朱為民，黃逸姣，潘 棋，陳艷，謝楠嵐，浦 勇

（1.無錫市第二中醫(yī)醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合腫瘤科，無錫 214000；2.無錫市第四人民醫(yī)院病理科，無錫 214000）

癌胚抗原黏附分子1對胃癌細(xì)胞株AGS生物學(xué)特性的影響

朱為民1，黃逸姣1，潘 棋1，陳艷1，謝楠嵐1，浦 勇2

（1.無錫市第二中醫(yī)醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合腫瘤科，無錫 214000；2.無錫市第四人民醫(yī)院病理科，無錫 214000）

目的：探討癌胚抗原黏附分子1對胃癌細(xì)胞株AGS生物學(xué)特性的影響。方法：將CEACAM1 siRNA轉(zhuǎn)染人胃癌細(xì)胞株AGS，再用western-blot檢測CEACAM1的表達；流式細(xì)胞術(shù)、Transwell實驗和裸鼠負(fù)荷瘤實驗分析轉(zhuǎn)染后的AGS細(xì)胞的生物學(xué)特性變化。結(jié)果：轉(zhuǎn)染CEACAM1 siRNA后的AGS細(xì)胞幾乎不表達CEACAM1。CEACAM1沉默基因?qū)GS細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞周期無影響。轉(zhuǎn)染CEACAM1 siRNA后的AGS細(xì)胞侵襲能力明顯降低，荷瘤裸小鼠腫瘤的生長受到抑制。結(jié)論：沉默CEACAM1基因的表達能夠明顯抑制AGS細(xì)胞的轉(zhuǎn)移以及活體成瘤性，為胃癌的基因治療提供理論依據(jù)。

胃癌；基因轉(zhuǎn)染；流式細(xì)胞術(shù)；癌胚抗原黏附分子1

癌胚抗原相關(guān)黏附分子1（carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1，CEACAM1）是一種跨膜糖蛋白，屬于癌胚抗原家族，屬于免疫球蛋白超家族成員［1］。CEACAM1功能多樣，在不同惡性腫瘤中發(fā)揮著不同的作用。在前列腺癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌及肝癌中扮演著抑癌基因的角色。但在非小細(xì)胞肺癌、黑色素瘤乃至胃癌當(dāng)中，卻起著促進腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的作用。目前CEACAM1的過表達與胃癌發(fā)生、發(fā)展之間的關(guān)系不甚明了，本研究擬通過siRNA抑制CEACAM1的表達，進一步研究CEACAM1的過表達與胃癌細(xì)胞的增殖、凋亡、細(xì)胞周期、轉(zhuǎn)移以及裸鼠體內(nèi)成瘤等之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

人胃癌細(xì)胞株AGS由江南大學(xué)附屬醫(yī)院贈送；40只BALB/c裸鼠購自蘇州大學(xué)實驗動物中心。RPMI 1640、胎牛血清購自Gibco公司；兔抗人CEACAM1單克隆抗體購自Abcam公司。

1.2 siRNA干擾實驗

將人胃癌細(xì)胞株AGS接種于RPMI 1640培養(yǎng)液中，取對數(shù)生長期的AGS細(xì)胞接種于6孔板；24h后，細(xì)胞貼壁，按每孔5μL將CEACAM1 siRNA（100pmol）和Lipofectamine 2000分別加入250μL Opti-MEM I，室溫放置，再把CEACAM1siRNA（100pmol）和Lipofectamine 2000混合均勻，室溫下孵育25min；孵育好的混合物按每孔500μL的標(biāo)準(zhǔn)加入6孔板中，在37℃，5%飽和濕度條件下繼續(xù)培養(yǎng)48h。

1.3 CEACAM1蛋白表達的檢測

將細(xì)胞用0.25%胰酶消化，1500rpm離心5min，PBS洗滌細(xì)胞二次，收集細(xì)胞；向各細(xì)胞中加入150μL的PIPA裂解液，混勻細(xì)胞，水浴30min，12000rpm離心20s后以12%聚丙烯酰胺凝膠分離，然后電轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜上。用10%FBS/ TBST在4℃封閉過夜后，分別用一抗和二抗溫浴1h。最后加發(fā)光底物于暗室中充分反應(yīng)后用膠片曝光20min。最后進行圖像掃描分析。（見圖1）

