王婷婷， 馬詩淳， 孫照勇， 譚 力 ， 湯岳琴， 木田建次

(1.四川大學(xué) 建筑與環(huán)境學(xué)院， 成都 610065； 2.農(nóng)業(yè)部可再生能源開發(fā)與利用重點實驗室， 成都 610041)

項目來源： 瀘州市科技支撐計劃(2015CDLZ-S06)； 農(nóng)業(yè)部農(nóng)村可再生能源開發(fā)利用重點實驗室開放研究課題基金資助City (2015CDLZ-S06)

酶添加對釀酒廢糟干式厭氧消化產(chǎn)沼氣效果的影響

王婷婷1， 馬詩淳2， 孫照勇1， 譚 力1， 湯岳琴1， 木田建次1

(1.四川大學(xué) 建筑與環(huán)境學(xué)院， 成都 610065； 2.農(nóng)業(yè)部可再生能源開發(fā)與利用重點實驗室， 成都 610041)

釀酒廢糟是白酒生產(chǎn)過程的主要副產(chǎn)物，其處理及資源化利用是亟待解決的問題。該研究擬采用干式厭氧消化技術(shù)處理日益增加的釀酒廢糟，同時生產(chǎn)生物能源沼氣。為了提高沼氣產(chǎn)量，探討了酶添加對釀酒廢糟高溫干式厭氧消化效果的影響，并監(jiān)測了厭氧消化過程中污泥pH值, 有機酸(volatile fatty acids, VFAs)，可溶性有機碳(soluble total organic carbon, TOC)等系統(tǒng)參數(shù)的變化情況。結(jié)果表明，直接利用釀酒廢糟進行干式厭氧消化，系統(tǒng)啟動初期有有機酸積累，穩(wěn)定發(fā)酵條件下的沼氣產(chǎn)量約為270.7 mL·g-1VS。向釀酒廢糟厭氧消化過程中添加淀粉酶、糖化酶和纖維素酶能夠顯著促進沼氣產(chǎn)量，沼氣產(chǎn)率提高到337.6 mL·g-1VS，有機酸濃度保持在較低的水平。分別對兩體系中細(xì)菌和古菌16S rRNA基因進行定量PCR，結(jié)果表明，酶添加體系同對照相比參與厭氧消化過程的微生物數(shù)量顯著增加。

釀酒廢糟； 厭氧消化； 沼氣； 酶添加； 定量PCR

我國白酒的釀造過程是世界上獨特的釀酒工藝—采用固態(tài)發(fā)酵和固態(tài)蒸餾操作。釀酒廢糟(FGW, fermented grain waste)作為白酒釀造過程的主要副產(chǎn)品，每年的產(chǎn)生量達到2500萬噸[1]。釀酒廢糟的含水率達50%～60%，殘留著許多未被完全利用的淀粉、蛋白質(zhì)、氨基酸和礦物元素等，其營養(yǎng)物質(zhì)豐富，極易腐敗變質(zhì)，不易儲存[2]。傳統(tǒng)的處理方法主要是將其烘干以后同煤炭一起燃燒產(chǎn)生蒸汽，但是由于釀酒廢糟的高含水量，直接燃燒的方法能量產(chǎn)出較低，同時燃燒過程中易產(chǎn)生大量灰塵和有毒氣體，容易造成二次污染[3]。因此，有必要尋求一種對環(huán)境友好的方法處理釀酒廢糟。

