古金元，王玉超，彭 濤，馬梓承，劉照虎，孟凡亮，王文武，劉思當(dāng)

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東泰安 271000）

某豬場豬瘟病例的綜合診斷及病原基因分析

古金元，王玉超，彭 濤，馬梓承，劉照虎，孟凡亮，王文武，劉思當(dāng)

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東泰安 271000）

2017年3月山東省萊蕪市某豬場保育豬群發(fā)生以高熱（40.8～41.5 ℃）、精神高度沉郁、食欲不振、皮膚出血潮紅及耳尖發(fā)紺為主要癥狀的急性熱性傳染病。為明確引起此次疫情的致病因素，對患病豬進行了病理剖檢、組織病理學(xué)檢查、分子生物學(xué)檢測、病毒分離與鑒定，對分離病毒進行了E2基因的分子克隆測序及同源性比對，最終確定該病由豬瘟病毒感染引起，并分離到1株豬瘟病毒（SDLW2017）。該病毒株E2基因全長1 119個堿基（nt），共編碼373個氨基酸（aa）；相似性分析表明，SDLW2017分離株與其它參考株的核苷酸相似性介于82.1%～96.3%，氨基酸相似性介于88.5%～97.6%，與1.1亞群HCLV株的核苷酸和氨基酸相似性最低，分別為82.1%和88.5%，而與2.1亞群參考株的核苷酸和氨基酸相似性較高，分別為91.8%～96.3%和95.2%～97.6%，其中與2.1b亞型參考株（GXWZ02）的相似性最高，分別為96.3%和97.6%。

豬瘟病毒；病毒分離鑒定；同源性比對

豬瘟（Classical swine fever，CSF）是一種由豬瘟病毒（CSFV）引起的，可以對養(yǎng)豬業(yè)造成重大損失的高度接觸性傳染病。當(dāng)前在臨床上，根據(jù)其表現(xiàn)癥狀不同，CSF可分為6種病型：最急性型、急性型、亞急性型、慢性型、持續(xù)感染型和復(fù)雜感染型[1]。不同病型的臨床表現(xiàn)各異。目前，CSF臨床病例以非典型性癥狀為主。母豬不表現(xiàn)明顯臨床癥狀，但會因繁殖障礙造成新生仔豬的慢性死亡或繼發(fā)其他疾病[2]。

目前CSF的診斷方法主要有臨床病理學(xué)診斷、中和試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）、免疫熒光抗體試驗和分子生物學(xué)診斷。當(dāng)前最常用的分子生物學(xué)檢測方法是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（PCR）、逆轉(zhuǎn)錄PCR或者稱反轉(zhuǎn)錄PCR（Reverse transcription-PCR，RT-PCR）。RT-PCR 技術(shù)能夠根據(jù)不同病原基因序列設(shè)計的相應(yīng)特異性引物，區(qū)分常見豬病中的多種病原，已被廣泛應(yīng)用于CSFV的實驗室檢測。為進一步提高檢測效率，多重RTPCR技術(shù)應(yīng)運而生。多重 RT-PCR 是一種快速、高效、高敏的實驗室檢測手段，只需進行1次試驗就可以檢測多種病毒，為實驗室檢測的開展提供了很大便利[3-5]。

針對CSF疫情，目前尚無有效的防治藥物，必須借助實驗室進行綜合診斷、快速確診，以便采取針對性的防控措施，減少細菌的繼發(fā)感染，避免疫情蔓延。抗體檢測能夠明確豬群的豬瘟免疫狀態(tài)并指導(dǎo)免疫程序的優(yōu)化調(diào)整，因此需對豬群進行系統(tǒng)的抗體檢測，并以此為依據(jù)，優(yōu)化免疫程序，降低CSF的發(fā)生風(fēng)險?，F(xiàn)就一臨床病例進行CSF綜合診斷及病毒的分離鑒定和基因測序。

1 材料與方法

1.1 豬場發(fā)病背景及樣品采集

疑似病料采自山東省萊蕪市某規(guī)?；i場。該場保育后期豬群發(fā)生以高熱（40.8～41.5℃）、精神沉郁、食欲不振、皮膚潮紅及耳尖發(fā)紺為主要特征的急性熱性傳染病，發(fā)病率約20%（75/370），3 d內(nèi)病死率為36%（27/75）。豬場技術(shù)人員對發(fā)病豬只肌注退燒藥后，未見明顯療效，遂送來2頭病豬，請求進行實驗室確診。

