孫婷婷 ，趙 格 ，宋 雪 ，趙建梅 ，劉 娜 ，王 娟 ，李月華 ，黃秀梅 ，王君瑋 ，鄒 明

（1.中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032；2.農(nóng)業(yè)部畜禽產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估試驗(yàn)室（青島），山東青島 266032；3.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東青島 266109）

零售雞肉中沙門氏菌生長預(yù)測(cè)模型的建立

孫婷婷3，趙 格1，2，宋 雪1，趙建梅1，2，劉 娜1，2，王 娟1，2，李月華1，2，黃秀梅1，2，王君瑋1，2，鄒 明3

（1.中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032；2.農(nóng)業(yè)部畜禽產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估試驗(yàn)室（青島），山東青島 266032；3.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東青島 266109）

為了建立零售雞肉中沙門氏菌的生長預(yù)測(cè)模型，以在超市購買的新鮮雞肉和腸炎沙門氏菌作為研究對(duì)象，選擇4、10、16、25、30、37 ℃條件，對(duì)腸炎沙門氏菌在零售雞肉中的生長情況進(jìn)行研究，繪制生長曲線。對(duì)一級(jí)模型，用CurveExpert軟件中的Gompertz、Richards、Logistic 3種模型和DMFit軟件中的Baranyi模型進(jìn)行擬合，以確定最適用模型。4種模型擬合后的Baranyi模型相關(guān)系數(shù)都在0.98以上。數(shù)據(jù)表明該模型擬合程度最好，最適合預(yù)測(cè)沙門氏菌在雞肉中的生長動(dòng)態(tài)。二級(jí)模型是將一級(jí)模型擬合的數(shù)據(jù)帶入Ratkowsky方程。此方程描述的是溫度對(duì)最大生長速率的影響。通過準(zhǔn)確因子、偏差因子以及均方根誤差，對(duì)模型的準(zhǔn)確性進(jìn)行檢驗(yàn)。結(jié)果顯示模型的準(zhǔn)確因子為1.129 698，偏差因子為0.984 85，均方根誤差為0.091 5，決定系數(shù)R2為0.982 5，說明建立的模型可靠性高。

沙門氏菌；零售雞肉；預(yù)測(cè)微生物學(xué)；生長模型

在各類食源性疾病中，由病原微生物引起的占很大比例[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2014年我國由微生物引起的中毒事件例數(shù)和人數(shù)分別占食物中毒總例數(shù)和總?cè)藬?shù)的42.5%和67.7%，比2013年升高了5.3%和1.8%，死亡率也升高了0.9%。沙門氏菌是引起食物中毒的主要致病菌，占40.0%～60.0%[2]。沙門氏菌污染率在鮮肉及肉制品中最高。對(duì)北京、上海、四川等8個(gè)省份調(diào)查發(fā)現(xiàn)，零售雞肉中沙門氏菌污染率平均高達(dá)52.2%[3]。這可能是在肉雞的屠宰、加工、運(yùn)輸、貯藏過程中，由于某些措施不當(dāng)污染了沙門氏菌，并使其在適宜的環(huán)境條件下大量繁殖。

近年來，我國的雞肉消費(fèi)需求量日益增加。聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織（FAO）2013年的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，我國雞肉年產(chǎn)量1 279萬噸，占總禽肉量的70.0%。肉雞在進(jìn)入加工廠時(shí)，其沙門氏菌攜帶率并不高，但經(jīng)過一系列加工操作后，由于交叉污染等因素，在出加工廠時(shí)，沙門氏菌攜帶率非常高[4]，從而導(dǎo)致市面上零售的雞肉中沙門氏菌檢出率特別高。FAO于2002年對(duì)沙門氏菌實(shí)際暴發(fā)的統(tǒng)計(jì)顯示，人們攝入含有沙門氏菌量達(dá)到105cfu的食物，就可以發(fā)生食物中毒[5]。因此，研究沙門氏菌在雞肉中的生長動(dòng)態(tài)，快速預(yù)測(cè)沙門氏菌在雞肉中的生長、存活和死亡規(guī)律，可為消費(fèi)者在消費(fèi)、儲(chǔ)存和食用雞肉過程中做正確指導(dǎo)，從而更好地保證食品安全。

