燕霞飛，鄭長(zhǎng)英，李凱月，萬(wàn)方浩，2，王俊平*

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)植物醫(yī)學(xué)學(xué)院,山東省植物病蟲(chóng)害綜合防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東青島 266109;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所,植物病蟲(chóng)害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100193)

球孢白僵菌在重金屬Cd(Ⅱ)作用下抗氧化酶系變化

燕霞飛1，鄭長(zhǎng)英1，李凱月1，萬(wàn)方浩1，2，王俊平1*

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)植物醫(yī)學(xué)學(xué)院,山東省植物病蟲(chóng)害綜合防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東青島 266109;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所,植物病蟲(chóng)害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100193)

測(cè)定球孢白僵菌Beauveriabassiana分生孢子在重金屬鎘Cd(Ⅱ)作用下不同時(shí)間段超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、過(guò)氧化物酶(POD)及谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)活性的變化，以探討球孢白僵菌分生孢子應(yīng)對(duì)重金屬脅迫時(shí)的生理生化反應(yīng)。結(jié)果表明：Cd(Ⅱ)脅迫初始階段(2-6 h)，球孢白僵菌分生孢子中POD活性出現(xiàn)抑制現(xiàn)象，POD對(duì)Cd(Ⅱ)脅迫較敏感。Cd(Ⅱ)脅迫4 h后，GST、SOD、CAT酶活性均顯著增加。GST活性在Cd(Ⅱ)脅迫早期酶活變化最為明顯，對(duì)菌體細(xì)胞起到關(guān)鍵的保護(hù)作用。后期GST活性較低，因此其保護(hù)作用較弱；POD的活性變化則與GST相反，POD在Cd(Ⅱ)脅迫后期對(duì)菌體細(xì)胞起到關(guān)鍵的保護(hù)作用；Cd(Ⅱ)脅迫下，CAT活性穩(wěn)定且變化不明顯但仍高于正常狀態(tài)下的CAT酶活；SOD始終保持高的酶活性，在這些抗氧化保護(hù)酶中，以SOD最為重要。結(jié)果表明,抗氧化酶活性的提高與維持是球孢白僵菌耐Cd(Ⅱ)脅迫的重要生理基礎(chǔ)。

鎘脅迫；球孢白僵菌；抗氧化酶系統(tǒng)；土壤修復(fù)

近年來(lái)，隨著化學(xué)農(nóng)藥大量使用對(duì)農(nóng)產(chǎn)品和環(huán)境帶來(lái)的污染及社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人們對(duì)綠色食品要求的不斷提高，蟲(chóng)生真菌生物防治應(yīng)用正越來(lái)越受到人們的關(guān)注。球孢白僵菌Beauveriabassiana是一類(lèi)重要的廣譜性昆蟲(chóng)病原真菌，為世界上研究和應(yīng)用最多的蟲(chóng)生真菌之一，已被廣泛應(yīng)用于農(nóng)林業(yè)害蟲(chóng)防治中(Fangetal.，2008；Wraightetal.，2010)。球孢白僵菌不僅可以寄生昆蟲(chóng)，而且在寄主昆蟲(chóng)缺乏時(shí)，能夠在不同生態(tài)環(huán)境中營(yíng)腐生生活，土壤被公認(rèn)為是昆蟲(chóng)病原真菌的重要蓄積庫(kù)(Studdertetal.，1990；Pireiraetal.，1993)。

隨著工業(yè)、農(nóng)業(yè)的不斷發(fā)展及各種化學(xué)產(chǎn)品、農(nóng)藥及化肥的廣泛使用，重金屬通過(guò)各種途徑進(jìn)入環(huán)境，造成土壤尤其是農(nóng)田土壤的污染日益嚴(yán)重(Chaneyetal.，2004)。重金屬是一種持久性的有毒污染物，進(jìn)入土壤環(huán)境后不易被化學(xué)或生物降解，易通過(guò)食物鏈及其他途徑進(jìn)入植物、動(dòng)物和人體內(nèi)積累，對(duì)生態(tài)環(huán)境、食品安全和人體健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅，危害極大(Chaneyetal.，1999；Chaneyetal.，2013)。污染面積上看，國(guó)內(nèi)專(zhuān)家認(rèn)為鎘污染最嚴(yán)重(陳同斌等，2003)。據(jù)新近發(fā)布的《全國(guó)土壤污染狀況調(diào)查公報(bào)》(2014)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)鎘污染農(nóng)田面積已超過(guò)28×104hm2，每年生產(chǎn)的鎘含量超標(biāo)農(nóng)產(chǎn)品和動(dòng)物造成的累積性毒害品達(dá)146萬(wàn)噸(易澤夫等，2014)。

