǎn)技術(shù)推廣總站，中國水產(chǎn)學(xué)會，北京 100125)

為探討雌二醇(estradiol)對體質(zhì)量為(13.58±0.79)g的中間球海膽Strongylocentrotusintermedius性腺發(fā)育的調(diào)控機制，在室內(nèi)水槽(200 L)中進(jìn)行為期60 d的注射試驗。試驗分對照組、雌二醇(5 μg/mL)注射組和他莫昔芬(tamoxifen)(25 μg/mL)注射組，每3 d注射1次，并于第30天和第60天時兩次取樣測定海膽增重率(WGR)、性腺指數(shù)(GSI)、性類固醇激素含量和膽固醇合成相關(guān)基因的表達(dá)量。結(jié)果表明：注射雌二醇或他莫昔芬并未顯著影響海膽的生長速率，卻顯著影響試驗?zāi)┢诤Ｄ懙男韵僦笖?shù)，雌二醇組海膽性腺指數(shù)顯著高于對照組和他莫昔芬組(P<0.05)；試驗結(jié)束時，雌二醇組和他莫昔芬組海膽體腔液中雌二醇含量和性腺中膽固醇含量均顯著高于對照組(P<0.05)，雌二醇組海膽性腺中雌二醇含量最高，顯著高于對照組和他莫昔芬組(P<0.05)；雌二醇組海膽性腺和消化道中主要卵黃蛋白(MYP)基因均高于對照組，但均未有顯著性差異(P>0.05)；雌二醇組和他莫昔芬組海膽性腺和消化道中性類固醇激素合成關(guān)鍵基因CYP17和膽固醇合成關(guān)鍵基因CYP51表達(dá)量均顯著高于對照組(P<0.05)；他莫昔芬組海膽性腺中CYP17和CYP51基因表達(dá)量均低于雌二醇組(P>0.05)。研究表明，注射雌二醇顯著提高了中間球海膽性腺指數(shù)、體內(nèi)雌二醇含量和雌二醇合成相關(guān)基因的表達(dá)量，這可能是雌二醇促進(jìn)海膽性腺發(fā)育的調(diào)控機制。

中間球海膽；類固醇激素；基因表達(dá)；性腺發(fā)育

中間球海膽Strongylocentrotusintermedius又稱蝦夷馬糞海膽，原產(chǎn)于日本北海道及俄羅斯薩哈林島等沿海區(qū)域，因其性腺色澤好、味道鮮美，深受消費者喜愛，是價值較高的海膽經(jīng)濟(jì)種類之一[1]。1989 年，大連海洋大學(xué)從日本引進(jìn)中間球海膽，并率先開展了該品種的人工繁殖、養(yǎng)殖技術(shù)、病害防治和營養(yǎng)生理等相關(guān)研究[2-5]。目前，中間球海膽已經(jīng)成為中國北方沿海重要的經(jīng)濟(jì)海膽種類，發(fā)展前景良好。

生殖腺是海膽唯一可食用部分，兼具生殖和儲存營養(yǎng)的雙重作用。性腺發(fā)育的關(guān)鍵是卵黃發(fā)生，而卵黃發(fā)生的關(guān)鍵是卵黃蛋白的合成。已有研究發(fā)現(xiàn)，類固醇激素(雌二醇等)具有促進(jìn)卵黃蛋白原合成的作用，并且對水產(chǎn)動物生長發(fā)育也具有一定的影響。溫茹淑等[6]研究發(fā)現(xiàn)，水體中含17β-雌二醇(1 mg/mL)可促進(jìn)雄性劍尾魚Xiphophorushellerii卵黃蛋白原的產(chǎn)生。水體中添加雌二醇(50 ng/L)可促進(jìn)菲律賓蛤仔Ruditapesphilippinarum卵原蛋白原的合成[7]。在對棘皮動物的研究中發(fā)現(xiàn)，海星和海膽性腺中均含有雌二醇，且含量呈季節(jié)性變化[8]。與其他水產(chǎn)動物不同，海膽的卵黃蛋白稱為主要卵黃蛋白(MYP)[9-12]，在海膽的精巢和卵巢中均有表達(dá)[13-15]。與其他水產(chǎn)動物類似，外源性的雌二醇也會促進(jìn)海膽體內(nèi)MYP蛋白的合成[16]，進(jìn)而促進(jìn)卵巢發(fā)育和卵子發(fā)生[17]。

