姜素芳，許 暢，陳 阿，崔迎紅，李 翔，曹建國

（湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，長沙 410013）

芹菜素對肝細胞癌SMMC-7721細胞系干樣細胞自我更新及CK2α表達的影響

姜素芳，許 暢，陳 阿，崔迎紅，李 翔，曹建國

（湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，長沙 410013）

目的：研究芹菜素是否能下調(diào)CK2α表達和抑制SMMC-7721細胞系肝癌干樣細胞自我更新。方法：干細胞培養(yǎng)基超低粘附培養(yǎng)板懸浮培養(yǎng)法擴增肝癌干樣細胞；腫瘤球形成法檢測肝癌干樣細胞的自我更新能力；Western-blot檢測細胞CK2α蛋白表達水平。結(jié)果：人肝細胞癌SMMC-7721細胞系第2代球細胞具有最強自我更新潛能，可用作肝癌干樣細胞模型。芹菜素以濃度依賴方式降低肝癌干樣細胞的腫瘤球形成率以及CK2α蛋白表達水平。結(jié)論：芹菜素抑制肝癌干樣細胞自我更新作用與其下調(diào)CK2α表達相關(guān)。

芹菜素；肝細胞癌；自我更新；CK2α

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）位列癌癥相關(guān)死因第三位，且發(fā)病率逐年上升，現(xiàn)有的治療方法對其治療效果均不理想，因此，進一步研究HCC的發(fā)病機制，尋找新的治療藥物和方法對HCC的治療至關(guān)重要。芹菜素（Apigenin）是一種廣泛分布于藥用植物、蔬菜和水果中的黃酮類化合物，對乳腺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌等多種腫瘤具有預(yù)防、治療或化療增敏作用。魏小華等［1］研究發(fā)現(xiàn)：在Hep G2、Hep 3B和PLC/PRF/5肝細胞癌細胞系中，芹菜素可顯著抑制細胞生長。 Seldin D等［2］的研究表明，芹菜素還可以釋放腫瘤壞死因子2α（TNF2α）和干擾素γ2（IFN2γ）及誘導(dǎo) caspases 活性的方式誘導(dǎo) Hep G2肝癌細胞凋亡。先前的研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌HeLa源性球細胞和卵巢癌SKOV3源性球細胞高水平表達CK2α蛋白，芹菜素可通過失活CK2α抑制HeLa源性球細胞以及卵巢癌SKOV3源性球細胞自我更新能力［3，4］。 但是，芹菜素能否下調(diào)肝癌干樣細胞CK2α表達抑制自我更新還有待驗證。

1 材料和方法

1.1 藥品與試劑

DMEM培養(yǎng)基、DMEM/F12培養(yǎng)基和胎牛血清（美國GIBCO公司），雙抗（美國Invitrogen公司），重組人表皮生長因子（EGF，美國eBioscience公司），堿性成纖維細胞生長因子（bFGF，美國eBioscience公司），不含維生素A的B27添加物（美國Invitrogen公司），胰島素、芹菜素和鼠抗人β-actin單克隆抗體（美國Sigma-Aldrich公司），鼠抗人CK2α單克隆抗體（美國Millipore公司），辣根過氧化酶藕聯(lián)山羊抗鼠（美國SantaCruz Biotechnology公司），增強化學(xué)發(fā)光檢測試劑（美國Amersham Pharmacia Biotech公司）。

1.2 人肝癌SMMC-7721細胞培養(yǎng)

人肝癌SMMC-7721細胞系細胞購自中國科學(xué)院細胞庫（中國，上海）。細胞系在含10% 胎牛血清、100IU/mL青霉素G和100 μg/ml鏈霉素的高葡萄糖DMEM細胞培養(yǎng)基、37°C 、飽和濕度的5% CO2培養(yǎng)箱中單層貼壁生長，常規(guī)3天（1：2）傳代1次擴增。

1.3 腫瘤球培養(yǎng)

按照文獻［5］所述方法，用無血清干細胞培養(yǎng)基（含20 ng/ml bFGF和EGF 、0.02×B27、5 μg/ml胰島素和0.4%牛血清白蛋白的DMEM/F12培養(yǎng)基）懸浮，調(diào)節(jié)細胞密度為10000個/mL，每孔2.0mL接種于6孔超低粘附細胞培養(yǎng)板。在第3天更換新鮮干細胞培養(yǎng)基1次。培養(yǎng)6天，得到非粘附三維克隆性生長的腫瘤球，球體直徑≥50.0μm。