國(guó)外一些學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，球孢白僵菌不僅能夠防治害蟲(chóng)，還具有生物轉(zhuǎn)化鎘、銅等重金屬的能力(Khalidetal.，2011)。球孢白僵菌的吸收和吸附作用將土壤中的重金屬清除出土體或?qū)⑵涔潭ㄔ谕寥乐薪档推溥w移性和生物有效性，對(duì)受重金屬污染的土壤具有一定的修復(fù)作用。因此，大量高濃度的球孢白僵菌施用于農(nóng)林業(yè)中時(shí)，部分會(huì)直接接觸寄主昆蟲(chóng)，達(dá)到殺蟲(chóng)的效果；而部分會(huì)蓄積在土壤中，此時(shí)球孢白僵菌會(huì)作為一種鎘吸附劑吸收和吸附土壤中的重金屬鎘。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，鎘處理后的球孢白僵菌殺蟲(chóng)毒性略有降低但沒(méi)有顯著性變化，仍保持高的殺蟲(chóng)毒性，當(dāng)土壤中的球孢白僵菌接觸到寄主昆蟲(chóng)時(shí)，仍作為一種高毒力殺蟲(chóng)真菌起到殺蟲(chóng)的效果。

重金屬脅迫可誘導(dǎo)產(chǎn)生大量活性氧(ROS)從而誘發(fā)生物機(jī)體損壞，真菌自身能夠采取多種機(jī)制抵御重金屬的毒害，分泌抗氧化脅迫的酶類(lèi)物質(zhì)來(lái)減輕重金屬引起的生理毒害是一種重要的胞內(nèi)防御機(jī)制(Banerjeeetal.，1999；徐勤松等，2006)。過(guò)氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)是一個(gè)重要的ROS清除系統(tǒng)，SOD是細(xì)胞抵抗ROS脅迫的第一道屏障，可將其轉(zhuǎn)化為氧化作用相對(duì)較弱的H2O2，再由POD和CAT將H2O2分解成H2O(Lietal.，2005；Sunetal.，2010)。谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)可催化還原型谷胱甘肽GSH結(jié)合過(guò)氧化產(chǎn)物或絡(luò)合自由態(tài)Cd(Ⅱ)，降低細(xì)胞中ROS物質(zhì)的濃度，在防御Cd(Ⅱ)脅迫的過(guò)程中具有重要的作用(Adamisetal.，2001；胡延玲等，2009)。大量實(shí)驗(yàn)表明，低、中劑量Cd(Ⅱ)對(duì)生物體內(nèi)抗氧化酶活性都有不同程度的誘導(dǎo)，而高劑量則導(dǎo)致活性顯著下降(Stebbing，1982；Muradoetal.，2007)。此外，Cd(Ⅱ)對(duì)抗氧化酶活性影響還取決于處理時(shí)間、實(shí)驗(yàn)樣品的來(lái)源及其發(fā)育階段等因素。生物體內(nèi)抗氧化酶系對(duì)重金屬污染相當(dāng)敏感，可作為環(huán)境監(jiān)測(cè)的重要生物指標(biāo)(Niuetal.，2010)。

在抗性機(jī)理研究中，SOD和POD等酶活性的變化已廣泛作為指示抵御逆境傷害的指標(biāo)。此外，有關(guān)研究表明白僵菌可通過(guò)氧化還原、甲基化和去甲基化等作用轉(zhuǎn)化重金屬，使重金屬?gòu)挠卸镜挠坞x態(tài)轉(zhuǎn)化為無(wú)毒或低毒的結(jié)合態(tài)從而改善土壤質(zhì)量(Borchetal.，2009)。

