劉彥彥 許振成# 曾 東 陳峻峰 胡艷芳 張偉麗 胡立瓊
(1.環(huán)境保護(hù)部華南環(huán)境科學(xué)研究所,廣東 廣州 510655;2.華南理工大學(xué)環(huán)境與能源學(xué)院,廣東 廣州 510006)
海水養(yǎng)殖廢水沉積物中硝化細(xì)菌的分離及修復(fù)無(wú)機(jī)氮污染的研究*
劉彥彥1許振成1#曾 東1陳峻峰2胡艷芳1張偉麗1胡立瓊1
(1.環(huán)境保護(hù)部華南環(huán)境科學(xué)研究所,廣東 廣州 510655;2.華南理工大學(xué)環(huán)境與能源學(xué)院,廣東 廣州 510006)
針對(duì)海水養(yǎng)殖廢水中的無(wú)機(jī)氮污染,從某石斑魚(yú)養(yǎng)殖池底沉積物中篩選出5株硝化細(xì)菌(5~9號(hào)),并利用該菌進(jìn)行去除養(yǎng)殖廢水中無(wú)機(jī)氮的實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明,5株硝化細(xì)菌對(duì)養(yǎng)殖廢水中氨氮、總氮、硝酸鹽氮和亞硝酸鹽氮均具有去除作用,對(duì)硝酸鹽氮的去除存在相對(duì)延滯。其中,7號(hào)菌株去除效果最好,6h時(shí)對(duì)氨氮、總氮、亞硝酸鹽氮的去除率分別為48%、17%和13%;36h對(duì)硝酸鹽氮的去除率達(dá)18%。
養(yǎng)殖廢水 硝化細(xì)菌 無(wú)機(jī)氮 生態(tài)修復(fù)
Abstract: For inorganic nitrogen pollution of mariculture wastewater,five nitrifying strains (number 5-9) were screened out from a grouper aquaculture bottom sediments. The five nitrifying strains had certain removal effect of ammonia,total nitrogen, nitrate nitrogen and nitrite nitrogen to the grouper aquaculture wastewater, however, there was a relative delay for the removal of nitrate nitrogen. The screened number 7 strains had a better removal efficiency of ammonia nitrogen, total nitrogen and nitrite nitrogen in short time,the removal efficiency was 48%,17% and 13% at 6 h;and the number 7 strains achieved 18% of the removal efficiency of nitrate nitrogen at 36 h.
Keywords: mariculture wastewater; nitrifying strains; inorganic nitrogen; biological remediation
近幾十年來(lái),我國(guó)的海水養(yǎng)殖產(chǎn)量呈逐年遞增態(tài)勢(shì),水產(chǎn)養(yǎng)殖已成為我國(guó)農(nóng)業(yè)的支柱性產(chǎn)業(yè)之一[1-2]。傳統(tǒng)的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)已由小范圍、分散經(jīng)營(yíng)向規(guī)?;?、集約化方向發(fā)展[3-5]。污染的問(wèn)題也隨之產(chǎn)生,近海水域環(huán)境嚴(yán)重惡化,從而導(dǎo)致了近岸海域生態(tài)系統(tǒng)失衡,嚴(yán)重影響了水產(chǎn)養(yǎng)殖生態(tài)安全,制約了海水養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[6]。