王小龍，張 青，熊培鑫，戚兆富，王福軍，張麗宏，范根成，杜元釗

（1. 青島易邦生物工程有限公司，山東青島 266114；2. 雨潤(rùn)集團(tuán)養(yǎng)殖事業(yè)部，江蘇南京 210000）

通過檢測(cè)血清中的病毒載量評(píng)估不同圓環(huán)病毒疫苗對(duì)母豬的免疫效果

王小龍1，張 青1，熊培鑫2，戚兆富2，王福軍1，張麗宏1，范根成1，杜元釗1

（1. 青島易邦生物工程有限公司，山東青島 266114；2. 雨潤(rùn)集團(tuán)養(yǎng)殖事業(yè)部，江蘇南京 210000）

為了給規(guī)模化豬場(chǎng)圓環(huán)病毒2型（PCV2）的感染和疫苗評(píng)價(jià)提供科學(xué)合理的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，本研究建立了一套成熟敏感的real-time PCR檢測(cè)方法，通過檢測(cè)母豬免疫前后血液中病毒載量變化，來(lái)評(píng)價(jià)不同類型圓環(huán)病毒疫苗的免疫效果。結(jié)果顯示：4個(gè)廠家疫苗對(duì)降低病毒載量的效果差異很大，其中原核表達(dá)的PCV2疫苗效果最佳，降幅比例為97.78 %，離散度為49.8。此外，PCV2疫苗免疫能夠降低豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）的抗體水平，有助于豬場(chǎng)PRRS疫情的控制。以上試驗(yàn)證明：PCV2病毒載量的降低是控制PCV2感染的關(guān)鍵；抗體水平不能作為疫苗的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)；不同廠家的PCV2疫苗效果存在很大差異。

豬圓環(huán)病毒2型疫苗；病毒載量；抗體水平；豬繁殖與呼吸綜合征；免疫效果評(píng)價(jià)

豬圓環(huán)病毒病嚴(yán)重危害我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，給我國(guó)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。圓環(huán)病毒造成的疾病包括：PMWS（斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征）、PDNS（豬皮炎腎病綜合征）、PRDC（豬呼吸道疾病綜合征）和Reproductive Disorders（繁殖障礙）[3-4]。目前我國(guó)豬場(chǎng)的圓環(huán)病毒2型感染（PCV2）十分普遍，無(wú)陰性場(chǎng)。但是豬感染PCV2不一定出現(xiàn)臨床癥狀，而是隱性帶毒。因此在目前PCV2感染普遍的情況下，其病原學(xué)監(jiān)測(cè)的意義不大。PCV2的抗體檢測(cè)不能區(qū)分疫苗免疫與野毒感染，并且不同抗體檢測(cè)試劑盒廠家ELISA包被的成份有所不同，所以不能簡(jiǎn)單地用ELISA檢測(cè)的抗體滴度和整齊度，去評(píng)價(jià)不同類型圓環(huán)病毒苗的免疫效果[5-6]。

美國(guó)自暴發(fā)PCV2感染以來(lái)，對(duì)PCV2進(jìn)行了大量的研究試驗(yàn)。其對(duì)疫苗的評(píng)價(jià)包括降低血清中的病毒載量、降低臨床病例和降低組織病理學(xué)損傷，而降低血清中的病毒載量是一個(gè)非常好的檢測(cè)指標(biāo)[7-8]。之前的研究表明，糞便、鼻腔和口腔拭子中的PCV2 DNA含量能夠反映血清中的病毒含量，并且PCV2的病毒載量和病毒誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體并沒有嚴(yán)格的相關(guān)性，所以血清中的病毒載量能夠反應(yīng)豬群的帶毒和排毒情況。通過一些數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，美國(guó)經(jīng)過長(zhǎng)達(dá)6年的PCV2疫苗免疫，使母豬群中的病毒載量得到了有效降低，從2006年的豬群平均病毒載量104～106copies/mL降到2012年的103～104copies/mL，大大降低了感染豬群的臨床癥狀和PCV2的感染壓力[9-10]。