圖1 CEACAM1蛋白表達

1.4 細(xì)胞生長增殖的檢測

將對數(shù)生長期的AGS細(xì)胞接種于96孔板中，每孔約100μL；24h后轉(zhuǎn)染CEACAM1 siRNA；在37℃，5%飽和濕度條件下繼續(xù)培養(yǎng)7d。每孔加入MTT工作液20μL（5g/L），37℃孵育4h，吸棄上清液，加入100μL DMSO，震蕩15min。在酶標(biāo)儀上測570nm處吸光度（A）值。每組細(xì)胞設(shè)3個復(fù)孔，取平均值。

1.5 細(xì)胞凋亡的檢測

將對數(shù)生長期的AGS細(xì)胞接種于6孔板中，轉(zhuǎn)染CEACAM1 siRNA，48h后PBS洗滌細(xì)胞一次，收集細(xì)胞；用100μL Binding Buffer懸浮細(xì)胞，分別加入5μL AnnexinV-FITC和5μL PI，室溫避光孵育15min后，用FACSort流式細(xì)胞儀分析。實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.6 細(xì)胞周期的檢測

取6孔板中對數(shù)生長期的AGS細(xì)胞，轉(zhuǎn)染CEACAM1 siRNA 48h后，加PBS洗一遍，用0.25%胰酶消化，當(dāng)細(xì)胞變圓時，吹打細(xì)胞，1000rpm離心5min，收集細(xì)胞；加入75%預(yù)冷乙醇，于4℃固定過夜；離心收集細(xì)胞，用PBS洗滌二遍，加入RNA酶（1g/ L）10μL，PI（10mg/L）溶液10μL，0.5%TritonX-100，室溫避光孵育30min，加PBS 400μL，上FACSort流式細(xì)胞儀分析。實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.7 Transwell實驗

AGS細(xì)胞用siRNA處理24h后，Transwell下室內(nèi)加入含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液600μL，上室內(nèi)加入不含血清的RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋成的1*105/mL的細(xì)胞懸液200μL，培養(yǎng)24h后用0.1%結(jié)晶紫染色15min，然后于顯微鏡下計數(shù)，各組低倍鏡下隨機取5個視野計數(shù)，比較各組間細(xì)胞數(shù)的差異。

1.8 裸鼠負(fù)荷瘤實驗

40只裸鼠隨機分為2組，對照組和CEACAM1基因沉默組，每組20只。取對數(shù)生長期的AGS細(xì)胞，轉(zhuǎn)染CEACAM1 siRNA 48h后，分別用胰酶消化細(xì)胞，用PBS液重懸制成2.5*107/mL的單細(xì)胞懸液。每只裸鼠于背部靠后肢皮膚處接種0.2ml細(xì)胞懸液，用苦味酸做好標(biāo)記，繼續(xù)SPF級飼養(yǎng)。觀察腫瘤體積和生長速度，實驗進行4周后，處死裸鼠，稱量體積和瘤重。

1.9 統(tǒng)計分析

采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件分析，組間比較采用t檢驗，P＜0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 siRNA干擾后對CEACAM1蛋白表達的影響

通過Western blot檢測轉(zhuǎn)染si RNA后CEACAM1的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)胃癌細(xì)胞株AGS轉(zhuǎn)染CEACAM1 siRNA后，CEACAM1蛋白幾乎不表達，差異顯著。

2.2 CEACAM1沉默基因?qū)GS細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞周期的影響

1周內(nèi)，CEACAM1基因沉默的AGS細(xì)胞較陰性對照組的生長增殖沒有明顯下降，提示CEACAM1表達降低對AGS細(xì)胞株的生長增殖沒有明顯影響。CEACAM1基因沉默的AGS細(xì)胞凋亡與陰性對照組相比，沒有明顯差異。與陰性對照組相比，CEACAM1基因沉默后的AGS細(xì)胞周期分布沒有明顯改變（見圖2）。

圖2 CEACAM1沉默基因?qū)GS細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞周期的影響

2.3 Transwell 細(xì)胞侵襲性檢測結(jié)果

CEACAM1基因沉默后的AGS細(xì)胞穿過基底膜的細(xì)胞數(shù)為（44.3±6.5），明顯少于陰性對照組的（74.8±8.5），經(jīng)t檢驗，t=12.74，P＜0.01，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.4 裸鼠負(fù)荷瘤實驗