1.2 送檢病豬的臨床檢查

對送檢病豬解剖前進行臨床檢查，發(fā)現(xiàn)病豬主要表現(xiàn)為精神高度沉郁，食欲下降乃至廢絕，喜歡扎堆，高燒不退（40.8～41.5℃），全身皮膚呈紫紅色，有密集的出血點及出血斑，耳尖及四肢末梢發(fā)紺。

1.3 樣品采集

在對病豬進行系統(tǒng)的臨床癥狀觀察和病史調(diào)查后，初步懷疑為CSF，隨后對患病豬進行了病理剖檢和病料采集。采集大腦、脾臟、淋巴結(jié)、扁桃體、腎臟、肺臟及肝臟等組織，將每頭豬的組織病料分開保存，并將各組織分成兩份：一份凍存于-80 ℃冰箱，以備進行病原分離及病原檢測；另一份則固定于10%的福爾馬林溶液中，以備進行組織病理學(xué)檢查。同時，對發(fā)病豬場的經(jīng)產(chǎn)母豬、斷奶前仔豬及保育仔豬進行前腔靜脈采血，分離血清，待檢。

1.4 實驗室檢查

1.4.1 組織病理學(xué)檢查。將采集的組織病料經(jīng)10%的福爾馬林溶液固定后，制作常規(guī)石蠟切片，經(jīng)蘇木素-伊紅（HE）染色后進行光鏡觀察。

1.4.2 病原學(xué)檢查。將凍存于-80 ℃冰箱中的組織病料取出，解凍后取一部分加入適量滅菌磷酸鹽緩沖液（PBS）并研磨成勻漿，10 000 r/min離心4 min后取上清，然后用病毒核酸提取試劑盒提取病毒核酸。依據(jù)Genbank公布的序列分別設(shè)計CSFV、豬藍耳病病毒（PRRSV）、豬偽狂犬病病毒野毒（PRV gE）及豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）的特異性引物（表1）；用PCR/RT-PCR方法進行擴增后，將擴增產(chǎn)物于1.5%的瓊脂糖凝膠中進行電泳；電泳結(jié)束后在紫外凝膠成像儀下根據(jù)條帶位置大小判定病豬的病原感染狀況。

表1 PCR/RT-PCR引物序列

1.4.3 病毒分離及CSFV E2基因序列分析。將經(jīng)過RT-PCR鑒定為CSFV陽性且其余病原陰性的病料勻漿液上清過濾（0.22 μm濾器），將濾液接種于長滿單層的豬腎（PK-15）細胞，盲傳3代后收毒；將細胞及上清按上述方法提取核酸后進行PCR鑒定。另外，設(shè)計擴增CSFV E2基因全長的特異性引物，對僅CSFV陽性的核酸進行E2基因全長的擴增。將擴增產(chǎn)物進行膠回收純化，并連接pMD 18-T載體，然后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞及挑菌培養(yǎng)；將經(jīng)鑒定為CSFV E2基因陽性的菌液送至上海生工生物公司測序。對本研究中分離到的與GenBank中錄入的CSFV的E2基因（表2）進行核苷酸序列及氨基酸序列比對，分析分離株的序列特征。

表2 Gen Bank中27株參考毒株E2基因的序列信息

1.4.4 血清學(xué)檢查。為進一步明確致病原因，同時監(jiān)測該場的CSFV免疫狀態(tài)。經(jīng)前腔靜脈無菌采集該豬場經(jīng)產(chǎn)母豬血液10份、哺乳仔豬血液10份、45日齡保育豬血液10份，分離血清后使用CSF抗體檢測試劑盒檢測豬群抗體水平及其離散度。

2 結(jié)果

2.1 患病豬臨床剖檢結(jié)果

臨床檢查可見病豬全身皮膚潮紅（圖1-A）、耳朵發(fā)紺（圖1-B）。剖檢可見其全身淋巴結(jié)腫大、出血，切面呈典型“大理石樣”變化（圖1-C）；脾臟邊緣可見出血性梗死灶（圖1-D）；腎臟表面可見呈彌漫性分布的針尖至斑點大出血點（圖1-E）；心外膜出血（圖1-F）；結(jié)腸腸黏膜表面覆蓋一層糠麩樣物質(zhì)，剝離后可見結(jié)腸黏膜充血、潰瘍（圖1-G）；膀胱黏膜表面可見大小不等的出血斑點（圖1-H）；喉頭出血（圖1-I）。