1.4 芹菜素處理與腫瘤球形成率測定

用含不同濃度芹菜素（終濃度為5、10、20 μmol/L）或溶媒（二甲基亞砜終濃度為0.1%）干細胞培養(yǎng)基懸浮人肝細胞癌SMMC-7721第2代球細胞，以2000個/ml的密度每孔0.5 mL接種于24孔超低粘附培養(yǎng)板，第3天更換新鮮干細胞培養(yǎng)基1次，培養(yǎng)6天，獲得新的腫瘤球。計數(shù)每孔腫瘤球數(shù)。腫瘤球形成率計算公式如下：腫瘤球形成率（100%）=每孔腫瘤球均數(shù)/接種活細胞總數(shù)（1000個細胞）×100%。

1.5 蛋白質(zhì)印跡

加入 RIPA 細胞裂解液充分裂解細胞，獲得細胞總提取物，BCA 法測定蛋白濃度。取等量蛋白，進行 12% SDS-PAGE 凝膠電泳分離樣品；將蛋白電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，封閉過夜，一抗 4℃孵育24 h，二抗室溫溫育2 h，化學(xué)發(fā)光法檢測蛋白表達豐度。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗數(shù)據(jù)錄入Spss 15.0 for windows evaluation軟件，建立數(shù)據(jù)庫，各組實驗數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，用One Way ANOVA方式進行方差分析，兩兩比較采用t 檢驗進行統(tǒng)計。

2 結(jié)果

2.1 人肝細胞癌SMMC-7721細胞系原代和第2代球細胞腫瘤球形成率的比較

與人肝細胞癌SMMC-7721細胞相比，SMMC-7721細胞系第2代球形成細胞具較強自我更新能力（圖1）。

2.2 人肝細胞癌SMMC-7721細胞系球細胞與親本細胞CK2α蛋白表達的比較

人肝細胞癌SMMC-7721細胞系第2代球細胞高水平表達CK2α蛋白（圖2）。

圖1 人肝細胞癌SMMC-7721細胞系原代與第2代球細胞腫瘤球形成率的比較PCs：人肝細胞癌SMMC-7721細胞系細胞。SFCs：人肝細胞癌SMMC-7721細胞系第2代球細胞。SFCs與PCs相比：*P＜0.05。

圖2 人肝細胞癌SMMC-7721細胞系球形成細胞高表達CK2α蛋白PCs：人肝細胞癌SMMC-7721細胞系細胞。SFCs：人肝細胞癌SMMC-7721細胞系第2代球細胞。

2.3 芹菜素對SMMC-7721細胞系肝癌干樣細胞自我更新的影響

不同濃度芹菜素（終濃度為5、10、20 μmol/L）顯著降低人肝細胞癌SMMC-7721細胞系第2代球細胞的腫瘤球形成率（圖3）。

圖3 芹菜素降低肝細胞癌SMMC-7721細胞系球細胞的腫瘤球形成率芹菜素（apigenin，5.0、10.0和20.0 μmol/L）處理組與溶媒（0.1% DMSO）對照組比較：*P＜0.05。芹菜素（apigenin，10.0和20.0 μmol/L）處理組與5.0 μmol/L apigenin處理組比較：#P＜0.05。數(shù)據(jù)表示3次獨立實驗的均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD，n=3）。

2.4 芹菜素對人肝細胞癌SMMC-7721細胞系肝癌干樣細胞CK2α蛋白表達的影響

不同濃度芹菜素（終濃度為5、10、20μmol/L）顯著降低人肝細胞癌SMMC-7721細胞系第2代球細胞CK2α蛋白表達水平（圖4）。

圖4 芹菜素降低肝細胞癌SMMC-7721細胞系肝癌干樣細胞CK2α蛋白表達水平與溶媒（0.1% DMSO）對照組比較：*P＜0.05。與5.0 μmol/L apigenin處理組比較：#P＜0.05。數(shù)據(jù)表示3次獨立實驗的均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD，n=3）。

3 討論

腫瘤干細胞理論認為腫瘤組織中存在化療抵抗的干細胞樣細胞群，在肝細胞癌中，肝癌干細胞能在化療后重新構(gòu)建腫瘤［6］。人肝細胞癌SMMC-7721細胞系是肝癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因、蛋白研究及尋找特異性干預(yù)治療靶點的良好模型之一，其生物學(xué)行為接近臨床實際情況［7］。蛋白激酶 CK2 是一類真核細胞中普遍存在的絲/蘇氨酸蛋白激酶，在細胞存活、生長、增殖及凋亡過程中具有重要的功能。在許多實體瘤如結(jié)腸癌、乳腺癌、腎癌、非小細胞肺癌和急、慢性髓性白血病細胞中，CK2 活性均增高［8］。Seldin D等［2］指出，酪氨酸激酶CK2可作為靶向膠質(zhì)瘤和腫瘤干細胞的有希望的靶標(biāo)。

