張云艷 劉亞琴 王 磊 張 琳 成海燕 楊姍姍

RIZ1蛋白表達與宮頸鱗狀細胞癌臨床病理參數(shù)及放療敏感性的相關性研究

張云艷 劉亞琴 王 磊 張 琳 成海燕 楊姍姍

目的探討宮頸鱗狀細胞癌組織中Rb蛋白結合鋅指結構基因1(RIZ1)的表達及其與宮頸癌患者臨床病理參數(shù)及放療敏感性的關系。方法采用免疫組化法觀察RIZ1在159例宮頸鱗癌(Ⅱ b、Ⅲ a 期)患者及20例正常宮頸組織中的表達情況，分析RIZ1在宮頸鱗癌組織中不同組間的差異表達情況，及其與宮頸癌放療敏感性的相關性。結果與正常宮頸組織相比，RIZ1蛋白在宮頸鱗癌組織中的表達水平明顯下降(P<0.001)；RIZ1蛋白的表達水平與宮頸癌的放療敏感性密切相關(P=0.012)，并與FIGO分期(P=0.004)、深肌層浸潤(P=0.026)、盆腔淋巴結轉(zhuǎn)移(P=0.021)以及放療后復發(fā)(P=0.005)密切相關，Logistic回歸結果提示RIZ1蛋白高表達是宮頸癌放療敏感性的獨立預測因素(P=0.045)。結論RIZ1可能參與宮頸鱗癌的發(fā)生與發(fā)展過程，并可能成為評估宮頸鱗癌放療敏感性的候選標志物。

宮頸腫瘤；RIZ1；免疫組化；放療敏感性

宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率在世界范圍內(nèi)居于女性惡性腫瘤的第四位[1]。在美國，2014年宮頸癌的新增病例為12 360例，死亡病例為4 020例[2]。放射治療是中晚期宮頸癌的主要治療方法，也是早期宮頸癌術后輔助治療的主要手段，然而有一部分患者放療敏感性差，預后欠佳。研究表明腫瘤的放療敏感性與細胞缺氧微環(huán)境、細胞周期及增殖活性、DNA損傷修復以及細胞凋亡等密切相關[3-5]。因此如何預測和提高宮頸癌的放療敏感性，改善放療抵抗患者的預后，已成為目前宮頸癌治療中亟待解決的重點和難點問題。

研究發(fā)現(xiàn)，Rb蛋白結合鋅指結構基因(Retinoblastoma protein-interacting zinc finger gene，RIZ)在多種腫瘤組織中表達降低，包括卵巢癌、肝癌、結腸癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤及骨肉瘤等[6-9]，在腫瘤細胞中恢復Rb蛋白結合鋅指結構基因1(RIZ1)的表達可以抑制腫瘤細胞的增殖，并促進凋亡。本研究擬探討宮頸鱗狀細胞癌組織中RIZ1的表達及其與宮頸癌患者臨床病理參數(shù)及放療敏感性的關系，為臨床判斷宮頸癌患者的放療敏感性及預后提供了客觀指標，為治療難治性宮頸癌提供了新的治療策略。

1 資料與方法

1.1 標本來源

研究的病例來自2012年1月—2013年6月在哈爾濱醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院婦科放療病房住院的宮頸鱗癌患者，共159例，年齡32～72歲，平均52.4±4.8歲。臨床分期為FIGO分期Ⅱb及Ⅲa 期，其中Ⅱb期63例，Ⅲa期96例。所有石蠟標本均為放療前活檢標本，病理結果均為鱗狀細胞癌。所有患者均按療程完成根治性放療，治療方案為以鉑類藥物為基礎的同步放化療。同時收集并完善患者的相關臨床資料，分為放療敏感組及放療抵抗組。全部病例在治療前及放療后3個月均行MRI或CT掃描，按照國際統(tǒng)一標準(WHO實體瘤療效判斷標準)進行放療后近期療效的評價：完全緩解(CR)：所有目標病灶消失，結構基本恢復正常；部分緩解(PR)：腫瘤縮小≥50%，結構大部分恢復正常；微效(MR)：腫瘤縮小<50%，結構大部分未正常；無變化(NC)：腫瘤大小無明顯縮??；進展(PD)：腫瘤增大。其中CR+PR為放療敏感組，MR+NC+PD為放療抵抗組。同時于病理科選取20例因子宮肌瘤行全子宮切除術的正常宮頸組織標本作為正常對照。