海水養(yǎng)殖廢水污染主要來(lái)源于殘剩飼料、養(yǎng)殖體排泄物、各類(lèi)化學(xué)藥品等,主要污染元素為氮、磷和有機(jī)物[7]。海水養(yǎng)殖廢水具有兩個(gè)明顯的特點(diǎn):潛在污染物含量低、水量大和廢水分布分散。水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程中,水體的氨、硝酸鹽、亞硝酸鹽等營(yíng)養(yǎng)元素含量過(guò)高所造成的富營(yíng)養(yǎng)化情況頻繁出現(xiàn)[8-12]。除了會(huì)改變水質(zhì)與生物平衡外,氨氮和亞硝酸鹽氮等毒性較高會(huì)對(duì)水生動(dòng)物造成嚴(yán)重影響[13-16]。目前,海水養(yǎng)殖修復(fù)技術(shù)主要包括3類(lèi):物理、化學(xué)和生物修復(fù)。常見(jiàn)物理修復(fù)有底泥疏浚、換水、曝氣、篩網(wǎng)、潑撒沸石灰等,但這類(lèi)方法常需要較高的投資和運(yùn)轉(zhuǎn)費(fèi)用,并且處理效果不徹底[17];化學(xué)修復(fù)主要是運(yùn)用水質(zhì)改良劑、水質(zhì)消毒劑和殺藻劑等改善養(yǎng)殖環(huán)境,但化學(xué)修復(fù)劑易產(chǎn)生有害的次生產(chǎn)物,使得水生態(tài)系統(tǒng)健康狀況惡化,水產(chǎn)品品質(zhì)退化[18];生物修復(fù)是指生物尤其是微生物催化降解環(huán)境污染物,減少或消除環(huán)境污染的自發(fā)過(guò)程[19-22]。微生物法是一種較理想的方法,由微生物引起的硝化-反硝化作用是水中氮素釋放的重要機(jī)制之一[23-25]。
目前,已知的硝化細(xì)菌大多是從淡水環(huán)境中分離得來(lái),能用于海水養(yǎng)殖中水處理的報(bào)道較少[26-29]。硝化細(xì)菌是一類(lèi)具有硝化作用的化能自養(yǎng)細(xì)菌,是生物硝化中起主要作用的微生物,污水中硝化細(xì)菌的含量與硝化速度成正比關(guān)系[30-31]。因此,硝化細(xì)菌具有良好的凈化水質(zhì)的效果,可用于海水養(yǎng)殖生物修復(fù)過(guò)程[32]。本研究從海水養(yǎng)殖廢水沉積物中進(jìn)行硝化細(xì)菌的篩選和分離,然后利用該菌種進(jìn)行去除養(yǎng)殖廢水無(wú)機(jī)氮的實(shí)驗(yàn),從而為海水養(yǎng)殖廢水無(wú)機(jī)氮污染的生物修復(fù)提供菌種儲(chǔ)備和理論支持。
表1 養(yǎng)殖廢水主要水質(zhì)指標(biāo)
菌株分離樣品采自海南省馮家灣區(qū)域某石斑魚(yú)養(yǎng)殖池底沉積物,該養(yǎng)殖場(chǎng)地理坐標(biāo)為110°41′43.6″E,19°24′31.0″N。將菌株分離樣品裝入無(wú)菌離心管中,放入冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室4 ℃保存?zhèn)溆谩?shí)驗(yàn)用養(yǎng)殖廢水取自該養(yǎng)殖池,主要水質(zhì)指標(biāo)見(jiàn)表1。
微量元素溶液:ZnSO42.2 g,CaCl2·2H2O 5.5 g,F(xiàn)eSO4·7H2O 5.0 g,CuSO4·5H2O 1.57 g,CoCl2·6H2O 1.61 g,MnCl2·4H2O 5.0 g,Na2MoO4·4H2O 1.1 g,乙二胺四乙酸二鈉63.7 g,去離子水1 000 mL組成。
亞硝酸細(xì)菌液體培養(yǎng)基:每升由NH4Cl 0.4 g、K2HPO4·3H2O 8.0 g、KH2PO41.5 g、CH3COONa 4.4 g、MgSO4·7H2O 0.1 g、微量元素溶液1 mL組成,pH為7.0~7.3。于121 ℃下滅菌20 min備用。
硝酸細(xì)菌液體培養(yǎng)基:每升由NaNO21.0 g、NaCO31.0 g、CaCO31.0 g、K2HPO4·3H2O 8.0 g、MgSO4·7H2O 0.1 g、微量元素溶液1 mL組成,pH為7.0~7.3。于121 ℃下滅菌20 min備用。