圖1 病豬的剖檢病變

2.2 病理組織學(xué)檢查結(jié)果

將固定于10%福爾馬林溶液中的組織器官病料，經(jīng)常規(guī)石蠟切片、HE染色后鏡檢，能夠見到典型的病毒性腦炎病變：大腦毛細血管周圍可見大量淋巴細胞和單核細胞浸潤形成“腦血管袖套現(xiàn)象”（圖2-A）；變性壞死的神經(jīng)元被膠質(zhì)細胞吞噬，出現(xiàn)“噬神經(jīng)現(xiàn)象”及“衛(wèi)星現(xiàn)象”（圖2-B）。淋巴結(jié)表現(xiàn)出血性壞死性淋巴結(jié)炎病變，淋巴細胞大量崩解壞死，細胞核濃縮深染、崩解破碎、溶解消失（圖2-C）。心肌出血，肌纖維間散在紅細胞（圖2-D）。腎小球充血、出血，腎小管上皮細胞變性、壞死，腎間質(zhì)充血、出血（圖2-E）。脾臟出現(xiàn)出血性梗死區(qū)，并充滿紅細胞（圖2-F）。

2.3 病原學(xué)檢查結(jié)果

對采集的病料進行了CSFV、PRRSV、PRV gE、PCV2檢測，僅在病料樣品中檢出了CSFV，未檢出其它病毒（圖3）。

2.4 病毒接種細胞后的分離與鑒定結(jié)果

將經(jīng)RT-PCR鑒定為CSFV陽性且其它病原均為陰性的病料勻漿液，用0.22 μm濾膜過濾，然后接種到長滿單層的PK-15細胞，置于37 ℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)。在PK15細胞接種病料40 h后，在顯微鏡下觀察，可見明顯的細胞病變，以細胞圓縮、聚集和脫落為主要特征。繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，此時細胞病變達70%，收毒；將細胞瓶置于-20 ℃冰箱中進行反復(fù)凍融3次后，10 000 r/min，5 min離心；用細胞上清提取核酸進行PCR/RT-PCR檢測，發(fā)現(xiàn)僅有CSFV被檢出，未檢出PRRSV、PRV或PCV2，從而成功分離出CSFV。

圖2 病豬的組織病理學(xué)變化

圖3 病料樣品中相關(guān)病原的檢測結(jié)果

2.5 分離毒株與參考株E2基因核苷酸及氨基酸序列相似性分析結(jié)果

將分離到的病毒命名為SDLW2017。對該毒株的E2全基因擴增后進行測序，發(fā)現(xiàn)擴增片段大小為1 402 bp，其中E2基因全長為1 119 bp，共編碼373個氨基酸。相似性分析結(jié)果表明，該分離毒株與其它參考毒株的核苷酸相似性在82.1%～96.3%之間（圖4），氨基酸相似性在88.5%～97.6%之間（圖5）。該分離株與其它8個基因亞型的參考毒株相比（表3），與1.1亞型的HCLV株核苷酸和氨基酸相似性最低，分別為82.1%和88.5%，而與2.1亞型的參考毒株具有較高的核苷酸和氨基酸相似性，分別為91.8%～96.3%和95.2%～97.6%。其中，SDLW2017與2.1b亞型參考毒株（GXWZ02）的同源性最高，核苷酸和氨基酸相似性分別為96.3%和97.6%。此外，新分離株與2.1d亞型的同源性要高于2.1a及2.1c。這表明2.1b亞型和2.1d 亞型具有較高的相似度。這與之前的報道相吻合。

2.6 分離毒株與CSFV參考株E2基因系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析結(jié)果

將新分離株SDLW2017與27株參考毒株構(gòu)建進化樹（圖6）。結(jié)果表明，這28株序列被分到了3個基因群（1、2、3）中，其中包括8個基因亞群（1.1～1.4、2.1～2.3、3.4）。2.1 亞群在進化樹中被突出顯示，并被進一步劃分為 2.1a、2.1b、2.1c及1個被新定義的2.1d基因亞群。本次分離得到的CSFV在進化樹中處于2.1b亞群，與傳統(tǒng)的石門毒株（1.1）或兔化弱毒疫苗毒株（HCLV，1.1）相比，具有較大差異。

圖4 SDLW2017與27個參考毒株E2基因核苷酸序列的相似性

圖5 SDLW2017與27個參考毒株E2基因推導(dǎo)氨基酸序列的相似性

表3 分離株與8個CSFV參考毒株的核苷酸及氨基酸相似性 單位：%

圖6 分離株與參考毒株的進化樹分析結(jié)果

2.7 血清中CSF抗體水平檢測結(jié)果

抗體檢測結(jié)果顯示，經(jīng)產(chǎn)母豬整體陽性率偏低，且離散度大，因而哺乳仔豬得不到有效的母源抗體保護，極易受到外界野毒的感染。而保育豬平均抗體阻斷率偏高，不符合一免之后的抗體消長規(guī)律，懷疑有CSFV野毒感染。CSFV抗體水平檢測結(jié)果見下表4。