目前，有關(guān)雌二醇對水產(chǎn)動物膽固醇合成及分解代謝相關(guān)基因表達(dá)的研究至今未見報道。膽固醇是性類固醇激素合成的底物，膽固醇的合成和分解代謝會直接影響動物體內(nèi)膽固醇的水平，進(jìn)而決定性類固醇激素的含量。CYP51 基因是P450超基因家族重要的成員，該基因編碼的14α-去甲基酶是膽固醇合成過程中的關(guān)鍵酶之一[18]。細(xì)胞色素P450 家族的另外一個重要成員是CYP17，該基因編碼的細(xì)胞色素17α羥化酶和17，20-裂解酶在類固醇激素合成過程中發(fā)揮重要作用，該基因的表達(dá)水平可在一定程度上決定動物體內(nèi)雌二醇和睪酮的水平[19]。他莫昔芬是一種選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑，其活性代謝產(chǎn)物可與雌二醇競爭受體結(jié)合形成復(fù)合物，改變雌激素受體的空間構(gòu)型，從而使雌激素的功能不能有效發(fā)揮[20]。

本研究中，以中間球海膽為研究對象，通過向海膽體內(nèi)注射雌二醇或他莫西芬，檢測海膽性腺指數(shù)和體腔液中膽固醇、性激素含量，以及膽固醇合成和分解代謝相關(guān)基因的表達(dá)，以期闡明雌二醇影響海膽性腺發(fā)育的調(diào)控機制，進(jìn)而為通過營養(yǎng)途徑調(diào)控中間球海膽性腺發(fā)育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

試驗材料為大連龍王塘海域人工養(yǎng)殖的1齡中間球海膽，體質(zhì)量為(13.58±0.79)g。試驗前，將中間球海膽在水槽中暫養(yǎng)7 d，每3 d換水1次，投喂餌料為海帶。

1.2方法

1.2.1 試驗設(shè)計 試劑配制：取10 mg 17β-雌二醇溶解于10 mL無水乙醇，制成1 mg/mL的母液，然后用葵花油稀釋成5 μg/mL的應(yīng)用液。取10 mg他莫昔芬溶解于10 mL無水乙醇，制成1 mg/mL的母液，然后用葵花油稀釋成25 μg/mL的應(yīng)用液。

試驗設(shè)3個處理組，對照組、雌二醇組和他莫昔芬組，將海膽隨機分配于3種處理模式下，每組設(shè)3個平行，每一平行放入20枚海膽，共180枚。試驗在室內(nèi)水槽(280 L)內(nèi)進(jìn)行，試驗開始前測量所有海膽的初始體質(zhì)量、殼高、殼徑。試驗期間投喂足量海帶，每3 d半量換水1次，全天充氧。每隔2 d使用1 mL注射器對每只海膽注射10 μL葵花油(對照組)、雌二醇應(yīng)用液(雌二醇組)和他莫昔芬應(yīng)用液(他莫昔芬組)。試驗期間，水溫為9～12 ℃，氨氮含量為0.009～0.013 mg/L，溶氧在6 mg/L以上，鹽度為28～30。

1.2.2 樣本的采集 試驗時間從2017年3月1日—2017年4月29日，共60 d，每30 d取樣1次。取樣時對每個網(wǎng)籠中的全部海膽進(jìn)行稱重，并隨機取6只海膽，通過稱量其性腺濕質(zhì)量計算性腺指數(shù)。收集6只海膽的性腺和消化道于無酶離心管中，用液氮速凍后保存于冰箱(-80 ℃)中用于檢測基因表達(dá)。收集6只海膽的海膽體腔液，于4 ℃下以2500 r/min離心10 min，分離體腔液上清，保存于冰箱(-80 ℃)中用于檢測膽固醇、雌二醇和睪酮含量。

1.2.3 激素測定 采用酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA)對性腺和體腔液中雌二醇、睪酮含量的變化進(jìn)行檢測。選用Molluscs Estradiol(E2)Elisa 測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)檢測雌二醇含量，選用Molluscs Testosterone(T)Elisa 測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)檢測睪酮含量，測定步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書步驟進(jìn)行操作。

利用分光光度法檢測性腺和體腔液中的總膽固醇含量(mmol/mg prot)，計算公式為

總膽固醇含量=(測定管OD值-空白管OD值)/(標(biāo)準(zhǔn)管OD值-空白管OD值)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(5.17 mmol/L)×樣本測定前稀釋倍數(shù)/待測樣本蛋白含量(mg prot/mL)×1000。

1.2.4 相關(guān)基因表達(dá)量的測定

(1)總RNA提取。用 RNA 提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司)]，分別提取對照組和不同試驗處理組海膽性腺、消化道的總RNA。用核酸測定儀和瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行濃度和完整性檢測。

(2)反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄按照PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)試劑盒(TaKaRa)說明書步驟，在Eppendorf Mastercycler gradient型PCR儀上進(jìn)行。反轉(zhuǎn)錄總反應(yīng)體系(共20 μL)：5×PrimeScript RT Master Mix 2 μL，Total RNA 500 ng，用RNase Free ddH2O補足反應(yīng)體系。