試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，Cd(Ⅱ)濃度達(dá)到50 mg/L時(shí)，球孢白僵菌萌發(fā)率出現(xiàn)明顯的降低，109個(gè)孢子/mL球孢白僵菌分生孢子對(duì)Cd(Ⅱ)的吸附率達(dá)到56.7%，而107個(gè)孢子/mL球孢白僵菌分生孢子對(duì)Cd(Ⅱ)的吸附率達(dá)到28.7%。因此本研究在50 mg/L Cd(Ⅱ)離子懸浮液中培養(yǎng)球孢白僵菌分生孢子，分析球孢白僵菌分生孢子隨培養(yǎng)時(shí)間，活性氧清除體系中關(guān)鍵性酶SOD、POD、CAT及GST等含量的變化，以探討在重金屬污染條件下球孢白僵菌生長(zhǎng)過(guò)程中活性氧代謝與酶活性之間的內(nèi)在聯(lián)系，為進(jìn)一步研究其對(duì)Cd(Ⅱ)的解毒機(jī)制提供了一定的理論基礎(chǔ)，并為球孢白僵菌在保持其高殺蟲(chóng)活性的同時(shí)吸附和轉(zhuǎn)化土壤中的重金屬，改善土壤質(zhì)量提供了科學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1供試菌株

供試球孢白僵菌菌株Bb33A(KU517852)，從野外感染球孢白僵菌的僵蠶體上分離獲得，保存于青島農(nóng)業(yè)大學(xué)昆蟲(chóng)生態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2試劑及儀器

POD、CAT測(cè)試盒為南京建成生物工程研究所生產(chǎn)，L-甲硫氨酸、Na2EDTA、NBT、核黃素、2,4-二硝基氯苯、GSH等均為國(guó)產(chǎn)分析純及生化試劑。水浴鍋，離心機(jī)(Hettich Zentrifugen，EBA20)，酶標(biāo)儀(Thermo Multiskan MK3)，752N紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)。

1.2 材料與處理

球孢白僵菌Bb33A分生孢子加入50 mg/L Cd(Ⅱ)溶液，分生孢子終濃度為2.0×107個(gè)孢子/mL，靜置于25℃恒溫箱。在預(yù)定的時(shí)間取出樣品，每處理3個(gè)重復(fù)，并以0.1%吐溫-80無(wú)菌水作為對(duì)照。樣品12000 g離心5 min，去上清，滅菌的濾紙干燥管底的球孢白僵菌分生孢子。放入-80℃冰箱保存。

1.3 測(cè)定方法

1.3.1酶液的制備

(1)GST粗酶液制備：液氮充分研磨處理樣，加500 μL預(yù)冷的0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH7.5)勻漿。4℃，5000 g離心10 min，取上清液，即為酶的粗提液。

(2)SOD、CAT粗酶液制備：液氮充分研磨處理樣，加500 μL預(yù)冷的0.05 mol/L磷酸緩沖液(pH7.0，含0.1 mmol/L EDTA，4%苯基硫脲)勻漿，4℃，12000 g離心20 min，取上清液，即為酶的粗提液。用于測(cè)定SOD、CAT活性。

(3)POD粗酶液制備：液氮充分研磨處理樣，加500 μL預(yù)冷的0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.5)勻漿。4℃，4000 g離心15 min，取上清液，即為酶的粗提液(彭艷等，2006；張秀波等，2009)。

1.3.2GST、SOD、POD和CAT活性

GST測(cè)定參照Habig方法進(jìn)行(Habigetal.，1974)，通過(guò)檢測(cè)GSH濃度的高低來(lái)反映GST活力的大小；SOD測(cè)定采用氮藍(lán)四唑(NBT)還原法；POD活性測(cè)定采用南京建成POD測(cè)試盒；CAT活性測(cè)定采用南京建成CAT測(cè)試盒。GST活性由酶標(biāo)儀(Thermo Multiskan MK3)測(cè)定，SOD、POD、CAT活性由752N紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定。

1.3.3酶活力測(cè)定

蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)比色法，用牛血清蛋白作標(biāo)準(zhǔn)曲線(Bradford，1976)。蛋白含量由酶標(biāo)儀(Thermo Multiskan MK3)測(cè)定。