利用廢棄生物質(zhì)進行厭氧消化產(chǎn)沼氣既是一種有效處理有機廢棄物的方式，同時還能獲得可再生能源沼氣，現(xiàn)已在世界范圍內(nèi)被廣泛應(yīng)用[4]。在國務(wù)院印發(fā)的“十二五”國家戰(zhàn)略性新興發(fā)展規(guī)劃中有關(guān)生物質(zhì)能產(chǎn)業(yè)的發(fā)展目標(biāo)中，到2015年生物燃?xì)饽昀昧恳_到300億立方米，到2020年沼氣產(chǎn)量將提高到500億立方米。相對于濕式厭氧消化，干式厭氧消化技術(shù)(固含量≥15%)的優(yōu)勢在于較小的反應(yīng)器體積以及較少的能量投入[5]。對于含水率相對較低的原料(如釀酒廢糟)，采用干式厭氧消化能夠避免由于過多水的添加導(dǎo)致原料處理量過大的問題。盡管已有一些利用濕式厭氧消化技術(shù)將釀酒廢糟轉(zhuǎn)化為沼氣的實驗研究[6,7]，目前尚未有直接利用釀酒廢糟進行高溫干式厭氧消化產(chǎn)沼氣的報道。

釀酒廢糟成分中含有較高的纖維素、半纖維素以及木質(zhì)素(總量約占60%)，水解步驟是其厭氧消化產(chǎn)甲烷過程的主要限速階段。通過酶添加可能促進底物的降解便于微生物對底物的利用，例如添加淀粉酶可能促進淀粉的降解，添加纖維素酶和糖化酶則可能促進纖維素和其他多糖類物質(zhì)的水解[8]。因此，本研究以釀酒廢糟為原料，研究其通過高溫干式厭氧消化技術(shù)產(chǎn)沼氣的潛力，對比研究了添加酶對釀酒廢糟沼氣產(chǎn)量的提升效果，結(jié)合發(fā)酵過程中的pH值，有機酸(VFAs)及可溶性有機碳(TOC)等參數(shù)對發(fā)酵系統(tǒng)穩(wěn)定性進行研究，同時利用熒光定量PCR技術(shù)檢測了釀酒廢糟干式厭氧消化過程中微生物數(shù)量的變化，以期為釀酒廢糟的資源化利用提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 原料和接種污泥

釀酒廢糟來自四川省內(nèi)某酒廠，經(jīng)粉碎機(Masuko Sangyo，Saitama，日本)粉碎至2～3mm，放置于4 ℃冰箱冷藏用于后續(xù)實驗。釀酒廢糟的主要成分含量如表1所示。實驗中種子污泥來自使用合成培養(yǎng)基(報紙、狗糧、復(fù)印紙和水)長期馴化的實驗室規(guī)模高溫干式厭氧消化體系[9]。

表1 釀酒廢糟的基本理化性質(zhì)

注：DM: 干重。

1.1.2 酶

耐高溫α-淀粉酶和糖化酶購自四川山野公司，酶活分別為81,051 U·mL-1和11,681 U·mL1。纖維素酶(CTec-2)由丹麥諾維信公司提供，其濾紙酶活為130 FPU·mL-1。

1.2 實驗方法

采用5 L的發(fā)酵罐(separable flask，SIBATA，日本)為干式厭氧消化反應(yīng)器。系統(tǒng)啟動時，粉碎的釀酒廢糟作為底物加入到3 kg種子污泥中，用手充分混勻后放入發(fā)酵罐中，充氮氣10分鐘以置換反應(yīng)器上部空氣，然后將反應(yīng)罐密封并放入52 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。以1周(7天)為一個周期進行手動取樣并補加原料，通過添加自來水來維持反應(yīng)器內(nèi)約20%的固含量。沼氣產(chǎn)量通過反應(yīng)罐蓋子頂部的膠管連接氣體流量計(MGC-1 V3.2 PVDF，Ritter，德國)進行記錄，每周補料前取約50 g反應(yīng)器內(nèi)的消化污泥進行理化性質(zhì)及微生物定量分析。

