董巍檑，寧映霞 ，陳 阿，許 暢，崔迎紅，李 翔

（1.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院，衡陽(yáng) 421001；2. 廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣州 510120；3. 湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410006）

TWIST1基因敲低對(duì)DFOG抑制OVCAR3源性球細(xì)胞自我更新和FoxM1表達(dá)的影響

董巍檑1，寧映霞2，陳 阿3，許 暢3，崔迎紅3，李 翔3

（1.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院，衡陽(yáng) 421001；2. 廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣州 510120；3. 湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410006）

目的：探討7-二氟甲氧基-5，4’-二-正辛烷氧基金雀異黃素通過(guò)下調(diào)Twist1/FoxM1表達(dá)抑制OVCAR3源性球細(xì)胞自我更新作用分子機(jī)制。方法：表達(dá)TWIST1 shRNA腺病毒感染OVCAR3源性球細(xì)胞敲低TWIST1基因表達(dá)。腫瘤球形成試驗(yàn)檢查細(xì)胞自我更新能力。蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)細(xì)胞Twist1和FoxM1蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：與OVCAR3細(xì)胞比較，OVCAR3源性球細(xì)胞具有更強(qiáng)自我更新能力以及高水平表達(dá)Twist1和FoxM1蛋白。 TWIST1 shRNA有效抑制OVCAR3源性球細(xì)胞腫瘤球形成和下調(diào)Twist1和FoxM1蛋白表達(dá)。TWIST1 shRNA協(xié)作DFOG（5 μM）抑制OVCAR3源性球細(xì)胞腫瘤球形成和Twist1和FoxM1蛋白表達(dá)。結(jié)論：DFOG可能通過(guò)調(diào)控Twist1表達(dá)抑制FoxM1表達(dá)，進(jìn)而抑制OVCAR3源性球細(xì)胞自我更新。

卵巢癌；卵巢癌干細(xì)胞；7-二氟甲氧基-5，4’-二-正辛烷氧基金雀異黃素；Twist；FoxM1

盡管先前的研究證實(shí)：金雀異黃素新型合成類似物7-二氟甲氧基-5，4’-二-正辛烷氧基金雀異黃素（7-difluoromethoxyl-5，4'-di-n-octyl genistein，DFOG）通過(guò)下調(diào)FoxM1蛋白表達(dá)誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡和抑制卵巢癌干細(xì)胞樣細(xì)胞腫瘤球形成［1-4］。然而，DFOG如何調(diào)節(jié)FoxM1表達(dá)抑制OVCAR3源性球細(xì)胞自我更新能力還有待研究。Qian J等［5］的研究建議Twist1上調(diào)FoxM1促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖。藉此，本文用表達(dá)TWIST1 shRNA腺病毒感染OVCAR3源性球細(xì)胞敲低TWIST1基因表達(dá)；以期闡釋DFOG通過(guò)調(diào)控Twist1表達(dá)抑制OVCAR3源性球細(xì)胞自我更新作用分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

DFOG（分子量：544，性狀：黃色粉末，純度：98%）參照文獻(xiàn)［6］方法合成和結(jié)構(gòu)確證，由湖南師范大學(xué)曹建國(guó)教授惠贈(zèng)。對(duì)照的pHBAd-U6-GFP質(zhì)粒包裝重組腺病毒由中國(guó)漢恒生物技術(shù)公司提供；表達(dá)TWIST1 shRNA重組腺病毒（漢恒生物技術(shù)公司，中國(guó)上海市）：根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)提供的TWIST1基因核苷酸序列（NM_000474），設(shè)計(jì)干擾序列：TWIST1-shRNA（5’to 3’）：atcc-GCTGGACTCCAAGATGGCAAGCTTTTTTTa。病毒滴度：1E+10pfu/mL；規(guī)格：2.0 mL。Opti-MEM試劑購(gòu)自Invitrogen公司（中國(guó)上海市）。

1.2 細(xì)胞來(lái)源與球培養(yǎng)

OVCAR3細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞中心（中國(guó)上海市）。參照文獻(xiàn)［7］的方法和步驟，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)和腫瘤球培養(yǎng)，取OVCAR3細(xì)胞系第2代球細(xì)胞用于基因調(diào)控和藥物干預(yù)試驗(yàn)。