SOD與GST酶活力的計(jì)算公式如下：

POD與CAT酶活力的計(jì)算嚴(yán)格按照南京建成生物工程公司試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行，具體計(jì)算公式如下：

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel軟件對(duì)檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行表格處理與制圖，運(yùn)用SPSS 21.0軟件(SPSS Inc.，Chicago，IL，USA)Tukey檢定法進(jìn)行單因子顯著性差異分析。以置信度0.95為差異顯著，結(jié)果以均值表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 球孢白僵菌在Cd(Ⅱ)脅迫下GST活性

球孢白僵菌Bb33A分生孢子在Cd(Ⅱ)脅迫下GST活性隨時(shí)間呈現(xiàn)先上升后下降平穩(wěn)最后下降，此時(shí)趨向未用Cd(Ⅱ)脅迫GST活性的趨勢(shì)(圖1)。Cd(Ⅱ)處理球孢白僵菌分生孢子2 h，GST活性無(wú)明顯變化；Cd(Ⅱ)處理4 h，GST活性顯著增加，6 h后達(dá)到最大值活性增加到466.54%；8 h后，GST酶活性相對(duì)6 h明顯下降，處理8-24 h內(nèi)，GST酶活性穩(wěn)定變化不顯著呈波動(dòng)性，GST活性分別增加到290.58%，347.75%，371.33%，330.05%；48 h后GST活性隨時(shí)間的延長(zhǎng)而下降，趨向未用Cd(Ⅱ)脅迫時(shí)GST活性，分別增加到250.28%，216.90%，171.45%。

圖1 球孢白僵菌分生孢子在Cd(Ⅱ)脅迫后GST比活力Fig.1 Effect of Cd(Ⅱ) on GST specific activity of Beauveria bassiana spores注：柱狀圖上不同小寫(xiě)字母表示組間差異顯著(P<0.05)，相同小寫(xiě)字母者表示組間差異不顯著(P>0.05)，各組酶活均為平均值，下圖同。Note: The different letter superscripts means significant difference (P<0.05), the same letter denoted not significant difference (P>0.05), each enzyme activity were average, the following pictures were the same.

2.2 球孢白僵菌在Cd(Ⅱ)脅迫下SOD活性

球孢白僵菌Bb33A分生孢子在Cd(Ⅱ)脅迫后SOD活性隨時(shí)間呈現(xiàn)先上升后穩(wěn)定的趨勢(shì)(圖2)。Cd(Ⅱ)處理球孢白僵菌分生孢子4 h后，SOD活性提高，10 h后達(dá)到穩(wěn)定。SOD活性由467.34%增加到868.68%；Cd(Ⅱ)處理10-96 h內(nèi)，SOD酶活穩(wěn)定保持較高水平，活性維持在868.68%-1009.5%。

圖2 球孢白僵菌分生孢子在Cd(Ⅱ)脅迫后SOD比活力Fig.2 Effect of Cd(Ⅱ) on SOD specific activity of Beauveria bassiana spores

2.3 球孢白僵菌在Cd(Ⅱ)脅迫下POD活性

球孢白僵菌Bb33A分生孢子在Cd(Ⅱ)脅迫下POD活性隨時(shí)間波動(dòng)較大并且表現(xiàn)出一定的滯后性(圖3)。Cd(Ⅱ)處理球孢白僵菌分生孢子2-6 h內(nèi)，POD活性明顯低于對(duì)照組POD酶活，僅為對(duì)照組POD活性的20.45%-28.77%，POD活性明顯受到抑制；Cd(Ⅱ)處理8 h，POD活性逐漸恢復(fù)至正常水平；Cd(Ⅱ)處理10 h，POD活性顯著性升高，GST活性提高到283.78%；隨后POD活性隨時(shí)間呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，在48 h達(dá)到最大值，POD活性增長(zhǎng)到573.50%；Cd(Ⅱ)處理72 h后POD活性顯著性下降，在96 h時(shí)POD活性又恢復(fù)至正常水平。POD活性的變化表現(xiàn)出一定的滯后性，變化幅度較大，表明POD對(duì)Cd(Ⅱ)脅迫的響應(yīng)較靈敏。

圖3 球孢白僵菌分生孢子在Cd(Ⅱ)脅迫后POD比活力Fig.3 Effect of Cd(Ⅱ) on POD specific activity of Beauveria bassiana spores