為科學(xué)合理地評(píng)價(jià)PCV2疫苗的效果，借鑒美國(guó)的成功經(jīng)驗(yàn)，通過建立一套成熟敏感的realtime PCR檢測(cè)方法，檢測(cè)免疫不同類型PCV2疫苗的母豬血清中病毒載量變化，來(lái)評(píng)價(jià)不同類型疫苗的使用效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

在某集團(tuán)公司的規(guī)模化種豬場(chǎng)，挑選同批次分娩前2個(gè)月的妊娠母豬150頭，將其分成5組（胎齡、防疫和飼養(yǎng)條件基本一致）：全病毒滅活疫苗（A和D場(chǎng)）、基因工程疫苗（B和C場(chǎng)）和對(duì)照組，每組30頭。試驗(yàn)之前對(duì)不同試驗(yàn)組的豬群進(jìn)行采血，采血1周后進(jìn)行豬群免疫；再間隔3周加強(qiáng)免疫1次；1個(gè)月后再次采血（表1）。

表1 試驗(yàn)方案

1.2 引物設(shè)計(jì)與擴(kuò)增

根據(jù)發(fā)表的序列，選用病毒特異性序列設(shè)計(jì)引物。上游引物為GGCTCCAGTGCTGTTATT，下游引物為AGGGCTGGGTTATGGTAT，擴(kuò)增片段為110 bp。按DNA提取試劑盒說(shuō)明，制備病毒DNA模板，用TaKaRa Ex Taq試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增。常規(guī)PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性 94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共35個(gè)循環(huán)，延伸反應(yīng)72 ℃ 10 min，用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR 產(chǎn)物。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)DNA模板的制備

含PCV2全長(zhǎng)基因組重組質(zhì)粒（pMD-PCV2），由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。以此重組質(zhì)粒作為實(shí)時(shí)定量PCR標(biāo)準(zhǔn)品，用紫外法測(cè)定質(zhì)粒DNA濃度，小量分裝，置-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 實(shí)時(shí)定量PCR操作程序

采用SYBR Premix Ex Taq試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR試驗(yàn)。以重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，在ABI Prism 7500儀（Bio-Rad）上，應(yīng)用矩陣法，對(duì)實(shí)時(shí)定量PCR的循環(huán)參數(shù)、引物濃度等條件進(jìn)行優(yōu)化。取200 μL血清，按照病毒DNA核酸提取試劑盒（碧云天）的操作流程進(jìn)行核酸提取，最后將病毒的DNA溶解到50 μL溶解液中，將其作為熒光定量的上樣模板。熒光定量試劑為SYBR? Green I檢測(cè)（Takara），樣品上樣量為2 μL。反應(yīng)體系為20 μL，其中 2×SYBR Premix Ex Taq 預(yù)混液 10 μL、DNA 模板 2 μL、上下游引物（20 pmol）各 0.25 μL，加滅菌雙蒸水至終體積20 μL。反應(yīng)條件為94 ℃ 預(yù)變性 5 min，94 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共 40個(gè)循環(huán)。在每個(gè)循環(huán)的延伸時(shí)，測(cè)定熒光信號(hào)，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線確定

將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)10倍系列稀釋，設(shè)定質(zhì)粒濃度范圍為107～102拷貝/μL，對(duì)每個(gè)稀釋度設(shè)3個(gè)重復(fù)。按照實(shí)時(shí)定量PCR操作程序進(jìn)行試驗(yàn)，確定標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6 ELISA檢測(cè)抗體

將實(shí)驗(yàn)前后收集的血液進(jìn)行抗體檢測(cè)。內(nèi)容包括PCV2（金諾試劑盒）和PRRSV（愛德仕試劑盒）。通過抗體的離散度進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.7 數(shù)據(jù)分析

將試驗(yàn)數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”（Means±SD）表示。利用GraphPad Prism（version 5.0）軟件中的Two-way ANOVA test進(jìn)行顯著性分析。P＞0.05（ns），表示差異不顯著；P＜0.05（*），表示差異顯著；P＜0.01（**）和P＜0.001（***），表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)時(shí)熒光定量