固體培養(yǎng)基:相應(yīng)液體培養(yǎng)基中加入3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的瓊脂粉。
固體斜面培養(yǎng)基:將相應(yīng)的液體培養(yǎng)基裝入20 mL試管中,每支試管裝入1/3(體積分?jǐn)?shù)),再加入3%的瓊脂粉。
稱取兩份40 g沉積物樣品,在無(wú)菌操作臺(tái)上分別接種于事先已滅菌、內(nèi)裝玻璃珠的200 mL亞硝酸細(xì)菌、硝酸細(xì)菌液體培養(yǎng)基的三角瓶中,置于水浴恒溫振蕩器內(nèi)以26 ℃、160 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)2 d。于無(wú)菌操作臺(tái)上分別將培養(yǎng)液接種至新的亞硝酸細(xì)菌、硝酸細(xì)菌液體培養(yǎng)基,接種量為5%(體積分?jǐn)?shù))。重復(fù)此操作3次,共培養(yǎng)8 d,待用。
取上述已富集的培養(yǎng)液分別劃線至亞硝酸細(xì)菌、硝酸細(xì)菌固體培養(yǎng)基。用接種環(huán)挑取培養(yǎng)液在事先制好的平板上劃線至劃滿整個(gè)平皿,再于30 ℃恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng),3~4 d后挑取單菌落劃線至新的平板,重復(fù)操作5次,最后分離出長(zhǎng)勢(shì)較好的單菌落。
用接種環(huán)分別將上述長(zhǎng)勢(shì)較好的10株亞硝酸細(xì)菌和硝酸細(xì)菌單菌落劃線至亞硝酸細(xì)菌、硝酸細(xì)菌固體斜面培養(yǎng)基,于30 ℃下恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d后,放置4 ℃冰箱保存。
1.6.1 生理指標(biāo)鑒定
亞硝酸細(xì)菌鑒定:取10株亞硝酸細(xì)菌單菌落接種于亞硝酸細(xì)菌液體培養(yǎng)基,另取一份亞硝酸細(xì)菌液體培養(yǎng)基接種無(wú)菌水作為對(duì)照。于26 ℃恒溫振蕩器中培養(yǎng)48 h。取培養(yǎng)液及對(duì)照液于白瓷比色板上,加格里斯試劑甲液和乙液各一滴,若有亞硝酸存在則呈紅色。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,5~9號(hào)菌株培養(yǎng)液均呈現(xiàn)紅色,而其他菌株及對(duì)照并沒(méi)有顯色。因此,5~9號(hào)菌株均有硝化活性,即為亞硝酸細(xì)菌。
硝酸細(xì)菌鑒定:取10株硝酸細(xì)菌單菌落接種于硝酸細(xì)菌液體培養(yǎng)基,另取一份硝酸細(xì)菌液體培養(yǎng)基接種無(wú)菌水作為對(duì)照。于26 ℃恒溫振蕩器中培養(yǎng)48 h。取培養(yǎng)液10 mL于試管中,加入醋酸5~8滴使之酸化,再加入數(shù)粒對(duì)氨基苯磺酸,當(dāng)停止放氣時(shí),加入一粒對(duì)氨基苯磺酸,此過(guò)程中NO-轉(zhuǎn)化為氮?dú)庖莩?。分別取去除NO-后的培養(yǎng)液及對(duì)照液于白瓷比色板上,逐滴加入加格里斯試劑,如不呈現(xiàn)紅色,證明亞硝酸已完全消失。再加二苯胺試劑2~4滴,如呈現(xiàn)藍(lán)色說(shuō)明有硝化細(xì)菌的存在。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,均未出現(xiàn)藍(lán)色,證明不存在將亞硝酸氧化成硝酸的菌株,即不存在硝酸細(xì)菌。
1.6.2 分子生物學(xué)鑒定