2.4 球孢白僵菌在Cd(Ⅱ)脅迫下CAT活性

球孢白僵菌Bb33A分生孢子在Cd(Ⅱ)脅迫下CAT酶活力(圖4)顯示，CAT活性隨時(shí)間波動(dòng)較小。Cd(Ⅱ)處理球孢白僵菌分生孢子2 h，CAT活性未出現(xiàn)明顯變化；Cd(Ⅱ)處理4 h后，CAT活性提高，但增長(zhǎng)率均維持在101.28%-202.78%，變化較小。

圖4 球孢白僵菌分生孢子在Cd(Ⅱ)脅迫后CAT比活力Fig. 4 Effect of Cd(Ⅱ) on CAT specific activity of Beauveria bassiana spores

2.5 Cd(Ⅱ)脅迫對(duì)白僵菌分生孢子GST、SOD、POD與CAT活性影響對(duì)比分析

球孢白僵菌Bb33A分生孢子在Cd(Ⅱ)脅迫下GST、SOD、POD、CAT活性增長(zhǎng)率對(duì)比(圖5)顯示，Cd(Ⅱ)脅迫初始階段(2 h)，GST、CAT、SOD酶活性沒(méi)有明顯變化，而POD酶活性受到嚴(yán)重抑制，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)(2-6 h)，因此POD對(duì)Cd(Ⅱ)脅迫敏感性最高；SOD活性增長(zhǎng)率均大于其他三種酶；GST在Cd(Ⅱ)脅迫的初期(4-8 h)增長(zhǎng)率較大；而POD活性在Cd(Ⅱ)脅迫中期(10-72 h)增長(zhǎng)率較大；Cd(Ⅱ)脅迫后，CAT活性增長(zhǎng)率維持在1.01-2.03，活性提高并保持穩(wěn)定。

圖5 球孢白僵菌分生孢子在Cd(Ⅱ)脅迫后GST、SOD、POD與CAT比活力增長(zhǎng)率Fig.5 The growth rate of antioxidant enzymes of Beauveria bassiana spores after Cd(Ⅱ) stress

3 結(jié)論與討論

球孢白僵菌Bb33A(KU517852)是本實(shí)驗(yàn)室分離純化的一種高殺蟲(chóng)毒性菌株(2×107個(gè)孢子/mL白僵菌Bb33A第9天對(duì)西花薊馬的致死率達(dá)94.93%)，鎘處理后其殺蟲(chóng)毒性會(huì)略有降低但仍保持高的殺蟲(chóng)毒性(致死率由94.93%降至89.66%)，遇到寄主昆蟲(chóng)時(shí)仍具有高的殺蟲(chóng)效果。研究中發(fā)現(xiàn)其對(duì)Cd(Ⅱ)有較強(qiáng)的吸附能力。109孢子/mL球孢白僵菌Bb33A在第4天對(duì)Cd(Ⅱ)的吸附率達(dá)到56.7%(數(shù)據(jù)未發(fā)表)；同時(shí)還發(fā)現(xiàn)一方面Cd(Ⅱ)會(huì)影響、抑制球孢白僵菌Bb33A的生長(zhǎng)及代謝活動(dòng)。另一方面，球孢白僵菌Bb33A自身能夠采取多種機(jī)制抵御Cd(Ⅱ)的毒害，對(duì)Cd(Ⅱ)有較強(qiáng)的抗性(在一定Cd(Ⅱ)濃度范圍內(nèi)，球孢白僵菌Bb33A萌發(fā)率、產(chǎn)孢量及徑向生長(zhǎng)保持較高水平)。細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生抗氧化酶類(lèi)物質(zhì)以減輕重金屬引起的氧化脅迫是一種重要的抵御機(jī)制。