1.2 主要抗體

兔抗人RIZ1多克隆抗體購自美國Abcam公司(ab3790，工作濃度按1∶100 稀釋)；即用型免疫組化超敏 Ultra Sensitive TM SP 試劑盒(KIT-9720)購自福州邁新生物技術公司。

1.3 免疫組化染色及結果評估

應用免疫組織化學染色SP法，石蠟切片常規(guī)68℃烤片20 min，二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，3%H2O2孵育20 min阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，PBS沖洗3次，每次5 min，置于0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液中煮沸20 min后自然冷卻修復抗原，PBS沖洗3次，每次5 min；滴加封閉血清孵育10 min，傾去血清后勿洗；滴加一抗(工作濃度1∶100稀釋)，4℃孵育過夜，PBS沖洗3次，每次5 min；滴加生物素標記的二抗，室溫下孵育10 min，PBS沖洗3次，每次3 min；除去PBS液，滴加鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液，室溫下孵育10 min，PBS沖洗3次，每次3 min；DAB溶液顯色；自來水充分沖洗，蘇術素復染，PBS沖洗返藍，常規(guī)梯度酒精脫水后干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固；光鏡下觀察實驗結果。應用PBS液代替一抗作為陰性對照組，其余步驟均同實驗組。染色結果的評估分別由兩位高級職稱的病理科醫(yī)生進行觀察和評分，每張切片均在高倍鏡下(40×10倍)隨機觀察10個視野，每個視野內(nèi)計數(shù)100個細胞，RIZ1蛋白的染色結果以細胞的胞漿呈現(xiàn)淡黃色至棕褐色者為陽性，根據(jù)每張切片的陽性細胞比例以及染色強度進行半定量評分，評分標準如下：無胞漿染色評分為0(陰性)；陽性細胞<10%(染色強度為淡黃色)評分為1(弱表達)；陽性細胞≥10%且<50%(染色強度為棕黃色)評分為2(中表達)；陽性細胞≥50%(染色強度為棕褐色)評分為3分(強表達)。最終評分0～1分者為低表達；最終評分2～3分者為高表達。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件對相關的數(shù)據(jù)資料進行統(tǒng)計學分析，計數(shù)資料以頻數(shù)和百分比表示，組間樣本率比較采用χ2檢驗，宮頸癌放療敏感性影響因素分析采用Logistics回歸分析，P<0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 RIZ1蛋白在宮頸鱗癌組織中的表達情況

RIZ1陽性染色呈棕黃色顆粒狀，定位于癌細胞的細胞漿(圖1)，RIZ1在宮頸鱗癌患者中的表達率為32.7%(52/159)，而在正常宮頸組織中的表達率為85.0%(17/20)，與正常宮頸組織相比，RIZ1在宮頸鱗癌組織中的表達水平明顯下降(P<0.001)(表1)。

2.2 RIZ1蛋白在宮頸鱗癌組織中的表達水平與臨床病理參數(shù)的關系

根據(jù)WHO實體瘤療效判斷標準，將保存的宮頸癌組織標本分為放療敏感組及放療抵抗組，RIZ1在放療敏感組中的表達率為37.2%(48/129)，而在放療抵抗組中的表達率為13.3%(4/30)，RIZ1在放療敏感組中的表達水平明顯上升(P=0.012)(表2)。同時結果表明RIZ1高表達與宮頸鱗癌的FIGO分期、深肌層浸潤、盆腔淋巴結轉(zhuǎn)移以及放療后復發(fā)密切相關(P<0.05)。而RIZ1的表達水平與患者年齡、血清SCC水平及腫瘤大小無關(P>0.05)(表2)。