反應(yīng)條件：37 ℃ 下反應(yīng)15 min(反轉(zhuǎn)錄反應(yīng))；85 ℃下反應(yīng)5 s(反轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng))。將反應(yīng)產(chǎn)物立即用于PCR反應(yīng)。

(3)引物篩選。試驗所用引物信息見表1。

通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)對引物進(jìn)行驗證，反應(yīng)按照TksGflexTMDNA Polymerase試劑盒(TaKaRa)說明書步驟在Eppendorf Mastercycler gradient 型 PCR 儀上進(jìn)行。

PCR反應(yīng)條件：94 ℃下預(yù)變性5 min；94 ℃下變性30 s，51 ℃下退火30 s(18S基因和MYP基因的退火溫度均為51 ℃)，72 ℃下延伸30 s，共進(jìn)行35個循環(huán)；最后在72 ℃下再延伸10 min。

表1 實時定量PCR的引物信息Tab.1 Primers used for real time PCR in this study

用膠回收試劑盒(EasyPure?Quick Gel Extraction Kit，北京全式金生物技術(shù)有限公司)對PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收，按照pEASY?-T1 Cloning Kit試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)說明書步驟對膠回收產(chǎn)物進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化，用2×EasyTap PCR SuperMix(+dye)和M13引物對連接轉(zhuǎn)化得到的菌液進(jìn)行驗證，送至北京華大基因研究中心進(jìn)行測序，并將測序結(jié)果進(jìn)行比對，確定目的基因。

(4)實時定量PCR(RT-PCR)。采用優(yōu)化好的條件以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，使用ABI7500型熒光定量PCR儀。根據(jù) SYBR?Fast qPCR Mix試劑盒(TaKaRa)所示，對反應(yīng)體系略加調(diào)整。

總反應(yīng)體系(共20 μL)：SYBR Fast qPCR Mix(2×)10 μL，正、反向引物 各0.8 μL，ROX Reference DyeⅡ 0.4 μL，模板 cDNA 2 μL，ddH2O 6 μL。反應(yīng)條件：采用兩步法，95 ℃ 下預(yù)變性10 s；95 ℃ 下變性5 s，51 ℃ 下退火32 s，共進(jìn)行40個循環(huán)。

1.2.5 生長指標(biāo)的計算

增重率(WGR)=(Wf-W0)/W0×100%，

性腺指數(shù)(GSI)=Wx/Wf×100%。

其中：W0為海膽初始體質(zhì)量(g)；Wf為每一次取樣時海膽的體質(zhì)量(g)；Wx為每一次取樣時海膽的性腺質(zhì)量(g)。

1.3數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行初步整理，利用SPSS 22.0軟件，以注射模式為影響因素，對各測量和計算性狀進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)，當(dāng)有顯著性差異時，采用Tukey法對平均值進(jìn)行兩兩比較，顯著性水平設(shè)為0.05。試驗數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean ± S.E.)的形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1中間球海膽的生長和性腺指數(shù)

從表2可見：第30天(第1次取樣)時，3個處理組的WGR和GSI均無顯著性差異(P>0.05)；第60天(第2次取樣)時，雌二醇組GSI(18.59%)顯著高于對照組(13.51%)和他莫昔芬組(11.8%)(P<0.05)。第60天時，各處理組的WGR和GSI均顯著高于第30天時的對應(yīng)值(P<0.05)。

表2 激素注射對中間球海膽增重率及性腺指數(shù)的影響Tab.2 Effect of hormone injection on weight gain rate(WGR) and gonado-somatic index (GSI) in sea urchin Strongylocentrotus intermedius

注：同列中標(biāo)有不同小寫字母者表示同一次取樣中3個處理組間有顯著性差異(P<0.05)，標(biāo)有不同大寫字母者表示同一處理組在兩次取樣間有顯著性差異(P<0.05)，標(biāo)有相同字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05)，下同
Note:Means with different letters within the same column are significant differences in the same samples among the three treatments(P<0.05);Means with different capital letters are significant differences in the same treatment between the two samples(P<0.05)；Means with the same letters are significant differences(P>0.05),et sequentia

2.2中間球海膽體腔液和性腺中雌二醇、膽固醇和睪酮含量

中間球海膽體腔液和性腺中的膽固醇、雌二醇及睪酮含量如表3所示。

第30天時，雌二醇組海膽體腔液中雌二醇含量(47.85 ng/L)均顯著高于對照組(40.24 ng/L)和他莫昔芬組(42.02 ng/L)(P<0.05)；他莫昔芬組海膽體腔液中的膽固醇含量(0.55 mmol/g prot)均顯著高于對照組(0.23 mmol/g prot)和雌二醇組(0.25 mmol/g prot)(P<0.05)；他莫昔芬組海膽性腺中雌二醇、膽固醇和睪酮含量均最高，但與其他兩組間無顯著性差異(P>0.05)。