經(jīng)Cd(Ⅱ)脅迫后，球孢白僵菌分生孢子體內(nèi)的各種抗氧化酶活性均出現(xiàn)明顯提高，這可能是由于球孢白僵菌分生孢子在逆境條件下，胞內(nèi)的保護(hù)酶系統(tǒng)原有的平衡遭到破壞，導(dǎo)致自由基清除能力減弱，體內(nèi)自由基水平發(fā)生變化，各種抗氧化酶參與調(diào)節(jié)而活性升高(魯雙慶等，2002；何潔等，2013)。有關(guān)研究發(fā)現(xiàn)重金屬耐性品種(玉米、玉豆等)在重金屬(鋁、鎘等)脅迫下抗氧化酶活性顯著高于重金屬敏感性品種(彭艷等，2006；李冬琴等，2015)?？梢?jiàn)，生物體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)的能力強(qiáng)弱可能是其對(duì)重金屬脅迫耐性差異的關(guān)鍵因素。

Cd(Ⅱ)脅迫初始階段，POD酶活性受到嚴(yán)重抑制，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)(2-6 h)，因此POD對(duì)Cd(Ⅱ)脅迫敏感性最高。一方面重金屬干擾物質(zhì)在細(xì)胞中的運(yùn)輸過(guò)程，抑制蛋白質(zhì)的合成，進(jìn)而抑制細(xì)胞內(nèi)一些保護(hù)酶的活性，導(dǎo)致大量的超氧陰離子自由基產(chǎn)生(Liu，2010；Gusmanetal.，2013)。另一方面Cd(Ⅱ)可以與蛋白質(zhì)分子中的羥基(—OH)、氨基(—NH2)、巰基(—SH)等結(jié)合，使蛋白質(zhì)產(chǎn)生不可逆轉(zhuǎn)的變性，從而破壞酶系統(tǒng)的正常生理功能(Romero-Puertasetal.，2004)。此外Cd(Ⅱ)和巰基的親和力比鋅大，可與鋅蛋白酶發(fā)生親合反應(yīng)，置換出鋅離子，使其酶活性喪失(Smeetsetal.，2005)。鎘處理2 h時(shí)，各種抗氧化酶由于以上原因酶活性或多或少受到影響，此時(shí)機(jī)體的解毒機(jī)制未開(kāi)啟或受到抑制，因此更能反映出各種酶對(duì)鎘的敏感性，根據(jù)2 h時(shí)各種酶的活性的增長(zhǎng)率，4種抗氧化酶對(duì)Cd(Ⅱ)脅迫的敏感性順序?yàn)镻OD>SOD>GST>CAT，這與幾種酶的空間結(jié)構(gòu)相關(guān)。

GST分子具有細(xì)胞解毒和抗氧化雙重功效。有研究證實(shí)，GST參與重金屬解毒的過(guò)程主要通過(guò)兩種方式：一是GST基因能夠催化還原型谷胱甘肽(GSH)直接與Cd(Ⅱ)離子共價(jià)結(jié)合，將Cd(Ⅱ)轉(zhuǎn)運(yùn)到液泡或質(zhì)外體，從而達(dá)到解毒的目的(Perrinetal.，1971；Adamisetal.，2009)；二是GST還具有谷胱甘肽過(guò)氧化物酶GPOX活性，降低細(xì)胞中活性氧物質(zhì)的濃度，從而減少氧化脅迫引起的損傷(Edwardsetal.，2000)。有關(guān)研究通過(guò)半定量表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，銅和鎘脅迫均能促使厚殼貽貝GST基因表達(dá)量升高為對(duì)照的6.95倍，且表現(xiàn)為時(shí)間依賴(lài)型(劉慧慧等，2014)。本試驗(yàn)中GST在Cd(Ⅱ)脅迫初期(4-24 h)活性呈明顯上升，說(shuō)明GST參與球孢白僵菌分生孢子的解毒過(guò)程，是該過(guò)程中關(guān)鍵抗氧化酶，對(duì)于球孢白僵菌防御Cd(Ⅱ)脅迫起到至關(guān)重要的作用。