表1 RIZ1在不同宮頸組織中的表達情況

表2 在FIGO IIb和Ⅲa期宮頸鱗癌中RIZ1的表達與臨床病理學參數(shù)之間的關系

2.3 RIZ1蛋白與宮頸癌放療敏感性的關系

對RIZ1表達水平及各個臨床病理參數(shù)與宮頸癌患者放療敏感性的關系行單因素Logistic分析，結果發(fā)現(xiàn)患者年齡、FIGO分期、血清SCC值、腫瘤大小及深肌層浸潤與患者放療敏感性無關(P>0.05)，而盆腔淋巴結轉(zhuǎn)移(P=0.002)及RIZ1表達水平(P=0.017)與患者放療敏感性密切相關(表3)。進一步對單因素分析中與宮頸癌患者放療敏感性有關的參數(shù)行Logistic逐步回歸分析，將患者年齡帶入進行校正，結果發(fā)現(xiàn)RIZ1表達水平(OR=0.313，95%CI：0.101～0.974；P=0.045)是宮頸癌患者是否出現(xiàn)放療抵抗的獨立預測因子，即RIZ1高表達的患者出現(xiàn)放療抵抗的風險降低(表3)。

表3 FIGO Ⅱb和Ⅲa期宮頸鱗癌患者發(fā)生放療抵抗的危險因素分析

圖1 免疫組化檢測RIZ1在人不同宮頸組織中的表達情況(200×)Figure 1 The expression of RIZ1 protein in different cervical tissues(200×)Note：A.High RIZ1 expression in cervical squamous cell cancer tissues；B.Low RIZ1 expression in cervical squamous cell cancer tissues；C.High RIZ1 expression in nomal cervical tissues；D.Low RIZ1 expression in nomal cervical tissues.

3 討論

Buyse等[7]在進行功能性篩選可與Rb結合的蛋白質(zhì)過程中通過Rb探針分離出RIZ基因，RIZ基因可以表達兩種蛋白：RIZ1蛋白(280 kDa)及其替換蛋白產(chǎn)物RIZ2(250 kDa)[10-11]，RIZ1定位于染色體1q36。RIZ1屬于核組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶超家族[12]，為Rb結合蛋白，其基因產(chǎn)物可以與Rb DNA相結合，抑制Rb基因(Retinoblastoma gene)轉(zhuǎn)錄，同時RIZ1蛋白可以與Rb蛋白結合參與Rb途徑，進而發(fā)揮其抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移的作用[13]。

處于不同細胞周期的細胞放療敏感性有所不同，主要原因為染色體結構和內(nèi)源性cAMP含量的差異。其中處于G2期和M期的細胞放療敏感性最高，G1期的細胞次之，而S晚期的細胞對放療的敏感性最差。細胞受到輻射后最主要的死亡方式是凋亡，而以凋亡形式死亡的細胞在整個腫瘤的細胞群體中所占的比例越大，此腫瘤對放射的敏感程度越高。既往關于RIZ1的研究已表明RIZ1在多種腫瘤中發(fā)揮抑癌作用，可以抑制腫瘤細胞的增殖，將細胞阻滯于G2/M期，并且在誘導細胞凋亡方面發(fā)揮重要作用[6-7，14]。多數(shù)學者認為RIZ1的生物學作用是通過與p53的相互作用產(chǎn)生的[15-17]。在單核細胞性白血病細胞中，RIZ1基因的表達受NF-κB和Akt信號通路的調(diào)控，RIZ1基因可誘導p53表達上調(diào)[18]，通過激活p53參與細胞周期的調(diào)控，進而抑制白血病細胞的增殖。在實體瘤的研究中，研究者們發(fā)現(xiàn)RIZ1基因在卵巢癌及神經(jīng)膠質(zhì)瘤等多種腫瘤組織中表達降低，且與腫瘤的預后密切相關[8-9]。RIZ1基因的表達沉默同時存在啟動子甲基化和組蛋白修飾兩種機制。而DNA啟動子區(qū)CpG島甲基化是RIZ1基因表達沉默的最常見原因。用DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑處理肝癌細胞、結腸癌細胞和食管鱗狀細胞，可使RIZ1重新表達，抑制腫瘤細胞的增殖、遷移及侵襲，并誘導腫瘤細胞的凋亡[19-21]。