預(yù)測(cè)微生物學(xué)（Predictive microbiology）是對(duì)微生物隨著外界環(huán)境的改變和不同可能出現(xiàn)的變化進(jìn)行預(yù)測(cè)，主要應(yīng)用于食品中微生物動(dòng)態(tài)的研究。Ding[6]、Whiting[7]和FERRER[8]將微生物預(yù)測(cè)模型分為三級(jí)：一級(jí)模型描述不同環(huán)境條件下，微生物濃度隨時(shí)間的變化關(guān)系；二級(jí)模型描述經(jīng)一級(jí)模型擬合曲線后得到的參數(shù)與環(huán)境變量之間的關(guān)系；三級(jí)模型是將一二級(jí)模型結(jié)合起來建立的計(jì)算機(jī)程序軟件，可以用來預(yù)測(cè)一定條件下的微生物變化情況?？梢娧芯恳患?jí)和二級(jí)模型是最基礎(chǔ)，也是最主要的。預(yù)測(cè)微生物學(xué)可為微生物風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供不同環(huán)境下的微生物生長數(shù)據(jù)，是食品中微生物風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估（Microbiological risk assessment，MRA） 的 重要手段。一直以來，各國學(xué)者通過不同軟件和模型，對(duì)食品中沙門氏菌等致病菌的預(yù)測(cè)微生物學(xué)模型進(jìn)行擬合分析，并通過驗(yàn)證來確定最優(yōu)生長預(yù)測(cè)模型。美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）早在1998年就對(duì)帶殼雞蛋和蛋制品中的腸炎沙門氏菌進(jìn)行了風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，首次將沙門氏菌的預(yù)測(cè)微生物學(xué)研究引入動(dòng)物產(chǎn)品的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。歐洲食品安全局于2010年發(fā)布了生豬飼養(yǎng)和屠宰過程中以及禽蛋中的沙門氏菌定量風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估報(bào)告，其中也應(yīng)用了沙門氏菌生長動(dòng)力學(xué)模型。由于不同地域分離的沙門氏菌基因型和表型都存在差異，而且不同地域的動(dòng)物產(chǎn)品品質(zhì)和溫濕度微環(huán)境也有所不同，所以構(gòu)建本土沙門氏菌的預(yù)測(cè)微生物學(xué)模型，對(duì)更準(zhǔn)確地風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估研究非常重要。

本試驗(yàn)以零售雞肉為材料，通過預(yù)測(cè)微生物學(xué)軟件CurveExpert和DMFit中的不同模型，對(duì)不同溫度下沙門氏菌在雞肉中的生長動(dòng)態(tài)進(jìn)行曲線擬合，建立不同溫度下的沙門氏菌的生長預(yù)測(cè)模型，為雞肉生產(chǎn)和消費(fèi)作科學(xué)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株。腸炎沙門標(biāo)準(zhǔn)菌株，購自中國藥品生物制品檢定所。

1.1.2 試驗(yàn)樣品。購自零售終端的新鮮雞胸脯肉。

1.1.3 培養(yǎng)基。沙門氏菌顯色培養(yǎng)基，購自鄭州博賽生物技術(shù)股份有限公司；無菌勻質(zhì)袋等耗材，購自北京路橋技術(shù)股份有限責(zé)任公司。

1.1.4 儀器與設(shè)備。生化培養(yǎng)箱，購自上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；拍擊式勻質(zhì)器，購自法國Interscienc公司；生物安全柜，購自上海力申科學(xué)儀器有限公司；高壓蒸汽滅菌鍋，購自上海申安醫(yī)療器械廠；電子天平，購自賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 懸菌液的制備。將沙門氏菌平板劃線培養(yǎng)

18 h，挑取單個(gè)菌落于營養(yǎng)肉湯中，置于搖床中，37 ℃、180轉(zhuǎn)培養(yǎng)3 h，測(cè)定菌液濃度（約107～108cfu/mL），再將菌液用生理鹽水稀釋成濃度為103cfu/mL的懸菌液，備用。