從各酶系間變化差異來(lái)看，4種酶中SOD對(duì)Cd(Ⅱ)脅迫的應(yīng)激性最強(qiáng)，自Cd(Ⅱ)脅迫4 h后，SOD活力一直呈激活狀態(tài)，SOD酶活性可達(dá)到對(duì)照的10倍左右；POD酶自Cd(Ⅱ)脅迫8 h后隨時(shí)間的延長(zhǎng)增加，在48 h時(shí)達(dá)到最大，是對(duì)照的5.7倍，該生態(tài)效應(yīng)得到來(lái)自國(guó)外的有關(guān)資料的支持。SOD和POD是抗氧化防御系統(tǒng)最重要的抗氧化酶之一，其活性越高，機(jī)體對(duì)ROS傷害的防御能力越強(qiáng)(彭艷等，2006；李冬琴等，2015)。SOD能將ROS轉(zhuǎn)化為氧化作用相對(duì)較弱的H2O2，再由POD和CAT將H2O2分解成H2O，因此SOD是細(xì)胞抵抗ROS脅迫的第一道屏障(Banerjeeetal.，1999；胡延玲等，2009；Sunetal.，2010)。Cd(Ⅱ)脅迫后，球孢白僵菌分生孢子內(nèi)POD及SOD酶激活至較高水平，這說(shuō)明受Cd(Ⅱ)脅迫的球孢白僵菌分生孢子對(duì)體內(nèi)的Cd(Ⅱ)成分有了一定的耐受性，POD及SOD活性提高清除ROS的能力增強(qiáng)，對(duì)維持細(xì)胞正常生理功能起到了一定保護(hù)作用，表現(xiàn)出對(duì)Cd(Ⅱ)毒害的緩慢適應(yīng)。

Cd(Ⅱ)脅迫4 h后，CAT活性增長(zhǎng)率維持在1.01-2.03，活性提高并保持穩(wěn)定，說(shuō)明在Cd(Ⅱ)脅迫時(shí)，球孢白僵菌分生孢子體內(nèi)的CAT保護(hù)酶發(fā)揮作用以消除多余自由基，來(lái)維持生命活動(dòng)的正常進(jìn)行。

當(dāng)重金屬濃度過(guò)大或處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，脅迫性加劇，生物體內(nèi)產(chǎn)生的ROS超過(guò)生物體的清除能力時(shí)，便產(chǎn)生“毒物抑制效應(yīng)”，對(duì)組織和細(xì)胞造成損傷，影響生物體的正常生理活動(dòng)，使酶活性降低和喪失，甚至導(dǎo)致細(xì)胞或者生物體死亡(徐楠等，2003)。球孢白僵菌Bb33A中POD及GST兩種抗氧化酶活性隨Cd(Ⅱ)脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)最終會(huì)出現(xiàn)減少的趨勢(shì)，這可能是因?yàn)殡S著Cd(Ⅱ)脅迫的持續(xù)，過(guò)多的ROS影響了POD及GST酶活性，而Foyer等(2000)認(rèn)為可能是非酶促系統(tǒng)的應(yīng)激反應(yīng)加強(qiáng)的結(jié)果，即當(dāng)一類(lèi)抗氧化物質(zhì)被大量消耗后，細(xì)胞就會(huì)啟動(dòng)其他解毒過(guò)程來(lái)維持其正常生命狀態(tài)。

綜合以上分析可以得知球孢白僵菌Bb33A分生孢子在受到Cd(Ⅱ)脅迫后可以快速適應(yīng)，及時(shí)調(diào)節(jié)(Cd(Ⅱ)脅迫4 h后，GST、CAT、SOD活性明顯提高)體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)防御Cd(Ⅱ)脅迫對(duì)其造成的毒害，以保障細(xì)胞正常生長(zhǎng)發(fā)育及生理功能的完成。該研究中4種抗氧化酶協(xié)同抗Cd(Ⅱ)脅迫，共同組成防御過(guò)氧化系統(tǒng)，及時(shí)有效地清除體內(nèi)的ROS以抵抗環(huán)境不良條件對(duì)機(jī)體的破壞。但機(jī)體在Cd(Ⅱ)脅迫下的調(diào)節(jié)能力是臨時(shí)和有限的，抗氧化酶POD、GST活性并沒(méi)有無(wú)限地提高，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，脅迫性加劇遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)機(jī)體所能耐受的能力，細(xì)胞內(nèi)多種活性物質(zhì)包括抗氧化酶系受到損傷而使活性下降甚至失活(曾曉敏等，2002)。