表4 不同階段豬群的豬瘟抗體水平

3 討論

CSF作為我國畜牧業(yè)四大疫病之一，至今流行已超過70年。我國雖然于1956年就提出了消滅CSF計劃，并在一定程度上控制了其暴發(fā)和大范圍流行，但并未杜絕其流行，而且其流行特點和發(fā)病特征還發(fā)生了很大變化，呈現(xiàn)為大范圍的散發(fā)流行[6]。目前大多數(shù)CSF病例都是亞臨床性的非典型病例，主要引起妊娠母豬生殖障礙、新生仔豬成活率低及保育豬的慢性感染和發(fā)病。此外，分子流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，我國流行的CSFV的基因型也在逐漸發(fā)生變化。中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所等單位對1979—2008年間從我國近60 免疫CSF疫苗的豬場發(fā)生了疑似CSF疫情，且發(fā)病率較高[8]。2015年初，相似疫情也發(fā)生在山東省的一些常規(guī)免疫豬場，并造成了不同程度的經(jīng)濟損失[9]。為查找引起該疫情的病原，明確其發(fā)病機制，在山東省萊蕪市某疑似發(fā)生CSF的豬場采集病料并進行了系統(tǒng)的實驗室檢測，最終確認疫情系CSFV感染所致。

本研究利用CSFV E2基因全長序列，構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育進化樹，發(fā)現(xiàn)該CSFV分離株與參考毒株（1.1、2.1、2.2、2.3和3.4）相比，處于2.1亞型，而且與其中的2.1b基因亞型具有最高的相似度，因而判定造成該場CSF疫情發(fā)生和流行的病毒株屬于2.1b亞型。文獻資料表明，該基因亞型的CSFV能夠?qū)е乱赘胸i群發(fā)生疫情并造成較大經(jīng)濟損失，而傳統(tǒng)的C株疫苗免疫難以有效阻止該毒株的流行和致病。由于本研究的局限性，未能對該病毒株的分子生物學(xué)特性、抗原性及病毒毒力等進行深入探究，但是可以推測該病毒株可能在傳統(tǒng)C株疫苗免疫壓力下發(fā)生了適應(yīng)性進化，并且與當(dāng)前疫苗免疫效果較差有一定的關(guān)系。

抗體檢測結(jié)果表明，該豬場保育豬平均抗體阻斷率偏高，不符合一免之后的抗體消長規(guī)律，極有可能為野毒感染所致。在確診為CSFV感染后，通過采取疫苗緊急免疫措施，使豬場疫情得到了有效控制，隨后基本恢復(fù)正常生產(chǎn)。

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（責(zé)任編輯：朱迪國）

Diagnosis and Pathogen Gene Analysis on An Outbreak of Classical Swine Fever in a Swine Farm

Gu Jinyuan，Wang Yuchao，Peng Tao，Ma Zicheng，Liu Zhaohu，Meng Fanliang，Wang Wenwu，Liu Sidang
（Animal Science and Technology Academy of Shandong Agricultural University，Tai'an，Shandong 271000）

An acute febrile infectious disease occurred in a swine farm，with high fever（40.8-41.5 ℃），depressed spirit，inappetence，the skin fl ushing and cyanosed tip of ear，and so on，in March 2017 in Laiwu City of Shandong Province. To identify the infective pathogen，pathological examination，histopathological examination，molecular biology detection，virus isolation and identification were carried out，and molecular cloning，sequencing and homology comparison of E2 gene were performed on the isolated virus. It's diagnized as CSFV infection finally，and a strain named SDLW2017 was isolated. The results revealed that the E2 gene of SDLW2017 was 1 119 nucleotide（nt）in length and coded 373 amino acids（aa）. The similarity analysis of nucleotide and amino acid sequences revealed that SDLW2017 strain shared a nucleotide similarity of 82.1%-96.3% and an amino acid similarity of 88.5%-97.6% with other reference strains. The nucleotide and amino acid similarity of the HCLV strain with the 1.1 subpopulation were 82.1% and 88.5%，respectively. When compared with the subgenotype 2.1 strains，SDLW2017 strain shared higher nucleotide（91.8%-96.3%）and amino acid（95.2%-97.6%）similarities. The newly isolated strain shared the highest nucleotide（96.3%）and amino acid（97.6%）similarity with subgenotype 2.1b strain（GXWZ02）.

Classical swine fever virus；virus separation and identification；homology comparisons

S945.4

A

1005-944X（2017）11-0008-06

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.11.003

國家重點研發(fā)計劃項目（2017YFD0500605）通訊作者：劉思當(dāng)