徐 沙，劉樾彤，羅開珺

(云南大學生命科學學院，云南省高校動物遺傳多樣性和進化重點實驗室，昆明 650091)

繭蜂病毒調控寄主細胞的NF-κB信號通路

徐 沙，劉樾彤，羅開珺*

(云南大學生命科學學院，云南省高校動物遺傳多樣性和進化重點實驗室，昆明 650091)

多分DNA病毒(Polydnaviruses，PDVs)是寄生蜂的共生病毒。已有研究報道PDVs能感染寄主血細胞并有特異性表達，但是，哪些病毒的DNA片段能進入寄主細胞，并參與調控NF-κB信號通路仍然還不清楚。本研究結果初步表明，在雙斑側溝繭蜂病毒(Microplitisbicoloratusbracovirus，MbBV)感染細胞后24 h能導致細胞凋亡，vank86、vank92、ptp109病毒基因片段均能在被感染后的Spli221(斜紋夜蛾)、Sf9(草地貪夜蛾)、High Five(粉紋夜蛾)細胞的DNA中檢測到，但轉錄水平有差異。進一步對這3個基因與NF-κB調控的下游抗菌肽基因(attacin、defensin)和免疫基因酚氧化酶原激活酶(ppA3)的相互關系研究發(fā)現(xiàn)：在病毒感染Spli221、Sf9、High Five細胞24 h后，檢測到Spli221細胞中attacin、defensin、ppA3的轉錄本，attacin基因顯著下調；過表達Vank86、Vank92、PTP109的Spli221細胞，由LPS刺激后檢測到只表達單個病毒蛋白的Spli221細胞中的attacin、defensin、ppA3的 mRNA表達水平無顯著變化。研究初步揭示了MbBV病毒感染Spli221細胞后抑制NF-κB信號通路，但單個病毒蛋白不能抑制NF-κB信號通路，實驗結果為進一步深入研究多個病毒基因的共同作用及其在害蟲生物防治中的應用打下了基礎。

多分DNA病毒；脂多糖；NF-κB；抗菌肽；酚氧化酶原激活酶

多分DNA病毒(Polydnaviruses，PDVs)是與寄生鱗翅目的膜翅目姬蜂科Iehneumoniae和繭蜂科Bracoindae寄生蜂共生的一類昆蟲病毒(Dupuyetal., 2006; Amico and Slavicek, 2012)。這兩類病毒的DNA以原病毒的形式整合到寄生蜂的基因組中并以垂直傳播的方式傳給子代寄生蜂(Desjardinsetal., 2008)。病毒在雌蜂卵巢中的萼細胞的細胞核中進行復制和組裝，成熟的病毒粒子儲存在卵巢萼液中，當雌蜂產卵時，病毒粒子隨同寄生蜂的卵一起被注射到寄主血腔中，已有報道表明，進入寄主血腔的病毒DNA能整合到寄主細胞中開始轉錄(Becketal., 2011)。實驗室前期的研究結果發(fā)現(xiàn)13個基因的mRNA可以在寄生后的寄主血淋巴中檢測到，其中包括有：編碼蛋白絡氨酸磷酸酯酶(Protein tyrosine phosphatase，PTP)的基因和編碼病毒錨蛋白重復序列結構(Viral Ankyrin repeat，vank)的基因(Lietal., 2014)。繭蜂病毒中的PTPs蛋白通過抑制免疫細胞的細胞骨架來阻止寄主卵細胞被包囊(Whitfield, 1990; Espagneetal., 2004)。Vanks蛋白屬于IκB-like家族，這類蛋白的錨蛋白重復結構序列和果蠅NF-κB信號通路中IκB家族成員的cactus蛋白具有相似的結構域(Belvin and Anderson, 1996; Sankaretal., 1998; Bae and Kim, 2009)。這兩種蛋白是否具有抑制寄主免疫反應的功能，仍然需要詳細的研究去證實。