通過本研究發(fā)現(xiàn)，RIZ1在宮頸鱗癌組織中表達下調(diào)，與放療抵抗組相比，放療敏感組中RIZ1的表達水平升高，而且Logistics回歸分析結果提示RIZ1表達水平(OR=0.313，95%CI：0.101～0.974；P=0.045)是宮頸癌患者是否出現(xiàn)放療抵抗的獨立預測因子，即RIZ1高表達的患者出現(xiàn)放療抵抗的風險降低。因此，本研究推測RIZ1基因可通過誘導細胞周期阻滯(阻滯于G2/M期)、促進細胞凋亡，從而提高宮頸鱗癌細胞的輻射敏感性，去除其由于甲基化而發(fā)生的表達抑制，將會提高臨床宮頸鱗癌的放療療效，為宮頸癌的臨床治療提供新的靶點。

綜上所述，本研究結果提示RIZ1在宮頸鱗癌的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要的臨床意義，其過度表達預示著放療敏感性升高，可以作為判斷宮頸鱗癌放療敏感性的潛在候選標志物，指導患者制定個體化的治療方案，有針對性的采用常規(guī)及非常規(guī)治療(如超分割放療、聯(lián)合化療、使用放療增敏劑等)，既可以提高放療療效、改善病人生存質(zhì)量，又可以避免聯(lián)合化療對機體的損傷，減輕患者的病痛及經(jīng)濟負擔。

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RelationshipbetweenexpressionofRIZ1andclinicopathologicalfactorsorradiosensitivityinhumancervicalsquamouscellcarcinoma

ZHANGYunyan，LIUYaqin，WANGLei，ZHANGLin，CHENGHaiyan，YANGShanshan

Harbin Medical University Cancer Hospital，Harbin 150081，China

ObjectiveThe aim of this study was to analyze the expression of RIZ1 and its association with clinicopathological factors or radiosensitivity in cervical squamous cell carcinoma.Methods159 samples from patients with FIGO stage Ⅱ b and Ⅲ a cervical squamous cell carcinoma were collected and preserved before radiotherapy.The expression of RIZ1 in cervical squamous cell carcinoma tissues and 20 normal cervical tissues was assessed by immunohistochemistry.The relationship between the RIZ1 expression and the clinicopathological factors or radiosensitivity in cervical squamous cell carcinoma was analyzed by statistical analysis.ResultsThe expression of RIZ1 protein was down-regulated in patients with cervical cancer(P<0.001).The level of RIZ1 protein expression was close related to radiosensitivity(P=0.012)，F(xiàn)IGO staging(P=0.004)，deep myometrial invasion(P=0.026)，and pelvic lymph node metastasis(P=0.005).Logistic regression analysis showed that the high expression of RIZ1 protein was an independent predictor of radiosensitivity in cervical cancer(P=0.045).ConclusionRIZ1 may be involved in the occurrence and development process of cervical squamous cell carcinoma and regard as a candidate biomarker for the sensitivity in cervical squamous cell carcinoma in radiotherapy.

Cervical cancer；RIZ1；Immunohistochemistry；Radiosensitivity

黑龍江省教育廳課題(12541371)

哈爾濱醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院(哈爾濱 150081)

張云艷，女，(1972-)，博士，主任醫(yī)師，從事宮頸癌放療增敏的相關研究。

楊姍姍，E-mail：doctor_yss@hotmail.com

R735.7

A

10.11904/j.issn.1002-3070.2017.05.004

(收稿：2017-01-18)