所有40只裸鼠在實驗過程中均成活。處死裸鼠后腫瘤自裸鼠上剝離下來進行肉眼觀察，呈結(jié)節(jié)狀，灰白色，質(zhì)地硬，表面有假包膜，容易與周圍組織剝離。CEACAM1基因沉默組瘤體腫瘤質(zhì)量（0.66±0.29）g、體積（0.64±0.31）cm2，明顯低于對照組的瘤體質(zhì)量（1.49±0.26）g、體積（1.59±0.34）cm2，經(jīng)t檢驗，t值分別為9.53、9.23，P＜0.01，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 討論

CEACAM1廣泛表達于上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞，通過同嗜性和異嗜性黏附介導(dǎo)細(xì)胞間的相互作用，從而參與復(fù)雜的生理和病理生理作用，例如細(xì)胞的生長、分化、活化、凋亡以及免疫調(diào)節(jié)、血管淋巴管的生成、血栓形成和腫瘤代謝生長等［2，3］。

CEACAM1在不同腫瘤細(xì)胞中的表達不一樣，在結(jié)直腸癌、肝癌、前列腺癌、膀胱癌中作為抑癌因子表達是下調(diào)的［4-7］；而在非小細(xì)胞肺癌、惡性黑色素瘤中的表達是上調(diào)的［8，9］。既往的研究顯示，CEACAM1在胃癌中的表達明顯增高，且提示CEACAM1與胃癌的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切［10，11］。為進一步揭示CEACAM1基因?qū)ξ赴┘?xì)胞生物學(xué)行為的影響，筆者通過CEACAM1 siRNA沉默CEACAM1的表達，初步探索CEACAM1的過表達與胃癌細(xì)胞的增殖、凋亡、細(xì)胞周期、轉(zhuǎn)移以及裸鼠體內(nèi)成瘤等之間的關(guān)系。

筆者發(fā)現(xiàn)用CEACAM1 siRNA沉默AGS胃癌細(xì)胞株中的CEACAM1基因后，較對照組相比其增殖情況無明顯改變；而后采用流式細(xì)胞儀檢測CEACAM1 siRNA轉(zhuǎn)染AGS后的凋亡及細(xì)胞周期情況，顯示其凋亡情況和細(xì)胞周期無明顯改變。提示CEACAM1基因可能不參與調(diào)控胃癌細(xì)胞的增殖、凋亡和細(xì)胞周期。而在黑色素瘤中，CEACAM1通過上調(diào)SOX2的表達繼而促進黑色素瘤細(xì)胞的增殖。在增殖期的肺癌A549細(xì)胞中并未檢測到CEACAM1的表達，而在產(chǎn)生細(xì)胞-細(xì)胞接觸抑制的細(xì)胞表面可檢測到其顯著表達；在肺癌A549細(xì)胞中，高表達的CEACAM1能夠明顯抑制A549細(xì)胞的增殖。這也說明在不同類型的腫瘤細(xì)胞中CEACAM1發(fā)揮不同的作用。

Transwell細(xì)胞侵襲實驗中，AGS胃癌細(xì)胞株中的CEACAM1被抑制后，其侵襲性明顯降低，這說明胃癌細(xì)胞中高表達的CEACAM1能夠提高其轉(zhuǎn)移能力。在非小細(xì)胞肺癌、甲狀腺癌和黑色素瘤中也發(fā)現(xiàn)高表達的CEACAM1能夠提高腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移能力，而CEACAM1促進腫瘤細(xì)胞的侵襲能力可能與其能夠促進微血管和毛細(xì)淋巴管的生成相關(guān)。荷瘤裸小鼠人胃癌模型表明，CEACAM1基因沉默組腫瘤質(zhì)量、體積明顯低于對照組的腫瘤質(zhì)量、體積。本研究表明，下調(diào)CEACAM1的表達能夠明顯抑制AGS細(xì)胞的轉(zhuǎn)移以及活體成瘤性，提示CEACAM1在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用，也為進一步研究CEACAM1基因在胃癌中的作用提供了理論依據(jù)。

［1］ Zippel D, Barlev H, Ortenberg R, et al. A longitudinal study of CEACAM1 expression in melanoma disease progression［J］. Oncol Rep, 2015, 33(3)： 1314-8.