第60天時，雌二醇組海膽體腔液中雌二醇含量(53.44 ng/L)顯著高于對照組(43.68 ng/L)(P<0.05)，但與他莫昔芬組(48.75 ng/L)無顯著性差異(P>0.05)；他莫昔芬組海膽體腔液中膽固醇含量(0.52 mmol/g prot)均顯著高于對照組(0.15 mmol/g prot)和雌二醇組(0.22 mmol/g prot)(P<0.05)；雌二醇組海膽體腔液中睪酮含量高于他莫昔芬組和對照組，但無顯著性差異(P>0.05)。雌二醇組海膽性腺中雌二醇、膽固醇和睪酮含量均最高，但與其他兩組均無顯著性差異(P>0.05)。

第60天時，雌二醇組和他莫昔芬組海膽性腺中雌二醇、膽固醇和睪酮含量均高于第30天時的對應(yīng)值，但只有膽固醇含量在兩次取樣間有顯著性差異(P<0.05)。

表3 中間球海膽體腔液和性腺中雌二醇、膽固醇和睪酮的含量(n=3)Tab.3 Concentrations of estradiol, testosterone and cholesterol in the coelomic fluid and gonad of sea urchin Strongylocentrotus intermedius(n=3)

2.3中間球海膽消化道和性腺中MYP基因表達(dá)量

由圖1-A可知，兩次取樣中雌二醇組和他莫昔芬組海膽消化道中MYP基因的表達(dá)量均較對照組有所提高，但均無顯著性差異(P>0.05)，同一處理組在兩次取樣間未見有顯著性差異(P>0.05)。

注：標(biāo)有不同小寫字母者表示同一次取樣中3個處理組間有顯著性差異(P<0.05)，標(biāo)有不同大寫字母者表示同一處理組在兩次取樣間有顯著性差異(P<0.05)，標(biāo)有相同字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05)，下同Note:Means with different letters are significant differences in the same samples among the three treatments(P<0.05); Means with different capital letters are significant differences in the same treatment between the two samples(P<0.05)； Means with the same letters are significant differences(P>0.05),et sequentia圖1 雌二醇和他莫昔芬對中間球海膽消化道和性腺中MYP基因表達(dá)量的影響Fig.1 Expression levels of MYP gene in the digestive tract and gonad of sea urchin Strongylocentrotus intermedius in response to estradiol and tamoxifen

由圖1-B可知:第30天時，雌二醇組海膽性腺中MYP基因的表達(dá)量較對照組有較大幅度提高，他莫昔芬組海膽性腺中MYP基因的表達(dá)量較對照組有所下降，但均無顯著性差異(P>0.05)；第60天時，雌二醇組和他莫昔芬組海膽性腺中MYP基因的表達(dá)量與對照組相比均有少量增加，但無顯著性差異(P>0.05)。同一處理組在兩次取樣之間也未見有顯著性差異(P>0.05)。

2.4中間球海膽消化道和性腺中CYP17基因表達(dá)量

由圖2-A可知：第30天時，雌二醇組和他莫昔芬組海膽消化道中CYP17基因的表達(dá)量較對照組均有所提高，但差異均不顯著(P>0.05)；第60天時，雌二醇組和他莫昔芬組海膽消化道中CYP17基因的表達(dá)量分別較對照組顯著提高3.91倍和2.59倍(P<0.05)。第60天時，雌二醇組和他莫酚組海膽消化道中CYP17基因的表達(dá)量均較第30天時有所提高，但均無顯著性差異(P>0.05)。

由圖2-B可知：第30天時，雌二醇組和他莫昔芬組海膽性腺中CYP17基因的表達(dá)量與對照組相比均有所提高，但均無顯著性差異(P>0.05)；第60天時，雌二醇組和他莫昔芬組海膽性腺中CYP17基因的表達(dá)量分別較對照組顯著提高9.82倍和4.82倍(P<0.05)。隨著時間的延長，第60天時，對照組海膽性腺中CYP17基因的表達(dá)量與第30天時相比基本不變(P>0.05)，雌二醇組海膽性腺中CYP17基因的表達(dá)量為第30天時的3.24倍，且有顯著性差異(P<0.05)，而他莫昔酚組海膽性腺中CYP17基因的表達(dá)量較第30天時略有提高(P>0.05)。

圖2 雌二醇和他莫昔芬對中間球海膽消化道和性腺中CYP17基因表達(dá)量的影響Fig.2 Expression levels of CYP17 gene in the digestive tract and gonad of sea urchin Strongylocentrotus intermedius in response to estradiol and tamoxifen

