任謂明 ， 孫 銘 ， 葉 明 ， 趙 丹

(1．吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)部參茸產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心 ， 吉林 長春 130118 ； 2.吉林省通化市動物疫病預(yù)防控制中心 ，吉林 通化 134001 ； 3.吉林特研生物技術(shù)有限責(zé)任公司 ， 吉林 長春 130122)

犬細(xì)小病毒敦化株的分離與鑒定

任謂明1， 孫 銘2， 葉 明3， 趙 丹1

(1．吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)部參茸產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心 ， 吉林 長春 130118 ； 2.吉林省通化市動物疫病預(yù)防控制中心 ，吉林 通化 134001 ； 3.吉林特研生物技術(shù)有限責(zé)任公司 ， 吉林 長春 130122)

為了豐富我國延邊地區(qū)犬細(xì)小病毒流行病學(xué)研究資料，為進(jìn)一步研究有效的疫苗及診斷試劑做前期基礎(chǔ)工作。采集延邊州敦化市地區(qū)疑似犬細(xì)小病毒感染病犬的糞便樣品，經(jīng)過預(yù)處理后同步接種貓腎細(xì)胞(F81)，盲傳至細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變，經(jīng)形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)等方法進(jìn)行分析鑒定。結(jié)果：分離到的病毒可使F81細(xì)胞出現(xiàn)特異性病變、電鏡下可見清晰的病毒粒子、其培養(yǎng)物可使紅細(xì)胞發(fā)生凝集且能被特異性陽性血清所抑制、用特異性引物進(jìn)行PCR檢測結(jié)果呈陽性、免疫熒光試驗可見培養(yǎng)物出現(xiàn)特異性綠色熒光，針對其VP2序列建立的進(jìn)化樹顯示其與new CPV-2b型犬細(xì)小病毒有較高的同源性。結(jié)論：通過上述試驗確定分離出1株犬細(xì)小病毒，分離的病毒為new CPV-2b型，命名CPV-DH-3株。

犬細(xì)小病毒 ； CPV-DH-3株 ； 分離 ； 鑒定

犬細(xì)小病毒(CPV)屬于細(xì)小病毒科，細(xì)小病毒屬，無囊膜自主復(fù)制的單股負(fù)鏈線性DNA病毒。CPV可引起犬細(xì)小病毒病和非化膿性心肌炎，該病具有發(fā)病率高、傳染性強(qiáng)、病死率高的特點，是危害我國乃至世界養(yǎng)犬業(yè)最為嚴(yán)重的傳染病之一。犬細(xì)小病毒在世界范圍內(nèi)廣泛傳播，該病毒于1978年首次報道，此后不斷有新的變異株被發(fā)現(xiàn)，感染動物由最初的犬科動物擴(kuò)展到貓科動物，引起嚴(yán)重的傳染性出血性腸炎和心肌炎。犬細(xì)小病毒致病株為CPV-2型，其經(jīng)過多年的衍變已經(jīng)變異出多種亞型(CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c等)，不同毒株間抗原性、致病性及宿主范圍有所差異。本研究從延邊敦化地區(qū)分離出1株犬細(xì)小病毒，通過細(xì)胞病變、PCR、電鏡、免疫熒光、血凝及血凝抑制、VP2基因序列分析等多種方法進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)分離毒株為new CPV-2b型，這為研制適合延邊地區(qū)犬細(xì)小病毒毒株的疫苗和高免血清以及后續(xù)研究提供必要條件。

1 材料與方法

1.1 材料 2016年3月采集自吉林省延邊朝鮮族自治州敦化市某肉狗廠病犬。該犬臨床表現(xiàn)癥狀為發(fā)熱、厭食、嘔吐、嚴(yán)重腹瀉。采用拭子擦拭病犬肛門處殘留排泄物后，將糞便拭子迅速放入每支含有2 mL含有100 IU(μg)/mL雙抗的PBS的離心管中，于-80 ℃凍存?zhèn)溆肹1-2]。

1.2 細(xì)胞系、抗體 貓腎細(xì)胞(F81)由本實驗室保存，CPV直接免疫熒光抗體，購自VMRD公司。

1.3 主要試劑 胎牛血清、MEM，購自GIBCO公司；Taq酶、dNTP等，購自天根生化科技(北京)有限公司；CPV-a型、CPV-b型單克隆抗體：由實驗室制備并保存。