［2］ Nguyen T, Chen C J, Shively J E. Phosphorylation of CEACAM1 molecule by calmodulin kinase IID in a three-dimensional model of mammary gland lumen formation［J］. J Bioll Chem, 2014, 289(5)： 2934-45.

［3］ Toffalorio F, Belloni E, Barberis M, et al. Gene expression profiling reveals GC and CEACAM1 as new tools in the diagnosis of lung carcinoids［J］. Br J Cancer, 2014, 110(5)： 1244-9.

［4］ Yamamoto N, Yokoyama S, Ieda J, et al. CEACAM1 and hollow spheroid formation modulate the chemosensitivity of colorectal cancer to 5-fluorouracil［J］. Cancer Chemother Pharmacol, 2015, 75(2)： 421-430.

［5］ 王宏利, 沙小瑩, 郭雅玲, 等. 乙肝相關(guān)性肝癌組織中HBx和CEACAM1的表達水平及意義［J］. 中國實驗診斷學(xué), 2016, 20(3)：384-388.

［6］ Zhang H, Eisenried A, Zimmermann W, et al. Role of CEACAM1 and CEACAM20 in an in vitro model of prostate morphogenesis［J］. Plos One, 2013, 8(1)： 464-467.

［7］ Oliveiraferrer L, Tilki D, Ziegeler G, et al. Dual role of carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1 in angiogenesis and invasion of human urinary bladder cancer［J］. Cancer Res, 2004, 64(24)：8932-8.

［8］ Zhou M Q, Du Y, Liu Y W, et al. Clinical and experimental studies regarding the expression and diagnostic value of carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1 in non-small-cell lung cancer［J］. Bmc Cancer, 2013, 13(1)： 1-10.

［9］ Ullrich N, Heinemann A, Nilewski E, et al. CEACAM1-3S drives melanoma cells into NK cell-mediated cytolysis and enhances patient survival［J］. Cancer Res, 2015, 75(9)： 1897-907.

［10］ Shi J F, Xu S X, He P, et al. Expression of carcinoembryonic antigenrelated cell adhesion molecule 1(CEACAM1) and its correlation with angiogenesis in gastric cancer［J］. Pathol Res Pract, 2014, 210(8)：473-6.

［11］ 陸海炳, 王嘉瑋, 楊金虎, 等. 胃癌血管生成與癌胚抗原相關(guān)黏附分子1的關(guān)系［J］. 中華實驗外科雜志, 2014, 31(3)： 522-523.

The biological characteristic effect of CEACAM1 in the human gastric epithelial cell line AGS

Zhu Wei-min1, Huang Yi-jiao1, Pan Qi1, Chen Yan1, Xie Nan-lan1, Pu Yong2
(1. Department of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, The Second Traditional Chinese Medicine Hospital of Wuxi City, Wuxi 214000, China; 2. Department of Pathology, Wuxi Fourth People’s Hospital, Wuxi 214000, China)

ObjectiveTo detect the biological characteristic effect of CEACAM1 in the human gastric epithelial cell line AGS.MethodssiRNA CEACAM1 was transfected into human gastric cancer cell line AGS, and then relative protein content of CEACAM1 was measured by western blot. Effects of CEACAM1 gene silencing in the human gastric epithelial cell line AGS were analyzed, including the changes in rate of growth, apoptosis and cell cycle. The migration was investigated by Transwell chambers. The AGS cells and CEACAM1 gene silencing AGS cells were injected into nude mice respectively, and tumor formation at the sites of injection monitored.ResultsThe AGS cells which was transfected into CEACAM1 siRNA didn’t express CEACAM1. CEACAM1 gene silencing in cell line AGS has no effect on rate of growth, apoptosis and cell cycle. Transfected CEACAM1 siRNA would decrease the invasion capacity of AGS cell line and inhibit the growth of AGS cell line in nude mice.ConclusionTransfection of CEACAM1 inhibited metastasis and tumor formation in the human gastric epithelial cell line AGS. It may be used in gene therapy for gastric cancer.

gastric cancer; gene transfection; flow cytometry; carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1

R735.2

A

1673-016X（2017）05-0013-03

2017-04-20

無錫市衛(wèi)生局科研項目合同書（NO.MB201403）

浦勇，E-mail：pu776381135@163.com