以重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)DNA模板，純化質(zhì)粒，測(cè)定其濃度，并換算得到病毒拷貝數(shù)為1×109拷貝/μL。以質(zhì)粒DNA模板作為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)實(shí)時(shí)定量反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了檢測(cè) PCV2核酸的PCR擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1、圖2）。從107～102拷貝/μL之間的標(biāo)準(zhǔn)模板濃度具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2=0.998，擴(kuò)增效率E=0.92。

圖1 實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)PCV2質(zhì)粒DNA擴(kuò)增曲線

圖2 實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)PCV2質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 病毒載量分析

分別對(duì)不同免疫組免疫前后血清中的PCV2病毒含量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示：B組免疫后的病毒載量為2.7×104±2.6×103，明顯低于其他組，而且整齊度最好，是所有組別中效果最好的；對(duì)照組病毒載量有輕微下降；A組效果較好，C組和D組沒有將病毒載量降到理想程度，效果基本一致；所有處理組免疫前后病毒載量差異都極顯著（圖3、表2）。

圖3 PCV2病毒載量在免疫前后的變化

表2 PCV2病毒載量免疫前后的變化

2.3 PCV2和PRRSV的抗體分析

對(duì)不同處理組免疫前后的血清進(jìn)行抗體檢測(cè)，結(jié)果顯示：PCV2抗體免疫后都有明顯上升，其中C組免疫后最高，其次為B組，A組、D組和E組基本一致，相對(duì)較低；免疫后的PRRSV抗體都普遍下降，各組間差異不顯著。這說(shuō)明PCV2免疫能夠降低豬群中的PRRSV活躍度，從而降低PRRSV的抗體水平（圖4）。

圖4 PCV2和PRRSV抗體在免疫前后的變化

3 討論

目前，國(guó)內(nèi)豬場(chǎng)的PCV2感染現(xiàn)象十分普遍，并且一旦感染終生帶毒。PCV2只有在體內(nèi)產(chǎn)生很高的病毒血癥時(shí)，才會(huì)導(dǎo)致豬出現(xiàn)臨床癥狀，從而影響生產(chǎn)成績(jī)。病毒血癥的高低是國(guó)際上認(rèn)可的評(píng)價(jià)PCV2感染程度和疫苗效果的指標(biāo)，因此如何在臨床上降低病毒血癥是控制PCV2感染的關(guān)鍵[11-12]。

PCV2傳入我國(guó)后，在短短幾年內(nèi)迅速傳遍各大豬場(chǎng)。這與最初幾年大面積使用全病毒滅活苗有很大關(guān)系。由于PCV2培養(yǎng)滴度低，難滅活，造成一些技術(shù)不過關(guān)企業(yè)生產(chǎn)出的疫苗存在應(yīng)激過大、抗原含量不夠、滅活不徹底、易散毒等問題[13]。PCV2自然感染豬群后，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生Cap（核衣殼蛋白）和Rep（復(fù)制酶蛋白）兩種抗體。然而無(wú)論是全病毒滅活苗，還是基因工程疫苗，免疫后都只能產(chǎn)生針對(duì)Cap的抗體，不會(huì)產(chǎn)生非結(jié)構(gòu)蛋白R(shí)ep抗體。目前ELISA檢測(cè)試劑盒大多針對(duì)Cap抗體，因此無(wú)法區(qū)分豬群產(chǎn)生的抗體是疫苗產(chǎn)生的，還是野毒感染所致[9]。通過上述試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組（C和D組）免疫后的抗體水平雖然很高，但是病毒載量并沒有得到有效降低。這與疫苗質(zhì)量有很大關(guān)系。因此，不能用PCV2-Cap抗體水平的高低，去評(píng)價(jià)PCV2疫苗的效果。而基因工程疫苗（B組），由于只產(chǎn)生Cap抗體，因此抗體檢測(cè)的滴度雖然不是最高，但是能夠明顯降低病毒載量，并且組內(nèi)整齊度最好。這就是基因工程疫苗的優(yōu)勢(shì)。隨著技術(shù)研究的不斷深入，部分動(dòng)物疫苗會(huì)從簡(jiǎn)單傳統(tǒng)的全病毒時(shí)代邁向具有高技術(shù)含量的基因工程時(shí)代。這是技術(shù)發(fā)展的必然。PCV2基因工程疫苗能夠克服全病毒滅活苗抗原含量低、應(yīng)激大和易散毒等問題，可為PCV2的有效防控做出巨大貢獻(xiàn)。