1.2.2 供試雞肉的制備。將新鮮雞胸脯肉平鋪于無菌操作臺(tái)中，用紫外線照射15 min后，翻動(dòng)另一面再照射15 min。再將雞肉浸入80 ℃無菌水中處理20 s，取出后無菌取雞胸脯肉內(nèi)部肉，切成1 g左右的肉丁備用。

1.2.3 雞肉接種、培養(yǎng)、計(jì)數(shù)。將雞肉放入制備好的懸菌液中浸泡30 s，取出后瀝去多余水分，使雞肉的細(xì)菌接種量為102cfu/g，將其分裝于勻質(zhì)袋中（雞肉從購買到處理完時(shí)間不超過2 h），分別置于4、10、16、25、30 、37 ℃中培養(yǎng)。其中4、10 ℃每24 h取1次樣，16 ℃每12 h取1次樣，25 ℃每4 h取1次樣，30、37 ℃每2 h取1次樣。每個(gè)溫度下設(shè)3組平行試驗(yàn)；每組平行試驗(yàn)在每次取樣點(diǎn)設(shè)3個(gè)重復(fù)樣品。每次取10 g肉于勻質(zhì)袋中，加入90 mL無菌生理鹽水，用拍擊式勻質(zhì)器勻質(zhì)5 min；經(jīng)適當(dāng)?shù)谋侗认♂尯?，用平板?jì)數(shù)法進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)。

1.2.4 一級(jí)模型的建立。將試驗(yàn)取得的數(shù)據(jù)，用Curve Expert1.4軟 件 中 的 Gompertz、Richards、Logistic 3種模型和DMFit軟件中的Baranyi 模型進(jìn)行擬合，通過4種模型相關(guān)系數(shù)的比較，選擇出最適用的模型。4種模型的方程表達(dá)式如下：

（注：a、b、c、d為模型擬合后的系數(shù)；Nt為時(shí)間為t時(shí)的細(xì)菌數(shù)；N0為初始染菌數(shù)）

（注：t為任意時(shí)刻；Nt為時(shí)間為t時(shí)的細(xì)菌數(shù)；N0為初始染菌數(shù)；μm為最大生長速率；λ為遲滯期；A（t）和細(xì)胞的生理狀態(tài)及環(huán)境適應(yīng)性有關(guān)）

1.2.5 二級(jí)模型的建立。根據(jù)Ratkowsky提出的經(jīng)典的平方根方程[9-10]建立二級(jí)模型。二級(jí)模型描述的是沙門氏菌生長速率與溫度之間的關(guān)系。

（注：√μm為生長速率；a為斜率；tmin為當(dāng)沙門氏菌生長速率為零時(shí)的溫度）

1.2.6 模型檢驗(yàn)。本試驗(yàn)采用準(zhǔn)確因子（Accuracy factor，Af）、偏差因子（Biasfactor，Bf）及均方根誤差（RMSE）來檢驗(yàn)得到的模型。

2 結(jié)果與分析

2.1 一級(jí)模型的建立

在本試驗(yàn)中，雞肉中的沙門氏菌在4 ℃條件下10 d后，測(cè)得菌量與初始菌量相比，無明顯變化。這說明沙門氏菌在4 ℃條件下沒有生長，無法擬合曲線。所以只對(duì)10、16、25、30、37 ℃ 5個(gè)溫度條件下沙門氏菌的生長動(dòng)態(tài)進(jìn)行了曲線擬合，根據(jù)其相關(guān)系數(shù)選擇最適模型。相關(guān)系數(shù)R可以衡量預(yù)測(cè)值與試驗(yàn)觀測(cè)值的相關(guān)程度。R值越接近1，表示模型的參考價(jià)值越高。各種模型擬合得到的相關(guān)系數(shù)見表1。

表1 各模型擬合曲線的相關(guān)系數(shù)（R）

由表1可以看出，各個(gè)模型擬合的曲線相關(guān)系數(shù)都在0.90以上，擬合性較好。其中Baranyi 模型和Richards模型對(duì)各個(gè)溫度下擬合的曲線的相關(guān)系數(shù)都比較高，都在0.99以上，以Baranyi模型擬合性最好。因此，Baranyi 模型是最適宜描述沙門氏菌在雞肉中生長動(dòng)態(tài)的生長模型。其擬合參數(shù)見表2，擬合圖見圖1。根據(jù)Baranyi模型擬合的數(shù)據(jù)建立二級(jí)模型。