免疫刺激因子脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革蘭氏陰性菌細胞壁成分，會激發(fā)昆蟲的先天免疫反應(劉甜和羅開珺，2011)。已有研究報道LPS可以激活小鼠肺損傷中的NF-κB信號通路(Guha and Mackman, 2001; Tianzhu and Shumin, 2015)。NF-κB信號通路是Toll和IMD兩條信號通路下游的一個關鍵分子，果蠅中Toll信號通路被病原體激活后促使NF-κB核轉錄因子Dorsal/Dif從IκB家族成員Cactus上釋放，從而進入細胞核(Lehmingetal., 1995; Nicolasetal., 1998)。IMD信號通路激活后會誘導Relish蛋白上caspase 8調控的片段降解，導致形成NF-κB的N端Rel-68片段進入細胞核而C端Rel-49留在細胞質中與ank蛋白結合，發(fā)揮抑制作用(Stovenetal., 2000; Stovenetal., 2003; 盧新民和葉恭銀，2006)。激活Toll和IMD信號通路中的NF-κB核轉錄因子，調控抗菌肽基因(AMPs)和其他基因的表達(Lemaitreetal., 1996; Chevignonetal., 2014)，保護寄主抵御微生物(病毒、細菌、真菌、原生動物)的入侵(Rutschmannetal., 2002; Panetal., 2012)。然而繭蜂病毒中的ptps和vanks是否參與寄主細胞NF-κB信號通路的調控，目前研究尚不清楚。

本文以雙斑側溝繭蜂病毒(Microplitisbicoloratusbracovirus，MbBV)和Spli221(斜紋夜蛾Spodopteralitura)、Sf9(草地貪夜蛾Spodopterafrugiperda)、High Five(粉紋夜蛾Trichoplusiani)細胞為研究對象，對MbBV-ptp和MbBV-vank病毒片段的功能進行研究。研究表明：MbBV-vank86，vank92和ptp109的病毒基因片段能在被感染的昆蟲細胞的DNA中被檢測到，但轉錄水平有差異。并且MbBV感染Spli221細胞后抑制了NF-κB信號通路活性，但用LPS刺激過表達Vank86、Vank92的Spli221細胞后發(fā)現(xiàn)不能抑制NF-κB下游抗菌肽attacin、防御素defensin的表達，表明MbBV病毒可以抑制NF-κB信號通路，但只表達Vanks中單個病毒蛋白不能調控NF-κB信號通路。這為實驗室進一步深入研究多個病毒基因共同參與作用及其在害蟲生物防治中的應用打下了基礎。

1 材料和方法

1.1 昆蟲細胞培養(yǎng)

Spli221斜紋夜蛾細胞系(Yanaseetal., 1998)、High Five粉紋夜蛾細胞系(Robertetal., 1994)(由中山大學有害生物控制與資源利用國家重點實驗室贈與)；Sf9細胞系(Vaughnetal., 1977)(由云南省出入境檢驗檢疫局動檢處贈與)，以上細胞系均由本實驗室培養(yǎng)、傳代和凍存。培養(yǎng)的培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的Hyclone TNM-FH昆蟲培養(yǎng)基，培養(yǎng)于27℃細胞培養(yǎng)箱中。

1.2 病毒粒子的純化及感染

依照實驗室前期的純化方法將病毒粒子進行純化(Luo and Pang, 2006)，病毒粒子純化好以后，將培養(yǎng)好的不同細胞均勻鋪在細胞瓶中，按1×105細胞用一個雌蜂病毒量進行感染(Luo and Pang, 2006; Becketal., 2011)，分別在感染后(post infection，p.i.)觀察細胞形態(tài)。

1.3 感染寄主細胞中病毒DNA片段的檢測

提取感染后72 h、2周、1個月的細胞DNA進行病毒DNA片段檢測，DNA提取試劑盒購買于北京天根生化科技有限公司。

1.4 感染寄主細胞中病毒mRNA的轉錄檢測

提取感染后72 h、2周、1個月的細胞mRNA反轉錄為cDNA后進行病毒mRNA的轉錄檢測。RNA提取試劑盒(RNAisoTM Plus)；RT-PCR(Perfect Real Time)反轉錄試劑盒購于大連寶生物有限公司。