本論文通過體外培養(yǎng)人肝癌SMMC-7721細胞系細胞，采用干細胞培養(yǎng)基超低粘附培養(yǎng)板懸浮培養(yǎng)法擴增球細胞，用Western blot對照檢測人肝細胞癌SMMC-7721細胞系第2代球細胞與親本細胞CK2α蛋白表達水平，結(jié)果證實：與人肝細胞癌SMMC-7721細胞相比。SMMC-7721細胞系第2代球細胞腫瘤球形成率和CK2α蛋白表達水平均顯著增高。提示人肝細胞癌SMMC-7721細胞系第2代球細胞CK2激酶組成性活化，具有更強自我更新能力，可用作肝癌干樣細胞模型。更有意義的是，我們的實驗結(jié)果證明，芹菜素具有下調(diào)CK2α表達和抑制肝癌干樣細胞自我更新作用。這些結(jié)果為評價芹菜素作為靶向干預(yù)肝癌干細胞樣細胞，抑制肝細胞癌細胞自我更新特性，發(fā)揮治療人肝細胞癌作用候選藥物的價值提供有力的實驗依據(jù)。

［1］ 魏小華, 梁杰. 蛋白激酶 CK2在腫瘤生物學(xué)中的作用［J］. 醫(yī)學(xué)綜述, 2011, 17(1) 75-77.

［2］ Seldin D, Landesman-Bollag E, Farago M, et al. CK2 as a positive regulator of Wnt signaling and tumorigenesis［J］ . Mol Cell Bio- chem, 2005, 274(1 /2)： 63-67.

［3］ Tang AQ, Cao XC, Tian L, et al. Apigenin inhibits the self-renewal capacity of human ovarian cancer SKOV3-derived sphere-forming cells［J］. Mol Med Rep.2015, 11(3)： 2221-2226.

［4］ Liu J, Cao XC, Xiao Q, et al. Apigenin inhibits HeLa sphere-forming cells through inactivation of casein kinase 2α［J］. Mol Med Rep, 2015, 11(1)： 665-669.

［5］ Zhang S, Wang Y, Mao JH, et al. Inhibition of CK2α down-regulates Hedgehog/Gli signaling leading to a reduction of a stem-like side population in human lung cancer cells［J］. PLoS One.2012, 7(6)： e38996.

［6］ Siegel R, DeSantis C, Virgo K, et al. Cancer treatment and survivorship statistics［J］, 2012. CA Cancer J Clin.2012, 62(4)： 220-241.

［7］ Begum N, Prasad NR, Kanimozhi G, et al. Apigenin ameliorates gamma radiation-induced cytogenetic alterations in cultured human bloodlymphocytes［J］. Mutat Res, 2012, 747(1)： 71-76.

［8］ Lau EY, Ho NP, Lee TK. Cancer Stem Cells and Their Microenvironment： Biology and Therapeutic Implications［J］. Stem Cells Int, 2017; 2017： 3714190.

Effects of apigenin on self-renewal and expression of CK2α of liver cancer stem-like cells derived from SMMC-7721 cell line

Jiang Su-fang, Xu Chang, Chen A, Cui Ying-hong, Li Xiang, Cao Jian-guo
(Pharmaceutical Science, Medical College, Hunan Normal University, Changsha 410013, China)

ObjectiveTo investigate whether or not apigenin inhibits self-renewal and down-regulates of CK2α expression of liver cancer stem-like cells (LCSLCs) from SMMC-7721 cell line.MethodsSpheres derived fromhuman hepatocellular carcinoma SMMC-7721 cell line was cultured and amplified by suspension culture in ultra-low adhesion plate using stem cellcondition medium refer to LCSLCs. Tumorsphere formation assay was used to determine self-renewal of LCSLCs. Western blot was used to analyze CK2α protein expression level.ResultsThe second generation spheres derived from SMMC-7721 cell line with intensive self-renewal potential take as LCSLCs. Apigenin significantly inhibited self-renewal capacity, and reduced the protein expression level of CK2 α of LCSLCs, in a concentration-dependent manner.ConclusionApigenin inhibited selfrenewal capacity of LCSLCs derived from SMMC-7721 cell line is associated with down-regulation of CK2 α expression.

apigenin; hepatocellular carcinoma; self renewal; CK2α

R735.7

A

1673-016X（2017）05-0001-03

2017-04-15

國家自然科學(xué)基金面上項目 (No.81172375); 長沙市科技局科技計劃項目 (No. K1104060-31)

曹建國, E-mail:caojian2005@yahhao. com. cn