2.5中間球海膽消化道和性腺中CYP51基因表達(dá)量

由圖3-A可知：第30天時，雌二醇組海膽消化道中CYP51基因的表達(dá)量是對照組的2.97倍，他莫昔芬組消化道中CYP51基因的表達(dá)量是對照組的2.07倍，但均無顯著性差異(P>0.05)；第60天時，雌二醇組和他莫昔芬組消化道中CYP51基因的表達(dá)量分別較對照組顯著提高5.45倍和6.67倍(P<0.05)。隨著試驗時間的延長，第60天時，對照組消化道中CYP51基因的表達(dá)量較第30天時基本不變(P>0.05)，雌二醇組消化道中CYP51基因的表達(dá)量較第30天時有所提高(P>0.05)，他莫昔酚組海膽消化道中CYP51基因的表達(dá)量較第30天時顯著提高2.56倍(P<0.05)。

圖3 雌二醇和他莫昔芬對中間球海膽消化道和性腺中CYP51基因表達(dá)量的影響Fig.3 Expression levels of CYP51 gene in the digestive tract and gonad of sea urchin Strongylocentrotus intermedius in response to estradiol and tamoxifen

由圖3-B可知：第30天時，雌二醇組海膽性腺中CYP51基因的表達(dá)量較對照組有所提高，他莫昔芬組性腺中CYP51基因的表達(dá)量較對照組有所下降，但各組間均無顯著性差異(P>0.05)；第60天時，雌二醇組和他莫昔芬組性腺中CYP51基因的表達(dá)量分別較對照組顯著提高19.60倍和4.46倍(P<0.05)。隨著試驗時間的延長，第60天時，對照組性腺中CYP51基因的表達(dá)量較第30天時略有減少，但未有明顯差異(P>0.05)，雌二醇組和他莫昔酚組性腺中CYP51基因的表達(dá)量較第30天時分別顯著提高4.49倍和5.31倍(P<0.05)。

3 討論

3.1雌二醇可促進(jìn)卵黃蛋白的合成

本試驗結(jié)果顯示，第60天時的取樣與第30天時相比，雌二醇組海膽的性腺指數(shù)增長最大。這說明注射雌二醇提高了海膽消化道和性腺中MYP的表達(dá)量，也提高了其性腺和體腔液中雌二醇的含量，這與之前諸多研究結(jié)果一致。陳家長等[23]研究發(fā)現(xiàn)，17β-雌二醇具有較強的雌激素效應(yīng)，能夠顯著提高羅非魚Oreochromismossambicus血清中雌二醇和卵黃蛋白原的含量。此外，雌激素浸泡也可以誘導(dǎo)太平洋牡蠣Crassostreagigas[24]、蝦夷扇貝Patinopectenyessoensis[25]體內(nèi)卵黃蛋白原基因的表達(dá)和蛋白合成。Schoenmakers等[8]也發(fā)現(xiàn)，17β-雌二醇可促進(jìn)海星卵黃蛋白的形成。

3.2他莫西芬可抑制雌二醇功能的發(fā)揮

在脊椎動物中，性類固醇激素是通過激素受體(Estrogen receptor, ER)發(fā)揮作用的。而ER是一種E2依賴型轉(zhuǎn)錄因子，其通過與靶基因上的啟動子直接結(jié)合，參與雌激素靶細(xì)胞中的生理效應(yīng)[26]。在對美國扇貝Placopectenmagellanicus的研究中發(fā)現(xiàn)，3H標(biāo)記的性激素可與組織勻漿中某些蛋白穩(wěn)定結(jié)合，說明性激素受體可能存在于貝類等無脊椎動物中[27]。本試驗結(jié)束時，他莫西芬組海膽的性腺指數(shù)低于對照組，這與Wang 等[28]的研究結(jié)果一致，該研究發(fā)現(xiàn)，性類固醇激素誘導(dǎo)美國扇貝性腺發(fā)育和配子排放的作用可被他莫昔芬抑制。本研究中，他莫昔酚組的海膽體腔液和性腺中雌二醇含量均高于對照組。這可能是由于他莫昔酚通過競爭雌激素受體，抑制了雌二醇功能的正常發(fā)揮，致使機體膽固醇和雌二醇應(yīng)激性合成增加。本研究中也發(fā)現(xiàn)，他莫西芬組海膽體內(nèi)膽固醇合成的關(guān)鍵基因CYP51和性激素合成關(guān)鍵基因CYP17表達(dá)量確實較對照組有較大幅度提高，這進(jìn)一步支持了上述假設(shè)。因此，他莫西芬組海膽應(yīng)激性的雌二醇合成導(dǎo)致了MYP較對照組略有升高。另外，本研究中MYP定量為轉(zhuǎn)錄水平而非蛋白水平，這也可能是造成MYP表達(dá)量與性腺指數(shù)結(jié)果不一致的原因。其次，MYP被氧化不能被正常轉(zhuǎn)運至性腺也可能是導(dǎo)致MYP表達(dá)量與性腺指數(shù)不一致的原因。MYP蛋白是由海膽消化管道和性腺合成的，消化道合成的MYP蛋白需經(jīng)體腔中營養(yǎng)吞噬細(xì)胞運輸至性腺并以卵黃小體的形式貯存起來[29-30]。體內(nèi)氧化水平過高會導(dǎo)致MYP蛋白或營養(yǎng)吞噬細(xì)胞功能發(fā)生改變，從而導(dǎo)致MYP蛋白不能正常轉(zhuǎn)運至性腺組織。但是，本研究中并未測定海膽體內(nèi)抗氧化水平和體腔液中MYP的含量，上述推測還需要進(jìn)一步驗證。