1.5 引物設計和合成

設計引物時，根據MbBV病毒轉錄組測序發(fā)現(xiàn)的雙斑側溝繭蜂vank86、vank92、ptp109基因序列和attacin、defensin和ppA3的序列(Lietal., 2014)。本論文中所用的引物，均由英濰捷基(上海)貿易有限公司合成，具體序列及說明見表1。

1.6 繭蜂病毒的vank86、vank92、ptp109的真核表達載體構建

取本實驗室已構建好的E-pMD-19T菌液，加A+抗性過夜培養(yǎng)，用試劑盒提取質粒，對vank86、vank92、ptp109進行雙酶切，用同樣的酶切位點對真核pIZT/V5-His載體進行雙酶切。隨后將T載體上的目的基因片段和真核表達載體片段進行膠回收，連接，轉化大腸桿菌DH5α，鑒定(劉信毅和羅開珺，2015)。過夜培養(yǎng)鑒定連接正確的菌液，用無內毒素質粒提取試劑盒提取質粒，用于真核細胞系的轉染和表達。質粒提取試劑盒E.Z.N.A Plasmid Mini Kit I和Endo-free Plasmid Mini Kit II購于OMEGA生物公司，大腸桿菌DH5α購于昆明云科生物技術有限公司。

1.7 細胞轉染和LPS的免疫刺激

用實驗室已建立的轉染方法(Liuetal., 2013)轉染寄主Spli 221細胞48 h后用LPS刺激24 h，LPS的終濃度為15 μg/mL，對照組加入等量的PBS。

1.8 Western blot檢測

真核表達中，細胞轉染72 h后，提取細胞總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度。取50 ug蛋白上樣電泳，300 mA轉膜1.5 h，5%的脫脂牛奶室溫封閉1 h，洗膜后真核表達用V5標簽抗體(1 ∶2000)孵育過夜和二抗(1 ∶5000)孵育1 h，洗膜后用ECL發(fā)光液曝光顯影(劉信毅和羅開珺，2015)。Tubulin抗體、蛋白Marker、HRP偶聯(lián)的羊抗鼠二抗及BeyoECL Plus 購于碧云天公司，V5抗體購于Invitrogen公司。

表1 本研究所用到的引物Table 1 Primers used in this study

1.9 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測

MbBV病毒感染Spli 221、Sf 9、High Five細胞和過表達Vank86、Vank92、PTP109蛋白的Spli221細胞，提取RNA進行反轉錄，然后進行實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測attacin、defensin、ppA3轉錄水平的變化，最終使用非參數(shù)T檢驗分析。

2 結果與分析

2.1 MbBV感染導致昆蟲細胞形成凋亡小體

實驗室先前的研究表明，雙斑側溝繭蜂自然寄生斜紋夜蛾后能夠誘導血細胞發(fā)生凋亡(Luo and Pang, 2006)。為研究MbBV能否直接誘導其它昆蟲細胞凋亡，我們用純化后的MbBV病毒粒子感染Spli221、Sf9、High Five細胞。發(fā)現(xiàn)感染24 h后 Spli221細胞出現(xiàn)凋亡小體，并一直延續(xù)到48 h仍能觀察到凋亡小體，但是，隨著時間的延長，在感染后72 h，就不能觀察到細胞的凋亡小體(圖1A)；在Sf9細胞中，凋亡小體的出現(xiàn)從感染后24 h一直延續(xù)到72 h(圖1B)；同樣，在High Five細胞中，凋亡小體的出現(xiàn)從感染后24 h一直延續(xù)到72 h(圖1C)。結果發(fā)現(xiàn)，MbBV病毒粒子的感染能誘導昆蟲細胞發(fā)生凋亡，而感染后24 h在3種昆蟲細胞中都出現(xiàn)了穩(wěn)定的凋亡癥狀。