對(duì)所篩選細(xì)菌做16S rDNA做norB的基因擴(kuò)增,根據(jù)美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(NCBI)設(shè)計(jì):上游引物F(5’-CGGAATTCATGATGTCGCCCAATGGCTC-3’)和下游引物R(5’-CCCAAGCTTTCAGGCGGCCGCCTTGCCGC-3’)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增體系:DNA聚合酶(Easy Taq DNA Polymeerase)1 μL(5 U),10倍的內(nèi)切酶緩沖液(Easy Taq Buffer)5 μL(200 mmol/L三羥甲基氨基甲烷(Tris)-HCl,200 mmol/L KCl,100 mmol/L (NH4)2SO4,20 mmol/L MgSO4),2.5 mmol/L三磷酸堿基脫氧核苷酸(dNTPs)4 μL,引物為1 μL(20 μmol/L),模板DNA為1 μL,其余用雙蒸水補(bǔ)足至50 μL。PCR程序:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性45 s,55 ℃退火45 s,72 ℃延伸90 s,30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR反應(yīng)后以1%(體積分?jǐn)?shù))的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)[33-34]。
養(yǎng)殖廢水使用前先經(jīng)121 ℃下滅菌20 min。將篩出的5株硝化細(xì)菌(5~9號(hào))菌株于無(wú)菌臺(tái)分別接種于500 mL養(yǎng)殖廢水中。使用接種環(huán)向每瓶培養(yǎng)液接入3環(huán)菌株,另取一瓶養(yǎng)殖廢水接種無(wú)菌水作為對(duì)照。將培養(yǎng)液置于120 r/min、30 ℃的恒溫振蕩器中。每次取樣測(cè)定樣品DO、氨氮、亞硝酸鹽氮、硝酸鹽氮,測(cè)定方法見(jiàn)文獻(xiàn)[35],取樣時(shí)間為接種后6、12、24、36、48 h。養(yǎng)殖廢水經(jīng)菌種處理后排入集中處理工程。
將PCR產(chǎn)物送至深圳華大基因科技有限公司做測(cè)序,所測(cè)的序列長(zhǎng)度在1 000 bp左右。將所得序列使用GenBank的BLAST程序進(jìn)行比對(duì),獲得各序列的同源性信息,然后運(yùn)用分子進(jìn)化遺傳分析軟件MEGA5.0中的Kimura2-parameter模型計(jì)算各序列間的距離和序列相似性等,采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),結(jié)果見(jiàn)圖1。
由圖1可知,5、6號(hào)菌與硝化桿菌(Nitrobacter)(NC_007406.1)具有最大同源相似性;7號(hào)菌與硝化菌(Nitrobactersp.)(NZ_CH672423.1、NZ_CH672418.1)具有最大同源相似性;8、9號(hào)菌與NitrobacterNC_007964.1具有最大的同源相似性。因此,結(jié)合1.6節(jié),所篩選的5~9號(hào)細(xì)菌均為硝化細(xì)菌。
2.2.1 氨 氮
氨氮過(guò)高對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖有毒害,非離子氨進(jìn)入水生生物體內(nèi)后,對(duì)酶水解反應(yīng)和膜穩(wěn)定性產(chǎn)生明顯影響,影響水生生物的生理生化指標(biāo)與生長(zhǎng)狀況,進(jìn)而影響水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)量,因此要降低氨氮濃度。由圖2可知,5號(hào)菌隨著時(shí)間的延長(zhǎng)對(duì)氨氮的去除率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì),12 h時(shí)對(duì)氨氮達(dá)到最大去除率(42%),之后對(duì)氨氮的去除率持續(xù)下降;6號(hào)菌在前36 h內(nèi)對(duì)氨氮的去除率呈現(xiàn)緩慢增長(zhǎng)趨勢(shì),36 h時(shí)達(dá)到最大去除率(27%),36~48 h對(duì)氨氮去除率明顯下降;7號(hào)菌在6 h時(shí)對(duì)氨氮去除率達(dá)到最大(48%),之后呈緩慢降低的趨勢(shì),但其對(duì)氨氮均保持較高的去除率;8號(hào)菌隨著時(shí)間的延長(zhǎng)對(duì)氨氮去除率穩(wěn)定在12%左右,表明8號(hào)菌對(duì)氨氮的去除效果具有持續(xù)穩(wěn)定性;9號(hào)菌對(duì)氨氮去除率呈先降低后升高的趨勢(shì),6 h時(shí)去除率最大(36%),24 h時(shí)去除率最小(18%),36~48 h又恢復(fù)到較高的去除率??