3.3他莫西芬可促進(jìn)膽固醇的合成

本試驗中，他莫西芬組海膽體內(nèi)膽固醇含量高于對照組。膽固醇和三酰甘油等脂質(zhì)在肝細(xì)胞內(nèi)聚集被認(rèn)為是非酒精性脂肪肝病(NAFLD)發(fā)生的前提和必要條件[31]。Cole等[32]分別用他莫昔芬(0.5 mg/kg)或芝麻油對小鼠Musmusculus連續(xù)注射5 d，結(jié)果顯示，與對照組相比，他莫昔芬組小鼠肝臟三酰甘油的量增加了72%，說明他莫昔芬短期處理可誘導(dǎo)小鼠肝臟脂肪變性，引起NAFLD。這表明他莫西芬會造成動物體內(nèi)膽固醇和三酯酰甘油含量的升高，同時說明雌二醇在體內(nèi)脂肪代謝過程中發(fā)揮著重要作用。國內(nèi)外相關(guān)研究表明，在利用他莫西芬治療卵巢癌等疾病的過程中會造成患者體內(nèi)膽固醇和三酯酰甘油含量的升高，進(jìn)而增加了其患糖尿病和NAFLD等疾病的風(fēng)險。Sun等[33]在22257例乳腺癌患者的研究中發(fā)現(xiàn)，相對于未使用他莫昔芬的乳腺癌患者組，他莫昔芬治療組的乳腺癌患者的糖尿病發(fā)病風(fēng)險顯著提高。此外，長期使用他莫昔芬治療會增加人體新陳代謝紊亂，引起并提高女性NAFLD的發(fā)病率[34]。

3.4睪酮與雌二醇之間存在穩(wěn)態(tài)關(guān)系

當(dāng)海膽體內(nèi)雌二醇含量增加時，睪酮含量也隨之增加，這說明海膽可通過自身調(diào)節(jié)來保持體內(nèi)睪酮與雌二醇間的穩(wěn)態(tài)。動物體內(nèi)睪酮與雌二醇間的穩(wěn)態(tài)對于動物正常生長和繁殖至關(guān)重要。Shang等[35]研究發(fā)現(xiàn)，睪酮和雌二醇兩種類固醇激素的比率變化會顯著影響斑馬魚類性腺發(fā)育和配子發(fā)生。袁漢文[36]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)飼料中雌二醇添加量為20 mg/kg時，在15個月內(nèi)，黃鱔幼苗血清中雌二醇和睪酮濃度的變化規(guī)律基本一致。Park等[37]研究發(fā)現(xiàn)，向斑紋隱小鳉魚腹腔注射甲基睪酮，連續(xù)注射7 d后鳉魚血清中雌二醇的濃度均有小幅度的升高。

綜上所述，外源性的雌二醇會促進(jìn)主要卵黃蛋白的合成，提高中間球海膽性腺指數(shù)，提高其性腺和體腔液中膽固醇和性激素的含量，對膽固醇的合成與分解過程具有顯著影響。

[1] 常亞青,丁君,宋堅,等.海參、海膽生物學(xué)研究與養(yǎng)殖[M].北京:海洋出版社,2004.

[2] 王子臣,常亞青.經(jīng)濟(jì)類海膽增養(yǎng)殖研究進(jìn)展及前景[J].海洋科學(xué),1997,21(6):20-22.

[3] 韓奮杰,張偉杰,秦宇博,等.中間球海膽幼體及稚海膽生長性狀的遺傳參數(shù)估計[J].大連海洋大學(xué)學(xué)報，2017，32(2)：145-149.

[4] 侯受權(quán)，左然濤，常亞青，等.飼料脂肪水平對中間球海膽幼膽生長、消化酶和熱脅迫后抗氧化酶活力的影響[J].大連海洋大學(xué)學(xué)報，2016，31(5)：538-543.

[5] 左然濤,侯受權(quán),常亞青,等.海膽營養(yǎng)生理研究進(jìn)展[J].大連海洋大學(xué)學(xué)報，2016，31(4)：463-468.

[6] 溫茹淑,方展強,江世貴,等.17β-雌二醇對劍尾魚卵黃蛋白原的誘導(dǎo)研究[J].中國實驗動物學(xué)報,2007,15(4):280-284.