1.3 pHBAd-U6-GFP質(zhì)粒與pHBAd-U6-GFP-shTWIST1質(zhì)粒包裝重組腺病毒感染

取OVCAR3源性球細(xì)胞，Accutase酶細(xì)胞分離溶液消化。每孔1.0× 105個(gè)細(xì)胞接種6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)過(guò)夜允許細(xì)胞貼壁。細(xì)胞生長(zhǎng)至融合度為50%時(shí)吸棄培養(yǎng)基，每孔1.0 mL PBS洗滌2次，每次5min。每孔加1.0 mL Opti-MEM，冰上，將5.0 μL病毒液溶于Opti-MEM試劑；輕柔混勻。感染病毒2 h，然后更換干細(xì)胞培養(yǎng)基，培養(yǎng)48h。

1.4 Western Blot

參照先前發(fā)表文獻(xiàn)［1-4］的方法和步驟完成蛋白質(zhì)印跡分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)錄入SPSS 20.0 for windows evaluation 軟件建立數(shù)據(jù)庫(kù)，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用One Way ANOVA方差分析；方差齊性檢驗(yàn)，在方差齊性時(shí)，多組均數(shù)間比較采用LSD法，在方差不齊時(shí)，多組均數(shù)間采用Tukey's檢驗(yàn)。P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 OVCAR3細(xì)胞系球細(xì)胞不同傳代培養(yǎng)次數(shù)的球形成率比較

如圖1所示，分散的第一代OVCAR3細(xì)胞系球細(xì)胞能夠形成第2代腫瘤球，隨后形成第3代和第4代腫瘤球；以第2代球細(xì)胞在第3次傳代培養(yǎng)得到的腫瘤球體積最大以及腫瘤球形成效率最高（P＜0.05）；腫瘤球傳代培養(yǎng)維持超過(guò)10代。這些結(jié)果說(shuō)明：人卵巢癌OVCAR3細(xì)胞系第2代球細(xì)胞具最強(qiáng)自我更新潛能。

2.2 OVCAR3源性球細(xì)胞更高表達(dá)Twist和FoxM1蛋白

圖2示：與OVCAR3細(xì)胞相比，OVCAR3源性球細(xì)胞Twist1和FoxM1蛋白表達(dá)水平增高。

圖1 OVCAR3細(xì)胞系球細(xì)胞不同傳代培養(yǎng)次數(shù)對(duì)腫瘤球形成的影響與第1次球培養(yǎng)相比：*P＜0.05；與第2次和第4次球培養(yǎng)相比：#P＜0.05。數(shù)據(jù)示3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的均值±標(biāo)準(zhǔn)差（n=9）。

圖2 OVCAR3細(xì)胞和OVCAR3源性球細(xì)胞Twist及FoxMail蛋白表達(dá)的比較OVCAR3：OVCAR3細(xì)胞；OCSLC：OVCAR3源性球細(xì)胞。

2.3 TWIST1 shRNA抑制OVCAR3源性球細(xì)胞腫瘤球形成

與OVCAR3源性球細(xì)胞和表達(dá)GFP基因OVCAR3源性球細(xì)胞相比，表達(dá)TWIST1 shRNA OVCAR3源性球細(xì)胞腫瘤球形成率顯著的下降（圖3；P＜0.05）。

圖3 TWIST1 shRNA對(duì)OVCAR3源性球細(xì)胞腫瘤球形成的影響（Mean ±SD，n=3）OCSLC：OVCAR3源性球細(xì)胞；GFP：表達(dá)GFP基因OVCAR3源性球細(xì)胞；TWIST1 sh RNA：表達(dá)TWIST1 sh RNAOVCAR3源性球細(xì)胞。與OVCAR3源性球細(xì)胞比較：*P＜0.05。與表達(dá)GFP基因OVCAR3源性球細(xì)胞比較：#P＜0.05。

2.4 TWIST1 shRNA沉默TWIST1基因表達(dá)和下調(diào)FoxM1蛋白表達(dá)

與OVCAR3源性球細(xì)胞和表達(dá)GFP基因OVCAR3源性球細(xì)胞相比，表達(dá)TWIST1 shRNA OVCAR3源性球細(xì)胞Twist1和FoxM1蛋白表達(dá)水平平行地下降（圖4；P＜0.05）。

圖4 TWIST1 shRNA對(duì)OVCAR3源性球細(xì)胞Twist1和FoxM1蛋白表達(dá)的影響OCSLC：OVCAR3源性球細(xì)胞；GFP：表達(dá)GFP基因OVCAR3源性球細(xì)胞；sh RNA：表達(dá)TWIST1 shRNAOVCAR3源性球細(xì)胞。