圖1 MbBV病毒感染不同昆蟲細胞后的形態(tài)Fig. 1 Morphology of different cells after MbBV infected注：A，MbBV感染Spli221細胞24 h、48 h、72 h時的細胞形態(tài)；B，MbBV感染Sf9細胞24 h、48 h、72 h時的細胞形態(tài)；C，MbBV感染High Five細胞24 h、48 h、72 h時細胞形態(tài)觀察；比例尺= 10 μm。Note: A, morphology of Spli221cell after MbBV infected 24 h, 48 h, 72 h; B, morphology of Sf9 cell after MbBV infected 24 h, 48 h, 72 h; C, morphology of High Five cell after MbBV infected 24 h, 48 h, 72 h; bar=10 μm.

2.2 MbBV感染的昆蟲細胞內，病毒DNA片段的檢測

實驗室的數(shù)據顯示，在感染后短時間內(5 h)，均能在被感染的細胞中檢測到上述3個基因的DNA片段和轉錄mRNA(Yuetal., 2016)，為進一步探明隨感染時間的變化被病毒感染的細胞中是否還存在病毒DNA片段，本研究提取了感染后72 h、2周、1個月的細胞基因組DNA，用vank86、vank92、ptp109引物(表1)進行PCR檢測，結果在細胞的DNA中發(fā)現(xiàn)了vank86、vank92、ptp109基因片段(圖2A、B、C)，但是在感染后72 h，ptp109只在Spli221細胞的DNA中檢測到(圖2B)，結果表明被MbBV感染的細胞DNA中都存在有vank86、vank92、ptp109基因片段。

圖2 MbBV病毒感染不同昆蟲細胞后瓊脂糖凝膠電泳檢測Fig.2 Analysis of MbBV infected different cells by agarose gel electrophoresis注：圖通過Image J反轉；A，MbBV感染Spli221、Sf9、High Five細胞72 h后PCR電泳檢測；B，MbBV感染Spli221、Sf9、High Five細胞2周后PCR電泳檢測；C，MbBV感染Spli221、Sf9、High Five細胞1個月后PCR電泳檢測。Note: The picture Inverting by Image J; A, analysis of PCR product are amplified vank86, vank92, ptp109 when MbBV infected different insect cells(Spli221、Sf9、High Five) 72 h; B, analysis of PCR product are amplified vank86, vank92, ptp109 when MbBV infected different insect cells(Spli221, Sf9, High Five) 2 weeks; C, analys of PCR product is amplified vank86, vank92, ptp109 when MbBV infected different insect cells(Spli221, Sf9, High Five) 1 month.

2.3 MbBV感染后，昆蟲細胞內病毒基因的轉錄檢測

為了進一步探明隨感染時間的變化，在感染細胞DNA中存在的病毒基因片段vank86、vank92、ptp109是否能在細胞內進行轉錄，本研究提取了MbBV感染后72 h、2周、1個月的細胞總RNA，轉錄為cDNA，進行RT-PCR檢測。結果發(fā)現(xiàn)在感染后72 h三種昆蟲細胞均不能檢測到vank86、vank92、ptp109基因片段的mRNA轉錄(圖3A)。但2周時vank86基因片段在Spli221、Sf9、Hive Five細胞中有mRNA的轉錄，vank92基因片段在Sf9、Hive Five細胞中有mRNA的轉錄(圖3B)。1個月時vank86和vank92基因片段只在Sf9細胞中有mRNA的轉錄(圖3C)；相反，ptp109基因片段在整個感染過程中都未能檢測到mRNA的轉錄。結果表明，vank86、vank92、ptp109在MbBV感染不同昆蟲細胞時隨感染時間的延長有轉錄水平的差異。