[7] Matozzo V,Marin M G.Can 17-β estradiol induce vitellogenin-like proteins in the clamTapesphilippinarum?[J].Environmental Toxicology and Pharmacology,2008,26(1):38-44.

[8] Schoenmakers H J N,Dieleman S J.Progesterone and estrone levels in the ovaries,pyloric ceca,and perivisceral fluid during the annual reproductive cycle of starfish,Asteriasrubens[J].General and Comparative Endocrinology,1981,43(1):63-70.

[9] Harrington F E,Easton D P.A putative precursor to the major yolk protein of the sea urchin[J].Developmental Biology,1982,94(2):505-508.

[10] Kari B E,Rottmann W L.Analysis of changes in a yolk glycoprotein complex in the developing sea urchin embryo[J].Developmental Biology,1985,108(1):18-25.

[11] Yokota Y,Kato K H.Degradation of yolk proteins in sea urchin eggs and embryos[J].Cell Differentiation,1988,23(3):191-199.

[12] Scott L B, Lennarz W J.Structure of a major yolk glycoprotein and its processing pathway by limited proteolysis are conserved in echinoids[J].Developmental Biology,1989,132(1):91-102.

[13] Shyu A B,Blumenthal T.Expression of the vitellogenin gene in female and male sea urchin[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States,1986,83(11):3865-3869.

[14] Unuma T,Suzuki T,Kurokawa T,et al.A protein identical to the yolk protein is stored in the testis in male red sea urchinPseudocentrotusdepressus[J].The Biological Bulletin,1998,194(1):92-97.

[15] Brooks J M,Wessel G M.Selective transport and packaging of the major yolk protein in the sea urchin[J].Developmental Biology,2003,261(2):353-370.

[16] Harrington F E,Ozaki H.The effect of estrogen on protein synthesis in echinoid coelomocytes[J].Comparative Biochemistry and Physiology Part B:Comparative Biochemistry,1986,84(3):417-421.

[17] Wasson K M,Gower B A,Watts S A.Responses of ovaries and testes ofLytechinusvariegatus(Echinodermata:Echinoidea) to dietary administration of estradiol,progesterone and testosterone[J].Marine Biology,2000,137(2):245-255.

[18] 仇雪梅，吳領(lǐng)知，郭曉黎，等.蝦夷馬糞海膽CYP51基因cDNA的克隆及其SNPs分析[J]. 大連海洋大學(xué)學(xué)報，2012，27(4)：294-299

[19] 郭曉黎，仇雪梅，常亞青，等.蝦夷馬糞海膽CYP17基因的克隆及其表達(dá)差異[J]. 大連海洋大學(xué)學(xué)報，2013，28(1)：1-6.

[20] 李曉詩,呂青,陳潔,等.他莫昔芬的藥理作用機制及其對卵巢功能的影響[J].中國普外基礎(chǔ)與臨床雜志,2015,22(11):1397-1404.

[21] 周遵春,包振民,董穎,等.MYP基因在中間球海膽及雜交海膽生殖腺不同發(fā)育時期的轉(zhuǎn)錄表達(dá)差異[J].遺傳,2008,30(11):1453-1458.

[22] 秦艷杰,孫博林,李霞,等.饑餓對中間球海膽MYP基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響[J].生態(tài)學(xué)報,2012,32(6):1755-1761.

[23] 陳家長,王澤镕,瞿建宏,等.17β-雌二醇與1-萘酚對雄性羅非魚(GIFTOreochromisniloticus)雌激素效應(yīng)的比較[J].生態(tài)環(huán)境學(xué)報,2012,21(4):754-759.

[24] Li Qi,Osada M,Suzuki T,et al.Changes in vitellin during oogenesis and effect of estradiol-17β on vitellogenesis in the Pacific oysterCrassostreagigas[J].Invertebrate Reproduction & Development,1998,33(1):87-93.

[25] Osada M,Takamura T,Sato H,et al.Vitellogenin synthesis in the ovary of scallop,Patinopectenyessoensis:control by estradiol-17β and the central nervous system[J].Journal of Experimental Zoology Part A:Comparative Experimental Biology,2003,299A(2):172-179.

[26] Zhao Yue,Lang G,Ito S,et al.A TFTC/STAGA module mediates histone H2A and H2B deubiquitination,coactivates nuclear receptors,and counteracts heterochromatin silencing[J].Molecular Cell,2008,29(1):92-101.

[27] Wang Chunde,Croll R P.Estrogen binding sites in the sea scallop:characterization and possible involvement in reproductive regulation[J].Comparative Biochemistry and Physiology Part B:Biochemistry and Molecular Biology,2007,148(3):303-313.