2.5 TWIST1 shRNA協(xié)作DFOG抑制OVCAR3源性球細(xì)胞自我更新

圖5示：DFOG（5.0 μmol/L）降低表達(dá)GFP基因OVCAR3細(xì)胞腫瘤球形成率，TWIST1 shRNA抑制OVCAR3源性球細(xì)胞腫瘤球形成，同時(shí)，TWIST1 shRNA協(xié)作DFOG（5.0μmol/L）抑制OVCAR3源性球細(xì)胞腫瘤球形成（P＜0.05）。

圖5 TWIST1 shRNA、DFOG以及兩者合用對(duì)OVCAR3源性球細(xì)胞腫瘤球形成率影響TWIST1 shRNA、DFOG（5.0 μmol/L）以及兩者合用處理OVCAR3源性球細(xì)胞與表達(dá)GFP基因OVCAR3源性球細(xì)胞比較的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：*P＜0.05。TWIST1 shRNA轉(zhuǎn)導(dǎo)和TWIST1shRNA加DFOG（5.0 μmol/L）與DFOG（5.0 μmol/L）單獨(dú)處理OVCAR3源性球細(xì)胞比較的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：# P＜0.05。

2.6 TWIST1 shRNA協(xié)作DFOG抑制OVCAR3細(xì)胞Twist1和FoxM1蛋白表達(dá)

如圖3所示，DFOG（5.0 μmol/L）降低表達(dá)GFP基因OVCAR3細(xì)胞Twist1和FoxM1蛋白表達(dá)水平，TWIST1 shRNA平行地下調(diào)OVCAR3細(xì)胞Twist1和FoxM1白表達(dá)，同時(shí)，TWIST1 shRNA協(xié)作DFOG（5.0μmol/L）抑制OVCAR3細(xì)胞Twist1和FoxM1蛋白表達(dá)。

圖6 TWIST1 shRNA、DFOG以及兩者合用對(duì)OVCAR3細(xì)胞Twist1蛋白表達(dá)的影響

3 討論

已有研究發(fā)現(xiàn)Twist過(guò)表達(dá)與卵巢癌干細(xì)胞多藥耐藥以及腫瘤患者的轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后有關(guān)［8］。Twist是一種高度保守的堿性-螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子，在胚胎發(fā)育中促進(jìn)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)方面起重要作用。盡管大量研究證據(jù)表明Twist在腫瘤進(jìn)程中的重要性［8-12］，但是，Twist對(duì)卵巢癌干細(xì)胞樣細(xì)胞自我更新的調(diào)節(jié)機(jī)制仍未得到充分理解。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提供的證據(jù)顯示，表達(dá)TWIST1 shRNA OVCAR3源性球細(xì)胞腫瘤球形成率降低，同時(shí)，伴隨著Twist1和FoxM1蛋白表達(dá)水平平行地下降。Qian J等［5］發(fā)表文章指出Twist1上調(diào)FoxM1促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖。結(jié)合先前研究的發(fā)現(xiàn)，即：下調(diào)FoxM1能有效地抑制卵巢癌干細(xì)胞樣細(xì)胞自我更新和逆轉(zhuǎn)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，我們推測(cè)通過(guò)調(diào)控Twist1基因抑制FoxM1表達(dá)可能是一種靶向卵巢癌干細(xì)胞樣細(xì)胞治療人卵巢癌的有希望的策略。

基于我們先前的研究結(jié)果證實(shí)，金雀異黃素新型合成類似物DFOG通過(guò)下調(diào)FoxM1誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡和抑制卵巢癌干細(xì)胞樣細(xì)胞干性［1-4］，我們接下來(lái)觀察了TWIST1 shRNA與適中的有效濃度DFOG（5 μM）合并用藥的效應(yīng)。結(jié)果證實(shí)，TWIST1 shRNA協(xié)作DFOG（5 μM）抑制OVCAR3源性球細(xì)胞腫瘤球形成和下調(diào)Twist1和FoxM1蛋白表達(dá)。從而為驗(yàn)證DFOG通過(guò)調(diào)控Twist1下調(diào)FoxM1蛋白表達(dá)抑制卵巢癌干細(xì)胞樣細(xì)胞（OVCAR3源性球細(xì)胞）自我更新能力的科學(xué)假設(shè)提供證據(jù)。