傮w上,7、9號(hào)菌對(duì)氨氮去除效果具有穩(wěn)定高效的去除效果,且7號(hào)菌對(duì)氨氮的去除效果優(yōu)于9號(hào)菌;5、6號(hào)菌對(duì)氨氮去除作用時(shí)間較長(zhǎng),不利于氨氮的快速去除;8號(hào)菌對(duì)氨氮去除效果持續(xù)穩(wěn)定,但其去除率較低,不利于氨氮的高效去除。不同菌株對(duì)氨氮去除效果存在較大差異可能與其本身對(duì)氨氮的耐受性、自身新陳代謝營(yíng)養(yǎng)需求及其他環(huán)境因素(如DO、pH的變化)的差異而造成。劉少敏等[36]以聚乙烯醇-海藻酸鈉作為包埋載體固定硝化細(xì)菌,制備固定小球,對(duì)生活污水中的氨氮去除效果進(jìn)行研究,結(jié)果表明,在最佳條件狀態(tài)下對(duì)生活污水中氨氮去除率超過(guò)90%。本實(shí)驗(yàn)采用的原位添加細(xì)菌處理養(yǎng)殖廢水的方法達(dá)到48%的去除效果,表明所篩選硝化細(xì)菌具有良好的氨氮去除效果。
圖1 根據(jù)序列和BLAST建立的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.1 Phylogenetic trees of bacterial based on the results of BLAST of sequences
圖2 不同硝化菌株處理下廢水氨氮變化情況Fig.2 The changes of ammonia content of the waste water under the different nitrifying strains
2.2.2 總 氮
水產(chǎn)養(yǎng)殖中總氮升高,會(huì)影響水體C/N,造成水質(zhì)惡化,并影響水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)量。由圖3可知,對(duì)總氮的整體去除效果為7號(hào)菌>9號(hào)菌>8號(hào)菌>5號(hào)菌>6號(hào)菌。7號(hào)菌株在6 h對(duì)總氮達(dá)到一個(gè)較大的去除率(17%),且隨著時(shí)間的推移,7號(hào)菌對(duì)總氮去除效果持續(xù)高效穩(wěn)定在17%左右。由此可知,所篩選出的5株硝化細(xì)菌對(duì)總氮的去除均具有一定的作用,而總氮的去除與反硝化作用有關(guān),水產(chǎn)養(yǎng)殖一步步消耗水體中的DO,使得水體呈現(xiàn)缺氧狀態(tài),通過(guò)反硝化作用,將硝酸鹽氮轉(zhuǎn)化為氮?dú)鈴乃w中逸出,總氮得以在反硝化作用下去除。蘇俊峰等[37]從生物陶粒反應(yīng)器中篩選出6株異養(yǎng)硝化細(xì)菌,將異養(yǎng)硝化細(xì)菌擴(kuò)大培養(yǎng)后,建立序批式活性污泥法(SBR)反應(yīng)器并進(jìn)行了總氮去除的研究,結(jié)果表明,其對(duì)總氮的最大去除率為47.27%。本研究中總氮去除率低于該值,這與SBR間歇運(yùn)行方式有關(guān),故其總氮去除率相對(duì)較高。
圖3 不同硝化菌株處理下廢水總氮變化情況Fig.3 The changes of total nitrogen of the waste water under the different nitrifying strains
2.2.3 硝酸鹽氮