[28] Wang C,Croll R P.Effects of sex steroids on in vitro gamete release in the sea scallop,Placopectenmagellanicus[J].Invertebrate Reproduction & Development,2003,44(2-3):89-100.

[29] Unuma T,Okamoto H,Konishi K,et al.Cloning of cDNA encoding vitellogenin and its expression in red sea urchin,Pseudocentrotusdepressus[J].Zoological Science,2001,18(4):559-565.

[30] Shyu A B,Blumenthal T,Raff R A.A single gene encoding vitellogenin in the sea urchinStrongylocentrotuspurpuratus:sequence at the 5′end[J].Nucleic Acids Research,1987,15(24):10405-10417.

[31] Puri P,Baillie R A,Wiest M M,et al.A lipidomic analysis of nonalcoholic fatty liver disease[J].Hepatology,2007,46(4):1081-1090.

[32] Cole L K,Jacobs R L,Vance D E.Tamoxifen induces triacylglycerol accumulation in the mouse liver by activation of fatty acid synthesis[J].Hepatology,2010,52(4):1258-1265.

[33] Sun L M,Chen H J,Liang J A,et al.Association of tamoxifen use and increased diabetes among Asian women diagnosed with breast cancer[J].British Journal of Cancer,2014,111(9):1836-1842.

[34] Bruno S,Maisonneuve P,Castellana P,et al.Incidence and risk factors for non-alcoholic steatohepatitis:prospective study of 5408 women enrolled in Italian tamoxifen chemoprevention trial[J].British Medical Journal,2005,330(7497):932-935.

[35] Shang E H H,Yu R M K,Wu R S S.Hypoxia affects sex differentiation and development,leading to a male-dominated population in zebrafish (Daniorerio)[J].Environmental Science & Technology,2006,40(9):3118-3122.

[36] 袁漢文.不同外源因子對黃鱔性逆轉(zhuǎn)的影響研究[D].武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué),2011.

[37] Park C B,Soyano K,Kiros S,et al.Transient effects of methyltestosterone injection on different reproductive parameters of the hermaphrodite fishKryptolebiasmarmoratus[J].Ecotoxicology,2013,22(7):1145-1154.

Effectsof17β-estradiolongrowth,gonadaldevelopmentandcholesterolmetabolisminseaurchinStrongylocentrotusintermedius

Lü De-liang1, LI Min1, WU Fan-xiu2, ZUO Ran-tao1, CHANG Ya-qing1

(1.Key Laboratory of Mariculture & Stock Enhancement in North China’s Sea, Ministry of Agriculture, Dalian Ocean University, Dalian 116023, China; 2.The National Fisheries Technology Extension Center, China Fisheries Society, Beijing 100125, China)

Sea urchinStrongylocentrotusintermediuswith body weight of (13.58±0.79)g reared in a 200 L tank in a laboratory were injected with 17β-estradiol (5 μg/mL), tamoxifen (inhibitor of estradiol receptor) (25 μg/mL) or sunflower oil (as control group ) once every 3 days, and weight gain rate (WGR), gonado-somatic index (GSI), gonadal hormone content related to development, and expression of cholesterol synthase-related genes were analyzed 30 d and 60 d after administration to investigate the effects of estradiol on growth performance, gonad development and cholesterol metabolism in sea urchin. The results showed that there was no significant difference in weight gain rate among the three treatments (P>0.05). However, statistical significance was detected in GSI among three treatments, with the maximum in the sea urchins injected with 17β-estradiol at the end of the experiment (P<0.05). There were significantly higher estradiol concentration in the coelomic fluid in the sea urchin in the estradiol and tamoxifen groups than that in the control group (P<0.05). The estradiol concentration in the gonad was significantly higher in sea urchin in the estradiol group than that in the control and tamoxifen groups (P<0.05).The higher transcription of major yolk protein (MYP) in both gonad and digestive tract was observed in the sea urchin injected with 17β-estradiol than that in the other groups (P>0.05). Similarly, there were significantly higher expressions ofCYP17 andCYP51 gene in the gonad and digestive tract in the sea urchins injected with estradiol and tamoxifen than that in the control group. It is concluded that estradiol has positively promoting effects on the gonado-somatic index, estradiol concentration and expression of the genes related to estradiol synthesis. The findings could contribute to elucidate the mechanism of estradiol regulating the gonad development of sea urchins.

Strongylocentrotusintermedius; steroid hormone; gene expression; gonadal development

10.16535/j.cnki.dlhyxb.2017.05.001

2095-1388(2017)05-0501-08

S917

A

2017-08-28

國家自然科學(xué)基金資助項目(41606180)；中國科協(xié)“青年人才托舉工程”研究項目(YESS20150157)

呂德亮(1992—)，男，碩士研究生。E-mail：nalanqingzhu@126.com

左然濤(1985—)，男，博士，講師。E-mail：rtzuo@dlou.edu.cn