實驗分別同時運行了兩個反應(yīng)器R1和R2。R1反應(yīng)器以釀酒廢糟為底物進行干式厭氧消化；R2反應(yīng)器以釀酒廢糟為底物同時添加酶進行干式厭氧消化，其中耐高溫α-淀粉酶、糖化酶和纖維素酶的添加量分別為13.4 U·g-1釀酒廢糟, 4.9 U·g-1釀酒廢糟及0.8 FPU·g-1釀酒廢糟(酶添加量根據(jù)預(yù)實驗確定)。兩個反應(yīng)器在有機負(fù)荷均為1 gVS·kg-1d-1的條件下共運行了71周。

1.3 微生物熒光定量PCR(qPCR)分析

對R1和R2反應(yīng)器內(nèi)消化污泥分別于第21周，第36周，第49周和第69周進行取樣，分別命名為A，B，C和D。使用FastDNATMSPIN Kit for Soil(MP Biomedicals，OH，美國)試劑盒抽提基因組總DNA，用分光光度計(NanoDrop 2000，Thermo，日本)檢測基因組DNA的濃度和質(zhì)量。定量PCR使用的儀器為LightCycler(Roche Diagnostics，Mannheim，德國)，采用的引物如表2所示，定量PCR操作方法參見Sun等[10]。通過PCR擴增得到的基因片段使用UltraClean PCR-Up試劑盒(MO BIO Laboratories，Carlsbad，美國)進行純化，然后通過pMD 19-T Vector kit導(dǎo)入質(zhì)粒；然后將連接產(chǎn)物按操作說明導(dǎo)入Escherichiacoli5α。按照Zeng[11]等的方法提取質(zhì)粒并且構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。微生物的數(shù)量用每千克干物質(zhì)的基因拷貝數(shù)來表達(copy numbers·kg-1TS)。

表2 定量PCR引物

1.4 分析方法

2 結(jié)果和討論

2.1 釀酒廢糟干式厭氧消化反應(yīng)器性能評價

2.1.1 干式厭氧消化的產(chǎn)氣情況

在厭氧消化過程中，釀酒廢糟中的有機物在微生物的作用下降解轉(zhuǎn)化為沼氣。因此，沼氣的產(chǎn)量可以直接反映系統(tǒng)的運行狀態(tài)。兩個反應(yīng)器產(chǎn)氣情況如圖1所示。兩反應(yīng)器分別運行了71周，R1前8周產(chǎn)氣量波動較大，這一階段可能為微生物對釀酒廢糟原料的適應(yīng)期；第9周到39周產(chǎn)氣波動逐漸減小，第46周開始產(chǎn)氣量趨于穩(wěn)定，穩(wěn)定狀態(tài)下的平均產(chǎn)氣量約為270.7 mL·g-1VS，其中甲烷產(chǎn)率為139.4 mL·g-1VS。R2反應(yīng)器啟動初期沼氣產(chǎn)量雖然也有小幅波動，但波動相對于R1較小，并于35周產(chǎn)氣量開始趨于穩(wěn)定，從第29周開始，R2的產(chǎn)氣量持續(xù)高于R1，一直到第71周結(jié)束。R2反應(yīng)器穩(wěn)定狀態(tài)下的平均沼氣產(chǎn)量約為337.6 mL·g-1VS，其中甲烷產(chǎn)率為190.7 mL·g-1VS。這說明，在52 ℃條件下的干式厭氧消化過程中，添加酶有利于釀酒廢糟中有機物的降解，增加了微生物對有機物的利用，最終導(dǎo)致R2的沼氣產(chǎn)量比R1增加了24.7%，甲烷產(chǎn)率增加了36.8%。從釀酒廢糟成分可知，它是典型的木質(zhì)纖維素原料，主要成分包括纖維素，半纖維素以及木質(zhì)素，三者互相纏繞形成了復(fù)雜且難降解的結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性導(dǎo)致釀酒廢糟的水解成為厭氧消化過程中的限速步驟，限制了釀酒廢糟的沼氣產(chǎn)量，因此直接利用釀酒廢糟作為干式厭氧消化的底物時產(chǎn)氣量相對較低；而添加酶的干式厭氧消化過程中，通過酶的作用(如糖化作用)可將難降解的物質(zhì)如纖維素、半纖維素轉(zhuǎn)化為易降解的小分子糖類物質(zhì)以易于發(fā)酵微生物利用，從而提高了沼氣產(chǎn)量。