目前我國(guó)豬場(chǎng)普遍存在PCV2和PRRSV的共感染問題。由于PRRSV和PCV2都是免疫抑制病毒，并且可在豬體內(nèi)相互促進(jìn)復(fù)制，因此PCV2極易造成豬群中PRRSV的不穩(wěn)定。在上述試驗(yàn)中，豬群免疫PCV2疫苗后，PRRSV的抗體水平相應(yīng)下降，使豬群中的PRRSV趨于穩(wěn)定。豬場(chǎng)防疫是一個(gè)系統(tǒng)工程，因此必須重視PCV2有效免疫對(duì)PRRSV控制的影響[14]。

PCV2疫苗只能降低血液中的病毒載量，不能消除感染。因此，疫苗免疫不能在短時(shí)間內(nèi)降低豬群的陽(yáng)性率。只有堅(jiān)持長(zhǎng)期免疫，才能達(dá)到對(duì)PCV2的有效防治[7-9]。仔豬可以通過接觸母豬和環(huán)境而感染。雖然母豬的高水平PCV2-Cap抗體不能影響仔豬群感染，但可減少母豬排毒現(xiàn)象，降低豬場(chǎng)的PCV2感染壓力。高病毒血癥母豬產(chǎn)出的仔豬基本為陽(yáng)性，無(wú)病毒血癥母豬產(chǎn)出的仔豬一般為低水平或檢測(cè)不出病毒血癥[15]。PCV2感染容易發(fā)生在母豬妊娠70 d之前，而仔豬則最易發(fā)生在出生后8～10周。這是因?yàn)榇藭r(shí)母源抗體最低。母豬的疫苗免疫不能阻止PCV2傳播和清除初乳中的PCV2，但可以誘發(fā)血清和初乳中的PCV2抗體[16]。此外，PCV2在仔豬中導(dǎo)致的發(fā)病和損失更為嚴(yán)重。血清PCV2病毒載量對(duì)仔豬平均日增重（ADWG）的影響存在量的效應(yīng)，即血清中的PCV2病毒載量越高，ADWG越低。PCV2疫苗可以降低感染豬場(chǎng)的發(fā)病率、減少病毒載量以及改善ADWG，同時(shí)可提高同批豬只的均勻度。仔豬在斷奶前后接種疫苗可減少該病導(dǎo)致的危害，降低血清中PCV2的感染水平，提高生產(chǎn)性能[17]。

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（責(zé)任編輯：朱迪國(guó)）

Immune Effect Assessment of Different PCV2 Vaccines on Sow by Detecting PCV2 Viral Load in Serum

Wang Xiaolong1，Zhang Qing1，Xiong Peixin2，Qi Zhaofu2，Wang Fujun1，Zhang Lihong1，F(xiàn)an Gencheng1，Du Yuanzhao1
（1. Qingdao YEBIO Bioengineering Co.，Ltd.，Qingdao，Shandong 266114；2. Pig Industry Department of YURUN Group，Nanjing，Jiangsu 210000）

In order to provide scientific rational evaluation for PCV2 infection and vaccine evaluation in largescaled swine farms，a mature real-time PCR assay was designed and was used to quantify viral load in before and after immunized serum samples，so as to evaluate the immunity status on different domestic PCV2 vaccine. The results showed that the effect on reducing viral load of vaccines from 4 manufacturers varied significantly. The effect of prokaryotic expression vaccine of PCV2 was the best，of which the percentage decline was 97.78%，and the discretization was 49.8. In addition，PCV2 vaccine could both decrease PRRSV antibody levels and control PRRSV infection in pig farms. The results showed that the reduction of PCV2 viral load was the key to control PCV2 infection.The antibody level couldn't be the standard to estimate vaccine efficacy and there was a big difference of vaccine effectiveness from different manufactures.

PCV2 vaccine；viral load；antibody level；PRRSV；immune effect evaluation

S855.3

A

1005-944X（2017）11-0074-05

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.11.020

杜元釗