2.4 MbBV病毒調控凋亡細胞的NF-κB信號通路，抑制抗菌肽基因attacin的轉錄

實驗室前期報道了，雙斑側溝繭蜂影響寄主血細胞凋亡的主要信號通路，包括NF-κB信號通路(Lietal., 2014)。Bitra等2012年報道了毀側溝繭蜂病毒能調控NF-κB信號通路(Bitraetal., 2012)。為檢測MbBV病毒感染Spli221、Sf9、High Five細胞后是否能調控NF-κB信號通路，于是檢測了NF-κB信號通路調控的下游抗菌肽基因attacin和defensin的轉錄(Shubha，1999)。結果發(fā)現(xiàn)病毒感染細胞Sf9、High Five細胞后NF-κB信號通路未被激活(未檢測到抗菌肽基因attacin和defensin的轉錄)。檢測到病毒感染Spli221細胞24 h后attacin顯著下調(圖4)。結果表明，在病毒感染Spli221細胞以后，MbBV病毒抑制Spli221細胞中的NF-κB信號通路。

圖3 MbBV感染不同昆蟲細胞后RT-PCR檢測Fig.3 RT-PCR detection of MbBV infected different cells注：圖通過Image J反轉；A，MbBV感染Spli221、Sf9、High Five細胞72 h后RT-PCR檢測；B，MbBV感染Spli221、Sf9、High Five細胞2周后RT-PCR檢測；C，MbBV感染Spli221、Sf9、High Five細胞1個月后RT-PCR檢測。Note: The picture Inverting by Image J; A, analysis of RT-PCR product is amplified vank86, vank92, ptp109 when MbBV infected different insect cells(Spli221, Sf9, High Five) 72 h; B, analysis of RT-PCR product is amplified vank86, vank92, ptp109 when MbBV infected different insect cells (Spli221, Sf9, High Five) 2 weeks; C, analysis of RT-PCR product is amplified vank86，vank92，ptp109 when MbBV infected different insect cells(Spli221, Sf9, High Five) 1 month.

圖4 MbBV病毒感染Spli221細胞后抗菌肽基因和免疫基因的檢測Fig.4 Amps and immune gene transcription detection after MbBV infected Spli221注：非參數(shù)T檢驗，*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異顯著(P<0.01)，NS表示沒有顯著差異(P>0.05)。Note: Nonparametric tests; *, means significant difference between treatment and control; **, means extremely significant difference between treatment and control; NS, means no significant difference between treatment and control.

2.5 表達單個病毒蛋白不能抑制LPS刺激下的NF-κB信號通路

MbBV病毒感染細胞后，會表達多個病毒蛋白一起參與免疫反應，為檢測只表達單個病毒蛋白的細胞是否也能抑制NF-κB信號通路，于是本研究構建只表達單一病毒蛋白的Vank86、Vank92、PTP109真核表達載體(圖5A)，將驗證正確的質粒轉染進Spli221細胞，72 h后提取細胞總蛋白，用能識別載體本身表達的V5序列的標簽抗體進行Western blot實驗，發(fā)現(xiàn)Vank86、Vank92蛋白在大于23 kDa處有一條特異性的條帶，與預期的融合蛋白大小一致。Vank86的融合蛋白大小為24 kDa，Vank92的融合蛋白大小為23 kDa，然而PTP109在44 kDa處出現(xiàn)一條主要帶(圖5B)。

在Spli221細胞中過表達Vank86、Vank92、PTP109 48 h后，加入LPS刺激細胞24 h后，檢測attacin、defensin、ppA3的mRNA水平，發(fā)現(xiàn)表達Vank86蛋白后，attacin基因表達上調，而表達Vank92蛋白、PTP109蛋白后沒有引起attacin、defensin、ppA3在mRNA水平的變化，以上結果表明：Vank86、Vank92、PTP109不能抑制Spli221細胞中由LPS刺激引起的NF-κB信號通路的變化，調控抗菌肽基因attacin和defensin的轉錄，暗示只表達單個病毒蛋白不能抑制NF-κB信號通路。