表2 Baranyi 模型擬合的參數(shù)

圖1 Baranyi 模型擬合的沙門氏菌在不同溫度下的生長曲線

2.2 二級(jí)模型的建立

將Baranyi 模型擬合的不同溫度下的最大比生長速率μm值帶入Ratkowsky方程，進(jìn)行擬合，得描述沙門氏菌生長速率與溫度關(guān)系的二級(jí)模型（圖2）。模型表達(dá)方程式為：√μm=0.028 9t-0.051 6，決定系數(shù)R2為0.982 5。

2.3 模型檢驗(yàn)

對(duì)得到的二級(jí)模型方程，用準(zhǔn)確因子（Af）、偏差因子（Bf）及均方根誤差（RMSE）來檢驗(yàn)，結(jié)果見表3。Af越接近1，表示預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差越小，實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值的吻合性越高。Bf表示預(yù)測(cè)值高于或者低于實(shí)測(cè)值的程度，也是越接近1，表示實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值越接近，大于1表示實(shí)測(cè)值比預(yù)測(cè)值大，小于1表示實(shí)測(cè)值比預(yù)測(cè)值小。RMSE值越小，說明預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值越接近。

圖2 最大比生長速率與溫度關(guān)系的二級(jí)模型擬合曲線

表3 模型驗(yàn)證結(jié)果

3 討論

目前，我國對(duì)鮮雞肉中沙門氏菌預(yù)測(cè)生長模型的研究較少。大部分都是對(duì)鮮雞肉中沙門氏菌污染情況及鮮雞肉中沙門氏菌定量的研究[11-13]。僅趙瑞蘭[4]對(duì)進(jìn)出口分割雞肉中沙門氏菌預(yù)測(cè)微生物生長模型進(jìn)行過研究。其采用冷凍后的雞肉進(jìn)行試驗(yàn)，對(duì)數(shù)據(jù)用CurveExpect軟件中的Gompertz、Richards、Logistic、MMF模型進(jìn)行擬合，制作沙門氏菌生長曲線。但其只建立了一級(jí)模型，沒有建立二級(jí)模型。而本試驗(yàn)取更能代表我國居民日常雞肉膳食的市場(chǎng)零售新鮮雞肉，接種標(biāo)準(zhǔn)腸炎沙門氏菌，根據(jù)生產(chǎn)、儲(chǔ)存新鮮雞肉的習(xí)慣，合理設(shè)置溫度條件，分別在4、10、16、25、30、37 ℃下進(jìn)行培養(yǎng)，定時(shí)進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)，利用預(yù)測(cè)微生物學(xué)軟件進(jìn)行擬合分析。

本研究分別用Curve Expert 1.4軟件中的Gompertz、Richards、Logistic模型和 DMFit軟件中的Baranyi 模型對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，選擇出最優(yōu)模型即Baranyi 模型，進(jìn)行二級(jí)模型的建立。Baranyi 模型擬合的各個(gè)溫度下的曲線，相關(guān)系數(shù)都在0.980 0以上。這表明Baranyi 模型能更好地描述沙門氏菌在雞肉中的生長情況。二級(jí)模型建立用的是經(jīng)典的平方根方程，即Ratkowsky方程。經(jīng)擬合后，方程決定系數(shù)為0.982 5，擬合度高。經(jīng)檢驗(yàn)，其準(zhǔn)確因子（Af）為1.129 698，接近于1，偏差因子（Bf）為0.984 850，接近于1，均方根誤差（RMSE）值非常小為0.091 500。這些數(shù)據(jù)說明U預(yù)測(cè)值與U實(shí)測(cè)值相差不大，方程的可靠性高。Baranyi 模型是沙門氏菌在食品預(yù)測(cè)生長動(dòng)力學(xué)研究中用的越來越多的模型，在鮮切蔬菜、草魚魚糜、鮮豬肉中均有應(yīng)用。它相比較于其它模型，能計(jì)算出遲滯期、最大生長速率等參數(shù)，充分考慮了微生物生長的特殊性以及基質(zhì)與微環(huán)境的差異性，比其它模型更完善，擬合度更高。近年來，國外在雞肉、雞蛋和牛肉中的沙門氏菌預(yù)測(cè)微生物學(xué)研究也多采用Baranyi模型[15-16]。但是由于菌株特異性以及基質(zhì)與微環(huán)境的不同，模型中獲得的每個(gè)溫度下的最大比速率常數(shù)與本研究都有所差異，帶入我們的實(shí)際數(shù)據(jù)計(jì)算，更是有較大差異。應(yīng)該說國外研究的模型并不適于直接應(yīng)用到我國本土的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中，所以需要繼續(xù)加強(qiáng)適于我國本土的食源性致病微生物風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的預(yù)測(cè)微生物學(xué)模型研究。