盡管目前對(duì)于Twist基因的調(diào)控機(jī)制尚未完全闡明，但是，有研究證據(jù)表明Twist轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控可以發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平［9］、轉(zhuǎn)錄后修飾水平［10］、微小RNA調(diào)節(jié)水平［11］和表觀遺傳調(diào)節(jié)水平［12］。因此，闡釋金雀異黃素及其類似物如何調(diào)節(jié)Twist1基因表達(dá)和活性的分子機(jī)制值得深入研究。

［1］ 寧映霞, 曹建國(guó).7-二氟甲氧基-5, 4'-二正辛烷氧基金雀異黃素對(duì)卵巢癌干細(xì)胞樣細(xì)胞自我更新和FoxM1表達(dá)的影響［J］. 湖南師范大學(xué)學(xué)報(bào) (醫(yī)學(xué)版), 2014, (01)： 10-13.

［2］ Ning Y, Li Q, Xiang H, et al. Apoptosis induced by7-difluoromethoxyl-5, 4’-di-n-octyl genistein via the inactivation of FoxM1 in ovarian cancer cells［J］. Oncol Rep.2012, 27(6)： 1857-1864.

［3］ Ning Y, Luo C, Ren K, et al. FOXO3a-mediated suppression of the self-renewal capacity of sphere-forming cells derived from the ovarian cancer SKOV3 cell line by 7-difluoromethoxyl-5, 4’-di-n-octyl genistein［J］. Mol Med Rep.2014, 9(5)： 1982-1988.

［4］ Ning YX, Li QX, Ren KQ, et al.7-difluoromethoxyl-5, 4’-di-n-octyl genistein inhibits ovarian cancer stem cell characteristics through the downregulation of FOXM1［J］. Oncol Lett.2014, 8(1)： 295-300.

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［8］ Nuti SV, Mor G, Li P, et al. TWIST and ovarian cancer stem cells：implications for chemoresistance and metastasis［J］. Oncotarget.2014, 5(17)： 7260-7271.

［9］ Li CW, Xia W, Huo L, et al. Epithelial-mesenchymal transition induced by TNF-α requires NF-κB-mediated transcriptional upregulation of Twist1［J］. Cancer Res.2012, 72(5)： 1290-1300.

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Effects of Knockdown of TWIST1 Gene on Inhibition of self-renewal and the expression of FoxM1 protein in Human Ovarian Cancer OVCAR3-derived Spheroids by DFOG

Dong Wei-Lei1, Ning Ying-Xia2, Chen A3, Xu Chang3, Cui Ying-Hong3, Li Xiang3
(1. Department of Gynaecology and Obstetrics, University of South China, Hengyang 421001, China; 2. Department of Gynaecology and Obstetrics, The First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou 510120, China; 3. Pharmaceutical Science, Medical College, Hunan Normal University, Changsha 410006, China)

ObjectiveTo investigate the molecular mechanism underlying the inhibitory effects of 7-difluoromethoxyl-5, 4’-di-n-octyl genistein (DFOG) on self-renewal capability in OVCAR3 derived spheroids via down-regulating the expression of Twist1/FoxM1.MethodsTWIST1 gene was knockdown using TWIST1 shRNA adenovirus infection of OVCAR3-derived spheroids. The capability of self-renewal was detected using sphere-forming assay. And the protein expressions of Twist1 and FoxM1 were analyzed using western bloting.ResultsCompared with the parental cells, OVCAR3-derived spheroids possessed stronger self-renewal capability and over-expressed Twist1 and FoxM1 protein. TWIST1 shRNA effectively inhibited the capability of sphere forming and the expression of Twsit1 and FoxM1 in OVCAR3-derived spheroids. Twist1 shRNA and DFOG (5 μM) could cooperatively suppress the capability of sphere forming and the expression of Twist1 and FoxM1 in OVCAR3-derived spheroids.ConclusionThe inhibitory effects of DFOG on the capability of self renewal may be associated with regulation of Twist1.

ovariancancer; ovarian cancer stem cell; 7-difluoromethoxyl-5, 4’-di-n-octyl genistein; Twist1; FoxM1

R737. 31

A

1673-016X（2017）05-0004-04

2017-04-15

國(guó)家自然青年基金 （No.81301894）; 廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（No.2014A020211028）; 廣州市教育系統(tǒng)科研項(xiàng)目（No.1201410508）

寧映霞, E-mail: nyingxia@163. com