圖5 MbBV基因片段在昆蟲細胞中的表達及對抗菌肽相關基因表達的影響(兩次獨立實驗)Fig.5 MbBV segments expression in insect cells and the influence of Amps and immune gene(two independent experiment)注：非參數(shù)T檢驗，*表示差異顯著(P<0.05)，NS表示沒有顯著差異(P>0.05)；A，vank86、vank92、ptp109真核表達結構；B，Western blot檢測Vank86、Vank92、PTP109在Spli221中融合蛋白的表達；C，Vank86不能抑制attacin、ppA3的表達；D，Vank92不能抑制attacin、defensin、ppA3的表達；E，PTP109不能抑制attacin、defensin、ppA3的表達。Note: Nonparametric tests; *, means significant difference between treatment and control; NS, means no significant difference between treatment and control. A, vank86, vank92, ptp109 eukaryotic expression structure; B, expression of fusion protein Vank86-V5-His, Vank92-V5-His, PTP109-V5-His determined by Western blot in Spli221 cells; C, Vank86 didn’t inhibite attacin’s, ppA3’s expression; D, Vank92 didn’t inhibite attacin’s, defensin’s, ppA3’s expression; E, PTP109 didn’t inhibite attacin’s,defensin’s,ppA3’s expression.

3 結論與討論

PDVs可以誘導寄主細胞凋亡，但感染除寄主細胞外的細胞是否會導致細胞凋亡，目前研究尚少。本文研究表明MbBV病毒感染Spli221、High Five、Sf9細胞后會誘導細胞發(fā)生短期的凋亡(圖1)，Sf9細胞在病毒感染后的凋亡細胞的出現(xiàn)時間長于High Five和Spli221細胞，可能與Sf9中存在低水平的激活型Caspase3凋亡蛋白有關(Liuetal., 2013)。High Five和Spli221細胞凋亡可能與細胞中的PI3K信號通路失活有關(Liuetal., 2010)。Spli221細胞感染24 h和48 h細胞表面出現(xiàn)膨泡，但感染Spli221細胞72 h未觀察到細胞凋亡。非常有趣的發(fā)現(xiàn)是，在感染72 h后，未能觀察到Spli221細胞、High Five細胞、Sf9細胞凋亡，這可能是由于病毒隨著感染時間的推移，失去轉錄能力。

病毒DNA可以整合到細胞中(Burke and Strand, 2012)。本研究結果顯示，MbBV病毒vank86、vank92、ptp109基因片段可以在被感染的Spli221細胞、High Five細胞、Sf9細胞中檢測到。本文研究發(fā)現(xiàn)vank86、vank92基因片段在Spli221、High Five、Sf9穩(wěn)定細胞系中檢測到，然而ptp109基因片段不能在穩(wěn)定細胞系中檢測到。已有研究報道Tranosemarostraleichnovirus(TrIV)病毒基因組DNA能整合到Tranosemarostralevirus萼液細胞的細胞系中(Gundersen-Rindal and Pedroni, 2006；Doucetetal., 2007)。本研究中，僅用了病毒基因進行PCR檢測，并不能確定這些基因片段整合進了被病毒感染的細胞中，但已經建立了能穩(wěn)定檢測到病毒DNA的細胞系，正在進行下一步的探索研究。

為了進一步驗證寄主細胞中病毒基因的轉錄表達，本研究進行RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)vank86、vank92、ptp109基因片段轉錄水平有差異，vank86、vank92、在2周和1個月時在Sf9細胞中都有轉錄，但在Spli221細胞和High Five細胞中ptp109未檢測到轉錄，未轉錄的現(xiàn)象可能需要做更精確的實時熒光定量水平的檢測。以上結果表明MbBV病毒基因片段進入寄主細胞后可能行使功能。