本試驗(yàn)在樣品處理方面將雞肉處理成肉丁，浸入制備的細(xì)菌懸液中，充分保證了接菌量均勻。為保證試驗(yàn)的可重復(fù)性，排除其它未知因素的影響，試驗(yàn)前期做了大量預(yù)試驗(yàn)，分別從不同超市及農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)購買雞肉做重復(fù)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)從不同超市和農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)采集的新鮮雞肉試驗(yàn)后的數(shù)據(jù)相差不大。雖然如此，但本試采取的是驗(yàn)建立的模型，還有很多不確定性。本試驗(yàn)無菌取雞肉，而生活中購買的雞肉可能有許多其它微生物。各種微生物的生長繁殖，可能影響沙門氏菌的生長[14]。試驗(yàn)表明，沙門氏菌4 ℃下的在雞肉中基本是不生長的。

本試驗(yàn)所建立的模型，雖然不能用于精確計(jì)算，但在科學(xué)研究中，可為食品的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估工作提供依據(jù)；在生活中，可以指導(dǎo)鮮雞肉的安全生產(chǎn)、儲(chǔ)藏、運(yùn)輸及百姓的安全消費(fèi)和存儲(chǔ)；對(duì)保障食品安全、規(guī)避風(fēng)險(xiǎn)、防控疾病中，具有極其重要的意義。

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（責(zé)任編輯：杜憲）

Establishment of Growth Prediction Model for Salmonella in Retail Chicken

Sun Tingting3，Zhao Ge1，2，Song Xue1，Zhao Jianmei1，2，Liu Na1，2，Wang Juan1，2，Li Yuehua1，2，Huang Xiumei1，2，Wang Junwei1，2，Zou Ming3
（1. China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao，Shandong 266032；2. Livestock and Poultry Products Quality and Safety Risky Risk Assessment Laboratory，Ministry of Agriculture（Qingdao），Qingdao，Shandong 266032；3. Qingdao Agricultural University，Qingdao，Shandong 266109）

To establish the growth prediction model for Salmonella in retail chicken，Salmonella enteritis in fresh chicken sampled from supermarket at different temperature were studied. The growth of Salmonella enteritidis in retail chicken was studied at 4，10，16，25，30 and 37 ℃，and the growth curve was drawn. The first grade model was fitted with 3 models，including Gompertz，Richards and Logistic in CurveExpert software and Baranyi model in DMFit software，and the most suitable model was determined. After fitted by four models，Baranyi model showed the best fitting with all the correlation coefficients at different temperature above 0.98，which was the most suitable for predicting the growth dynamics of Salmonella in chicken. The second level model，which described the effect of temperature on the maximum growth rate，was predicted by putting the fitting data obtained from the first level into Ratkowsky equation. The accuracy of the model was tested by the accuracy factor，the bias factor and the root mean square error. Results showed that the accuracy factor of this second growth model was 1.129 698，the bias factor was 0.984 85. the root mean square error was 0.091 5，and the coefficient of determination was 0.982 5. The results showed that the reliability of the established model was high.

Salmonella；retail chicken；predictive microbiology；growth model

S852.61

A

1005-944X（2017）11-0017-06

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.11.005

國家農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估項(xiàng)目計(jì)劃（GJFP201600703、GJFP201700703）；科技部科技基礎(chǔ)性工作專項(xiàng)（2012FY111000）