1.4 病料的處理與病毒的分離 將病料反復(fù)凍融3次，用無菌鑷子將糞便拭子上的液體擠干。 10 000 r/min(4 ℃)離心30 min后，取上清，用0.22 μm濾器過濾，分裝到無菌EP管中，凍存于-80 ℃冰箱，備用。采用同步接毒法，將500 μL待分離病毒樣品接種于F81細(xì)胞。于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，同時設(shè)正常細(xì)胞對照。培養(yǎng)期間，每日觀察細(xì)胞病變(CPE)。連續(xù)盲傳3代，細(xì)胞出現(xiàn)明顯CPE，將培養(yǎng)物反復(fù)凍融3次，10 000r/min(4 ℃)離心30 min后，取上清，繼續(xù)接種F81細(xì)胞，待F81細(xì)胞出現(xiàn)80%～90%CPE時收毒，凍存于-80 ℃冰箱，備用[3]。

1.5 病毒鑒定

1.5.1 形態(tài)學(xué)鑒定 病毒形態(tài)學(xué)鑒定采用電鏡負(fù)染技術(shù)對第5代F81細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行觀察，詳細(xì)操作方法見文獻(xiàn)[4]。

1.5.2 直接免疫熒光試驗 在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板接種F81細(xì)胞，同步接種1/10體積的病毒液。培養(yǎng)72 h后，棄去上清，連同正常細(xì)胞對照，用PBS洗3次，后加入100 μL預(yù)冷(-20 ℃)的80%丙酮固定液，于4 ℃固定30 min，后用PBS洗3次，加入CPV直接免疫熒光抗體，放入避光濕盒內(nèi)，于37 ℃，反應(yīng)30 min。[5]

1.5.3 血凝特性鑒定 采用微量血凝及血凝抑制試驗對分離毒株的細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行分離毒株的血凝特性鑒定。[6]

1.5.4 引物設(shè)計、PCR擴(kuò)增及VP2序列分析 根據(jù)GenBank已公布的犬細(xì)小病毒序列利用生物學(xué)軟件設(shè)計合成2對引物，1對引物作為犬細(xì)小病毒特異性鑒定引物，另1對引物為VP2基因擴(kuò)增引物。將擴(kuò)增后的VP2基因做膠回收后克隆于T載體，鑒定后挑選陽性克隆進(jìn)行測序，將測序結(jié)果與參考序列進(jìn)行分析比對后建立進(jìn)化樹進(jìn)一步分析。本研究所用引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，生物學(xué)分析軟件為MEGA 6.0[7]。

1.5.5 單抗試驗 將病毒液分別與等體積的CPV-a型和CPV-b型單克隆抗體混合，于37 ℃中和1 h后，分別接種于F81細(xì)胞，于37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)4 d。同時設(shè)正常細(xì)胞、病毒對照。

1.5.6 病毒理化性質(zhì)鑒定 對所分離病毒的細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行理化特性鑒定。分別對病毒的耐熱特性、耐有機(jī)溶劑特性、耐酸堿特性等進(jìn)行鑒定。同時每組處理病毒分別設(shè)立不作處理的正常對照組，依據(jù)處理組及對照組病毒的TCID50的變化為判定標(biāo)準(zhǔn)。

1.5.7 基因分型 對所分離病毒的PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收，并送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行序列測定，將其核酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列與CPV參考毒株進(jìn)行比較。

1.5.8 動物回歸試驗 選擇HI抗體≤1∶4的2月齡健康中華田園犬4只，隨機(jī)分為2組，試驗組經(jīng)口服灌胃途徑每只灌服5 mL病毒液(含106.0TCID50/mL病毒)，對照組2只，經(jīng)相同途徑灌服5 mL細(xì)胞懸液，分別隔離觀察飼養(yǎng)，每天觀察癥狀，并收集糞便檢測排毒情況。

2 結(jié)果

2.1 病毒分離培養(yǎng)結(jié)果 處理過的病料同步接種F81細(xì)胞后盲傳至第3代，細(xì)胞出現(xiàn)拉網(wǎng)、圓縮、脫落等特有病變，繼續(xù)傳代病變更加明顯。圖1為病變細(xì)胞與正常細(xì)胞對比圖，病變細(xì)胞90%出現(xiàn)CPE。見圖1。

圖1 犬細(xì)小病毒CPV-DH-3株感染F81細(xì)胞出現(xiàn)CPEA：正常細(xì)胞對照； B：病毒感染F81細(xì)胞72 h后

2.2 形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果 取分離到的病毒第5代培養(yǎng)物處理后經(jīng)磷鎢酸負(fù)染可觀察到第5代病毒液中呈現(xiàn)立體對稱、圓形、無囊膜，直徑約為20 nm左右的實心病毒粒子，見圖2。