圖1 釀酒廢糟作為底物的干式厭氧消化(R1)及添加酶的干式厭氧消化(R2)沼氣產(chǎn)率的變化情況

2.1.2 干式厭氧消化反應(yīng)器內(nèi)污泥的理化性質(zhì)變化

圖2～圖3顯示了反應(yīng)器內(nèi)污泥樣品的pH值和VFAs(包括乳酸，乙酸和丙酸)的變化；圖4顯示了污泥樣品TOC的變化。反應(yīng)器內(nèi)適宜的pH值范圍是厭氧消化順利進行的重要環(huán)境條件。從圖2和圖3可以看出，兩個反應(yīng)器的pH值總體保持穩(wěn)定，污泥的pH值變化范圍在8.2～8.8之間，處于適宜微生物生長的范圍。釀酒廢糟原料中有較高含量的有機酸，尤其是乳酸[3]，因此釀酒廢糟pH值較低(pH值約為3.5)；而作為干式厭氧消化底物時，這些有機酸被轉(zhuǎn)化，使反應(yīng)器內(nèi)pH值維持適宜水平。

從圖2可知，R1反應(yīng)器啟動前11周，有機酸濃度維持較高的水平，第6周時達到峰值，約2920 mg·kg-1。隨著厭氧消化過程的進行，有機酸濃度迅速降低，到第15周后有機酸濃度降至500 mg·kg-1以下，并一直維持到第71周結(jié)束。反應(yīng)器啟動初期有機酸成分主要是丙酸和乙酸，其峰值分別為2261 mg·kg-1和652 mg·kg-1。高濃度的丙酸對厭氧過程有抑制作用，Pullammanappallil[14]等研究認(rèn)為丙酸濃度在3000 mg-1左右會產(chǎn)生抑制，可知釀酒廢糟干式厭氧消化過程中并未受到丙酸抑制。開始階段有機酸的積累可能和原料本身較高的有機酸含量有關(guān)，而且體系在適應(yīng)釀酒廢糟原料時微生物活性相對較低。同R1啟動初期較高的有機酸濃度相比，R2反應(yīng)器的有機酸濃度始終維持在低于1000 mg·kg-1的水平，且波動較小(見圖3)。

圖2 釀酒廢糟作為底物的干式厭氧消化(R1)的pH值及VFA變化

圖3 釀酒廢糟作為底物添加酶的干式厭氧消化(R2)的pH值及VFA變化

圖4 釀酒廢糟作為底物的干式厭氧消化(R1)及添加酶的同步糖化干式厭氧消化(R2)的TOC變化

另外，筆者對兩個反應(yīng)器后期穩(wěn)定狀態(tài)下的消化污泥殘渣進行了成分分析(見表3)。R2反應(yīng)器消化污泥殘渣中的有機物(74.8%)和半纖維素成分(4.6%)均較R1低，纖維素和木質(zhì)素含量差別不大，兩個反應(yīng)器內(nèi)均沒有檢測到淀粉的殘留。這一現(xiàn)象說明，同對照組R1相比，添加酶促進了微生物對釀酒廢糟中有機物的利用，尤其是促進了半纖維素的降解。另外，從表3可知，R2消化污泥中蛋白質(zhì)含量較R1高。這可能是微生物將原料中的粗蛋白分解為小分子物質(zhì)，并進一步利用這些物質(zhì)合成自身蛋白用于細(xì)胞生長[16]。因此在干式厭氧消化過程中，可能更多的菌體細(xì)胞蛋白被合成，導(dǎo)致R2消化污泥殘渣中蛋白質(zhì)含量較高。