此外，有關(guān)研究表明微生物可通過(guò)氧化還原、甲基化和去甲基化等作用轉(zhuǎn)化重金屬，使重金屬?gòu)挠卸镜挠坞x態(tài)轉(zhuǎn)化為無(wú)毒或低毒的結(jié)合態(tài)(Borchetal.，2009)。因此探討在重金屬污染條件下球孢白僵菌生長(zhǎng)過(guò)程中活性氧代謝與酶活性之間的內(nèi)在聯(lián)系，為進(jìn)一步研究重金屬污染對(duì)球孢白僵菌的損傷及球孢白僵菌對(duì)Cd(Ⅱ)抗性機(jī)制提供依據(jù)，從而為球孢白僵菌在保持其高殺蟲(chóng)活性的同時(shí)吸附和轉(zhuǎn)化土壤中的重金屬，改善土壤質(zhì)量提供了科學(xué)基礎(chǔ)。

鎘污染越來(lái)越成為世界性的環(huán)境問(wèn)題，已引起人們的廣泛關(guān)注。研究Cd(Ⅱ)脅迫對(duì)球孢白僵菌抗氧化酶的影響為進(jìn)一步研究球孢白僵菌對(duì)Cd(Ⅱ)的解毒機(jī)制提供了一定的理論基礎(chǔ)，并為球孢白僵菌在保持其高殺蟲(chóng)活性的同時(shí)吸附和轉(zhuǎn)化土壤中的重金屬，改善土壤質(zhì)量提供了科學(xué)基礎(chǔ)。Cd(Ⅱ)脅迫誘導(dǎo)球孢白僵菌Bb33A中ROS累積，高水平的抗氧化酶活性是白僵菌33A耐重金屬Cd(Ⅱ)的重要機(jī)制之一，在這些抗氧化保護(hù)酶中，以SOD最為重要。這些抗氧化保護(hù)酶活性不可能無(wú)限地提高，其在Cd(Ⅱ)脅迫下的調(diào)節(jié)能力是臨時(shí)和有限的。

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TheeffectofCd(Ⅱ)onantioxidantenzymescctivityofBeauveriabassiana

YAN Xia-Fei1, ZHENG Chang-Ying1, Li Kai-Ye1, WAN Fang-Hao1,2, WANG Jun-Ping1*

(1. Key Laboratory of Integrated Crop Pest Management of Shandong Province, College of Plat Health and Medicine, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China; 2. Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China)

The effects of heavy metals Cd(Ⅱ) on antioxidant enzyme (SOD, CAT, POD and GST) activities ofBeauveriabassianawere studied.B.bassianaspores were exposed to Cd(Ⅱ) at different times in order to evaluate the responses of the spores to heavy metal stress. The enzyme activity of POD was decreased at the inception phase of Cd(Ⅱ) stress, and it was more sensitive to Cd(Ⅱ) stress. The enzyme activities of GST, SOD, CAT were significant increased after four hours of Cd(Ⅱ) stress. The change activity of GST was most evident at the early stress of Cd(Ⅱ), and it may play a key role in the protection ofB.bassianacell. Otherwise, it has no significant effect on cell later on; The change activity of POD was reversed, POD may play a key role in the protection ofB.bassianacell at the late stage of stress; The activity of CAT was stability and did not change significantly, it’s still higher than the activity of CAT in the normal state; SOD has always maintained a high enzyme activity. Among these antioxidant protection enzymes, SOD has the greatest importance. This indicted that the improve and maintain in the activities of antioxidant system were one of the physiological basis for the tolerance to Cd(Ⅱ) stress inB.bassianaspores.

Cd(Ⅱ) stress;Beauveriabassiana; antioxidant system; soil remediation

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Q956.9;S476

A

1674-0858(2017)05-0992-08

國(guó)家自然科學(xué)基金(31201577)；青島農(nóng)業(yè)大學(xué)高層次人才科研基金(630609)；山東省“泰山學(xué)者”建設(shè)工程專(zhuān)項(xiàng)經(jīng)費(fèi)

燕霞飛，女，1992年生，山東東營(yíng)人，碩士研究生，研究方向?yàn)檗r(nóng)業(yè)昆蟲(chóng)與害蟲(chóng)防治，E-mail：1572514891@qq.com

*通訊作者Author for correspondence, E-mail: junpingwang@qau.edu.cn

Received: 2016-09-22; 接受日期Accepted: 2016-11-22