圖2 病毒粒子電鏡照片

7

8

2. 3 血凝特性采用微量血細(xì)胞凝集試驗，采用新鮮的1%豬紅細(xì)胞懸液，檢測分離毒株細(xì)胞培養(yǎng)物的血凝特性，每孔中以50%以上紅細(xì)胞出現(xiàn)凝集時判定為陽性，結(jié)果在培養(yǎng)的代細(xì)胞培養(yǎng)物中其血凝價在27 ～ 28之間，說明該分離株病毒血凝特性比較穩(wěn)定。在血凝抑制試驗中此病毒均可被CPV 陽性血清所抑制。

2.4 PCR擴(kuò)增鑒定 分別提取第3代病毒液和正常細(xì)胞對照的基因組作為模板和陰性對照，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見圖3所示，擴(kuò)增得到了約為570 bp大小的目的片段，與預(yù)期相符。

圖3 PCR擴(kuò)增結(jié)果1：陰性對照； 2、3：第3代病毒液； M：Marker DL-2 000

2.5 直接免疫熒光試驗 病毒液接種F81細(xì)胞72 h后，直接免疫熒光試驗結(jié)果顯示，病毒能夠在F81細(xì)胞中復(fù)制，且病毒主要集中在細(xì)胞核，正常細(xì)胞對照組未見熒光，見圖4。

2.6 VP2序列分析鑒定結(jié)果 將第5代細(xì)胞培養(yǎng)物提取基因組用VP2序列引物進(jìn)行擴(kuò)增后經(jīng)克隆測序，測序結(jié)果表明，分離病毒CPV-DH-3的VP2基因序列包含1 755個堿基，將該病毒的VP2序列與GenBank上已有的犬細(xì)小病毒其他參考序列綜合比較，做序列同源性分析。通過生物學(xué)軟件(MEGA 6.0)對分離毒株和參考毒株VP2序列生成的進(jìn)化樹分析可知，分離的CPV-DH-3株病毒與參考序列同源性較高，核苷酸序列及氨基酸序列相似性最高達(dá)99%以上。分離毒株CPV-DH-3與我國流行毒株CPV-2b的核苷酸同源性較高達(dá)到99.3%，氨基酸同源性高達(dá)99.1%。

圖4 直接免疫熒光檢測病毒感染F81細(xì)胞A：細(xì)胞培養(yǎng)物熒光染色結(jié)果； B：空白對照

圖5 序列分析進(jìn)化樹

2.7 分離毒株類型單抗鑒定結(jié)果 分離到的CPV-DH-3株病毒和參考毒株在F81細(xì)胞上培養(yǎng)72 h并固定后，用特異性單克隆抗體進(jìn)行免疫組化檢測，結(jié)果顯示，抗CPV-2a型單抗僅與參考毒株反應(yīng)，而與分離株不反應(yīng)，抗new CPV-2b型單抗與分離株反應(yīng)，所以分離株CPV-DH-3毒株為new CPV-2b型。

2.8 病毒理化性質(zhì)鑒定 將所分離病毒的細(xì)胞培養(yǎng)物經(jīng)20%乙醚、pH值3.0以及56 ℃熱處理后與對照組相比病毒活性(TCID50)無明顯變化。以上特性符合細(xì)小病毒特征。

2.9 病毒分型 對所分離病毒的PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收和序列測定，將其核酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列與CPV參考毒株進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，CPV-DH-3株與參考株LCPV-V204的堿基順序和氨基酸順序一致，因此判斷所分離到的CPV毒株為new CPV-2b型(表1、2)。

表1 CPV-DH-3株與CPV參考毒株堿基對比

表2 CPV-DH-3株與CPV參考毒株氨基酸對比

2.10 動物回歸試驗 人工感染的2只比格犬經(jīng)過2 d的潛伏期后，在第3天開始出現(xiàn)精神委靡、厭食、排稀便的癥狀；第5天出現(xiàn)排綠色糞便和血便。試驗組兩只犬分別在第7天和第8天死亡，剖檢呈現(xiàn)消瘦、脫水、腸道出血癥狀。對試驗犬糞便血凝試驗結(jié)果顯示，試驗組犬的糞便在第3天開始出現(xiàn)血凝現(xiàn)象，說明試驗犬從第3天開始排毒，而對照犬在整個試驗過程中，精神、食欲等未見異常變化。

3 討論

本研究從疑似犬細(xì)小病毒感染的犬糞便中分離出一株病毒，后經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)、病毒形態(tài)學(xué)鑒定、血凝試驗、直接免疫熒光試驗以及PCR擴(kuò)增試驗和VP2基因分析、分離毒株類型單抗鑒定等多種方法鑒定，確定分離的病毒為犬細(xì)小病毒，所屬毒株類型為new CPV-2b亞型，并命名為CPV-DH-3。