2.2 干式厭氧消化反應(yīng)器內(nèi)微生物的熒光定量PCR分析

選取R1和R2體系的第21(A)，36(B)，49(C)和69(D)周污泥樣品進行熒光定量分析兩系統(tǒng)內(nèi)細(xì)菌和古菌的數(shù)量，結(jié)果如圖5～圖6所示。對于兩個反應(yīng)器來說，細(xì)菌和古菌16S rRNA基因的拷貝數(shù)分別在1013～1014和1012～1013數(shù)量級范圍，這與Huang[17]等在蒸餾殘渣的高溫干式厭氧消化反應(yīng)器內(nèi)檢測到的細(xì)菌和古菌16S rRNA基因的數(shù)量級相近。穩(wěn)定時期(C和D取樣期間)，R2樣品中細(xì)菌和古菌16S rRNA基因的拷貝數(shù)分別為5.8～6.9×1013拷貝數(shù)·kg-1TS和3.8～6.9×1012拷貝數(shù)·kg-1TS，高于同期R1中的微生物數(shù)量。系統(tǒng)穩(wěn)定狀態(tài)下微生物數(shù)量的增加也進一步解釋了R2反應(yīng)器產(chǎn)氣量明顯高于R1的原因。

表3 干式厭氧消化反應(yīng)器內(nèi)消化污泥殘渣的基本理化性質(zhì)

注：ND: 未檢測到。

圖5 釀酒廢糟作為底物的干式厭氧消化(R1)及添加酶的同步糖化干式厭氧消化(R2)細(xì)菌定量PCR結(jié)果

圖6 釀酒廢糟作為底物的干式厭氧消化(R1)及添加酶的同步糖化干式厭氧消化(R2)古菌定量PCR結(jié)果

3 結(jié)論

綜上可知，采用高溫干式厭氧消化技術(shù)處理釀酒廢糟且回收能源沼氣是可行的。結(jié)果表明，利用釀酒廢糟為底物進行干式厭氧消化，系統(tǒng)可以穩(wěn)定運行。干式厭氧消化過程中酶添加能提高甲烷產(chǎn)率達36.8%。同釀酒廢糟直接進行干式厭氧消化相比，添加酶對參與厭氧消化過程的微生物數(shù)量的增加也有促進作用。

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EffectsofEnzymeAdditiononPerformanceofDryBiogasFermentationofVinasse

/WANGTing-ting1,MAShi-chun2,SUNZhao-yong1,TANLi1,TANGYue-qin1，KIDAKenji1

/(1.CollegeofArchitectureandEnvironment,SichuanUniversity,Chengdu610065,China； 2.KeyLaboratoryofDevelopmentandApplicationofRuralRenewableEnergy,MinistryofAgriculture,Chengdu610041,China)

Vinasse is the major by-products in liquor production. To reduce the negative impact on environment, a process was developed to convert vinasse to biogas via dry methane fermentation. The dry methane fermentation of vinasse with or without enzymes addition were experimented in lab-scale, and the process parameters including pH, VFAs and TOC concentrations were evaluated. The results showed that VFAs accumulation was observed during the starting-up period, The biogas yield of 270.7 mL·g-1VS was obtained with vinasse without enzymes addition. Enzymes addition improved the biogas production to 337.6 mL·g-1VS, and the VFAs concentrations always kept at a low level. The real-time quantitative PCR of 16S rRNA of microbes indicated that enzymes addition could increase the numbers of microorganisms involved in anaerobic digestion process

vinasse; anaerobic digestion; biogas; enzyme addition; quantitative PCR

2016-10-11

王婷婷(1990-)，女，漢族，四川內(nèi)江人，在讀博士，主要研究方向為有機廢棄物資源化利用，E-mail: wangtingting_scu@foxmail.com

孫照勇，E-mail: szy@scu.edu.cn

S216.4; X703

A

1000-1166(2017)05-0009-06