在Glyptapantelesindiensisbracovirus(GiBV)病毒中的ptp和vanks，ptp可能會和信號轉導有關，而vanks和抑制NF-κB信號途徑有關(Gundersen-Rindal and Pedroni, 2006)。于是推測ptp和vanks基因編碼的蛋白可能會參與到寄主的免疫系統(tǒng)中。病毒Vank蛋白缺少N端和C端的調控結構域，這些蛋白可以有效的抑制寄主昆蟲的NF-κB信號通路(Espagneetal., 2004; Gundersen-Rindal and Pedroni, 2006)。PDV抑制寄主血淋巴的黑化(melanizadoll)時，寄主免疫系統(tǒng)的抗菌抗病毒能力也會受到影響(Ashida and Brey, 1995)。然而在檢測MbBV病毒感染Spli221、Sf9、High Five細胞后，未檢測到Sf9和High Five細胞中抗菌肽基因和酚氧化還原激活酶的變化，這可能與細胞的種類有關，不同的細胞對外界信號的敏感度存在差異，導致細胞中信號通路的激活之間存在差異。然而檢測到Spli221細胞中的NF-κB信號通路活性受到抑制，這可能是由于病毒蛋白和Spli221細胞中NF-κB蛋白發(fā)生相互作用(Hongladaetal.，2005)，具體原因還需進一步研究。通過LPS刺激Spli221細胞后并未檢測到Vank86、Vank92、PTP109會對NF-κB信號通路產生影響，猜測可能是因為MbBV病毒粒子感染細胞時，存在多個病毒蛋白一起發(fā)揮抑制作用，而用LPS刺激表達單個病毒蛋白的細胞時，病毒蛋白并不能很好的發(fā)揮作用，從而不能抵御外界刺激?？赡苄枰黄鸨磉_多個病毒蛋白才能發(fā)揮作用，具體原因還需要更進一步的實驗進行探究。

本實驗室通過病毒感染細胞后發(fā)現(xiàn)病毒會促進昆蟲細胞產生凋亡小體，并在被感染的細胞中檢測到了病毒基因片段，同時MbBV病毒可以抑制Spli221細胞中的NF-κB信號通路，該研究結果為后期實驗室開展深入的病毒基因的功能研究打下了基礎。

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MbBVregulateshostcell’sNF-κBsignalpathway

XU Sha, LIU Yue-Tong, LUO Kai-Jun*

(Yunnan Province Key Laboratory for University Zoological Genetic Diversity and Evolution, School of Biosciences, Yunnan University, Kunming 650091, China)

Polydnaviruses(PDVs) are symbiotic virus of parasitoid wasps. It has been reported that PDVs can infected and specifically express on the host hemocytes. However, which virus DNA segments can enter the host cell and participate in the regulation of NF-κB signal pathway remain unclear. Our preliminary research results showed thatMicroplitisbicoloratusbracovirus(MbBV) can induce cells apoptosis after infected 24 h. MbBV-vank86，vank92，ptp109 segments were detected in insect cells(Spli221, Sf9, High Five) after infected with MbBV, but there were differences on transcription levels. Further more, We explore the relationship between three genes and downstream of NF-κB signal pathway antibacterial peptide(attacin，defensin) and immune gene prophenolosidase-activating enzyme(ppA3): When MbBV infected Spli221, Sf9, High Five 24 hours, we detect transcription level ofattacin，defensin,ppA3. We findattacindown-regulation extremely. Vank86, Vank92, PTP109 over-expression were detected in Spli221, attacin,defensin, ppA3 mRNA level have no significant difference after LPS stimulated. These results suggested that MbBV can regulate NF-κB signal pathway in Spli221 cell, but single virul protein cann’t inhibit NF-κB signal pathway. The results of this study could offer a reliable experiment basis for exploringmultiple genes function together and insect pests biological control in the future.

Polydnaviruses; lipopolysaccharide; NF-κB; antibacterial peptide; prophenolosidase-activating enzyme

徐沙，劉樾彤，羅開珺.繭蜂病毒調控寄主細胞的NF-κB信號通路[J].環(huán)境昆蟲學報，2017,39(5):1090-1099.

Q963;S476

A

1674-0858(2017)05-1090-10

國家自然科學基金項目(31060251，31260448，31471823)；云南省應用基礎研究計劃重點項目(2013FA003)

徐沙，女，1991年生，云南宣威人，碩士，主要從事昆蟲的先天免疫研究

*通訊作者Author for correspondence, E-mail: kaijun_luo@ynu.edu.cn

Received: 2016-08-02；接受日期Accepted: 2016-12-08