本試驗中，分離病毒的細(xì)胞培養(yǎng)物在鏡下出現(xiàn)明顯且典型的細(xì)胞病變；利用細(xì)小病毒獨特的血凝特性驗證分離病毒有血凝特性，血凝試驗效價達(dá)到27～28，且其血凝特性可被CPV陽性血清特異性抑制，說明分離毒株為犬細(xì)小病毒；此外，VP2序列擴(kuò)增比對結(jié)果、單抗對毒株分型鑒定的結(jié)果說明分離毒株為犬細(xì)小病毒為new CPV-2b亞型；動物回歸試驗表明，該分離株可導(dǎo)致試驗犬表現(xiàn)典型的犬細(xì)小病毒感染的癥狀并伴隨死亡，說明該分離株為犬細(xì)小病毒強(qiáng)毒株。

犬細(xì)小病毒屬于細(xì)小病毒科細(xì)小病毒屬成員，該病毒屬于細(xì)小病毒科細(xì)小病毒屬的成員在同屬中還有貓泛白細(xì)胞減少癥病毒(felinepanleukopeniavirus, FPLV)和水貂腸炎細(xì)小病毒(minkenteritisvirus, MEV)等肉食獸細(xì)小病毒CPV、FPLV和MEV三者的基因序列一致性高達(dá)98%以上具有緊密的親緣關(guān)系。犬細(xì)小病毒在世界范圍內(nèi)廣泛傳播，不斷有新的變異株被發(fā)現(xiàn)，目前我國流行多種亞型的CPV毒株，本試驗中分離得到的CPV-DH-3屬于CPV-2b亞型，從進(jìn)化樹可以看出，我國黑龍江哈爾濱、牡丹江地區(qū)、北京地區(qū)、武漢、南京等地均有分離到該亞型的毒株。其他亞型在上述地區(qū)也有分離到，這表明CPV不同亞型的流行并沒有十分嚴(yán)格的地區(qū)限制。

吉林省延邊州的朝鮮族同胞喜食狗肉，在延邊朝鮮族自治州內(nèi)多地都有大量飼養(yǎng)肉用犬。犬細(xì)小病毒作為危害我國養(yǎng)犬業(yè)的重要疾病，已經(jīng)引起人們的高度重視。我國專家學(xué)者在犬細(xì)小病毒病流行病學(xué)、病原學(xué)、診斷及預(yù)防等多方面進(jìn)行了大量研究，且已經(jīng)取得階段性研究進(jìn)展。[8]本研究豐富了我國犬細(xì)小病毒病流行病學(xué)調(diào)查資料及毒種資源，針對延邊敦化地區(qū)犬細(xì)小病毒，為了解延邊地區(qū)犬細(xì)小病毒的遺傳進(jìn)化趨勢，進(jìn)一步深入研究CPV的生物學(xué)特性，制備更有針對性的地區(qū)性疫苗和高免血清以及綜合防疫方案的制定，提供了理論依據(jù)。

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IsolationandidentificationofCanineparvovirusisolatedfromDunhua

REN Wen-ming1, SUN Ming2, YE Ming3, ZHAO Dan1

(1.Ginseng and Antler Product Quality Supervision, Inspection And Test Center of Jilin Agricultural University,Changchun 130118,China ; 2.Tong hua Center for Disease Control And Prevention in Jilin , Tonghua 134001,China ; 3.Jilin Te Yan Biological Technology Liamited Liability Company, Changchun 130122,China)

The object of the research was to enrich the database for study on the epidemiology of the canine parvovirus in Yanbian and to prepare for research effective vaccines and diagnostic reagents. We collected the suspected canine parvovirus infection disease canine faecal swab in Yanbian Prefecture Dunhua City and infected the feline kidney cells (F81) after pretreatment until the cells appeared obvious specific lesions. The cell culture were examined by morphology, molecular biology and immunology etc. The isolated virus caused cytopathic effects specifically and the virus particle was clearly visible by electron microscopy.The isolated viru agglutinated erythrocyte and the agglutination of erythrocyte was specifically inhibited by positive serum. The infected cell were tested positive by PCR and direct fluorescent staining. Phylogenetic tree of CPV’s VP2 sequences had a highly homologs to type of new CPV-2b. Conclusions: From the results above, we identified the isolated virus as CPV and the CPV belonged to the type of new CPV-2b and was named as CPV-DH-3.

canine parvovirus ; DH-3 ; isolation ; identification

ZHAO Dan

S852.65+9.2

A

0529-6005(2017)09-0034-04

2016-12-09

任謂明(1983-)，男，助理研究員，碩士，從事微生物與生物技術(shù)研究工作，E-mail：469577286@qq.com

趙丹，E-mail：469577286@qq.com