由圖4可知,6、12 h,硝酸鹽氮呈現(xiàn)增加趨勢(shì)。這與硝化細(xì)菌將氨氮轉(zhuǎn)化為硝酸鹽氮和亞硝酸鹽氮有關(guān),相應(yīng)的氨氮含量降低。24~48 h,隨著大部分的氨氮已初步轉(zhuǎn)化,硝化細(xì)菌開(kāi)始其對(duì)硝酸鹽氮的降解產(chǎn)生作用,不同菌株對(duì)硝酸鹽氮的去除效果總體為7號(hào)菌>8號(hào)菌>5號(hào)菌>6號(hào)菌>9號(hào)菌,36 h時(shí)7號(hào)菌株對(duì)硝酸鹽氮的去除率達(dá)到最大(18%)。由此可知,所篩選出的硝化菌株對(duì)硝酸鹽氮均具有一定的去除效果,且其作用時(shí)間均存在相對(duì)延滯。張峰峰等[38]研究表明,硝酸鹽氮的去除主要是反硝化細(xì)菌起作用。本實(shí)驗(yàn)中大部分的氨氮初步轉(zhuǎn)化完全后,硝化細(xì)菌開(kāi)始以硝酸鹽氮為氮源,硝酸鹽氮含量減少。
圖4 不同硝化菌株處理下廢水硝酸鹽氮變化情況Fig.4 The changes of nitrate nitrogen of the waste water under the different nitrifying strains
2.2.4 亞硝酸鹽氮
水體中亞硝酸鹽濃度過(guò)高,易造成水生生物亞硝酸鹽中毒,也是對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖危害較大的無(wú)機(jī)氮污染[39]。由圖5可知,不同硝化菌株對(duì)亞硝酸鹽氮的去除效果總體為7號(hào)菌>9號(hào)菌>5號(hào)菌>6號(hào)菌>8號(hào)菌;7號(hào)菌在取樣的前3個(gè)時(shí)間段均對(duì)亞硝酸鹽氮的去除保持一個(gè)較高穩(wěn)定的去除率,6 h時(shí)達(dá)到最大去除率(13%)。隨著時(shí)間推移,氨氮被硝化細(xì)菌氧化成硝酸鹽氮和亞硝酸鹽氮,使得硝酸鹽氮和亞硝酸鹽氮的含量呈現(xiàn)增加狀態(tài),從而使得亞硝酸鹽氮在48 h時(shí)去除相對(duì)不明顯。部分的硝酸鹽氮和亞硝酸鹽氮在缺氧狀態(tài)下隨著反硝化作用生成氮?dú)獾靡匀コ?,亞硝酸鹽氮維持在一個(gè)相對(duì)平衡的緩慢減少的狀態(tài),這對(duì)于水產(chǎn)養(yǎng)殖是十分有利的。何騰霞等[40]研究表明,亞硝酸鹽氮的去除與反硝化細(xì)菌有關(guān),其篩選出的耐冷反硝化細(xì)菌對(duì)亞硝酸鹽具有高效的去除效果。
圖5 不同硝化菌株處理下廢水硝酸鹽氮變化情況Fig.5 The changes of nitrite nitrogen of the waste water under the different nitrifying strains
5株硝化細(xì)菌對(duì)養(yǎng)殖廢水中氨氮、總氮、硝酸鹽氮和亞硝酸鹽氮均具有去除作用,對(duì)硝酸鹽氮的去除存在相對(duì)延滯。其中,7號(hào)菌株去除效果最好,6 h時(shí)對(duì)氨氮、總氮、亞硝酸鹽氮的去除率分別為48%、17%和13%;36 h對(duì)硝酸鹽氮的去除率達(dá)18%。
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Researchonscreeningofnitrifyingbacteriafrommariculturewastewatersedimentsandbioremediationinorganicnitrogen
LIUYanyan1,XUZhencheng1,ZENGDong1,CHENJunfeng2,HUYanfang1,ZHANGWeili1,HULiqiong1.
(1.SouthChinaInstituteofEnvironmentalScience,MEP,GuangzhouGuangdong510655;2.SchoolofEnvironmentandEnergy,SouthChinaUniversityofTechnology,GuangzhouGuangdong510006)
2016-05-03)
劉彥彥,女,1989年生,碩士,主要從事水污染控制與給水凈化方面的工作。#
。
*國(guó)家水體污染控制與治理科技重大專項(xiàng)(No.2012ZX07206)。
10.15985/j.cnki.1001-3865.2017.08.002