侯曉夢，劉連濤，李夢，孫紅春，張永江，杜歡，李存東

?

基于iTRAQ技術(shù)對棉花葉片響應(yīng)化學(xué)打頂?shù)牟町惖鞍踪|(zhì)組學(xué)分析

侯曉夢1,2，劉連濤1,2，李夢4，孫紅春1,2，張永江1,2，杜歡2,3，李存東2

（1河北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河北保定 071000；2河北省作物生長調(diào)控實驗室，河北保定 071000；3河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北保定 071000；4河北省農(nóng)林科學(xué)院，石家莊 050051）

【】比較化學(xué)打頂和人工打頂方式下棉花植株生理變化及蛋白質(zhì)的差異表達，為化學(xué)打頂?shù)淖饔脵C理提供理論依據(jù)?！尽恳渣S河流域大面積推廣的冀棉863為試驗品種，于2015—2016年設(shè)置人工打頂、化學(xué)打頂和未打頂3種處理，于7月20日進行統(tǒng)一打頂處理，化學(xué)打頂劑為人工噴施，用量為1.125 L·hm-2。打頂處理后定期測定各處理間棉花株高與主莖功能葉內(nèi)源激素含量。株高測量為子葉節(jié)到主莖生長點的高度，使用直尺測量。使用酶聯(lián)免疫法測定棉花功能葉的生長素（IAA）、赤霉素（GA3）、脫落酸（ABA）和玉米素核苷（ZR）含量。采用iTRAQ技術(shù)對人工打頂和化學(xué)打頂處理的打頂后20 d的主莖功能葉進行差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析?！尽颗c人工打頂?shù)拿藁ㄏ啾龋瘜W(xué)打頂處理株高顯著高于人工打頂處理，兩年試驗中分別高11.8%和14.5%，但顯著低于未打頂處理，兩年試驗中分別低6.0%和6.5%，噴施化學(xué)打頂劑有效抑制了棉花株高的增長。不同打頂處理對棉花功能葉GA3含量影響較大，打頂后GA3含量變化為單峰曲線，處理30 d各處理之間達到顯著差異，GA3含量為未打頂＞化學(xué)打頂＞人工打頂，30 d后化學(xué)打頂與未打頂處理呈下降趨勢，人工打頂處理則在20 d時出現(xiàn)下降趨勢，在處理后50 d時各處理GA3含量無顯著差異。2016年IAA含量峰值出現(xiàn)在處理后40 d，化學(xué)打頂處理峰值顯著低于其他兩個處理，2015年3種打頂處理間無顯著差異。ABA含量在處理后40 d時達到最大值，未打頂處理峰值顯著低于其他兩個處理。3種打頂處理的ZR含量無顯著差異?；瘜W(xué)打頂與人工打頂處理相比，iTRAQ標(biāo)記方法檢測到69個差異表達蛋白，29個上調(diào)表達，40個下調(diào)表達，其中碳水化合物和能量代謝相關(guān)的蛋白多下調(diào)表達，降低了植株的長勢；與GA調(diào)節(jié)正相關(guān)蛋白多上調(diào)表達，增強GA效應(yīng)?！尽炕瘜W(xué)打頂能有效控制棉花株高，對棉花功能葉的GA含量影響較大，化學(xué)打頂處理含量顯著高于人工打頂處理，與人工打頂處理相比，化學(xué)打頂與植物生長發(fā)育相關(guān)蛋白多下調(diào)表達，可能是植株通過降低碳水化合物合成，減少能量代謝，增加GA含量，激活GA效應(yīng)來實現(xiàn)株高的控制。

棉花；化學(xué)打頂；激素；iTRAQ技術(shù)；差異蛋白質(zhì)

0 引言

【研究意義】棉花是中國重要的經(jīng)濟作物，隨著勞動力緊缺以及成本增加，植棉的機械化、規(guī)?；蔀楝F(xiàn)代植棉業(yè)的必然趨勢[1]。目前，人工打頂制約了棉花生產(chǎn)輕簡化、規(guī)?；⒕珳?zhǔn)化和機械化作業(yè)的發(fā)展[2]。發(fā)展和運用可代替人工打頂?shù)幕瘜W(xué)打頂技術(shù)，具有廣闊前景。探索化學(xué)打頂劑對棉花形態(tài)性狀、激素調(diào)控及蛋白質(zhì)差異表達的效應(yīng)，將明確其調(diào)控的分子機制，為開發(fā)新型生長調(diào)節(jié)劑及棉花化學(xué)打頂技術(shù)的應(yīng)用提供參考，具有重要的理論和實踐意義?！厩叭搜芯窟M展】打頂是棉花栽培過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，化學(xué)打頂更是棉花輕簡化栽培的必然趨勢。前人就化學(xué)打頂與人工打頂對棉花的影響差異進行了許多研究，發(fā)現(xiàn)化學(xué)打頂可以起到類似人工打頂?shù)男Ч?，但不同打頂方式塑造的棉花株型不同[3]，同時對棉花內(nèi)源激素含量[4]、物質(zhì)分配[5-6]、代謝活動等產(chǎn)生的影響不同。袁青鋒等[7]研究表明，化學(xué)打頂與人工打頂處理相比，棉花的株高、果枝數(shù)和結(jié)鈴數(shù)等較高，兩種處理的單鈴重、衣分、籽棉和皮棉產(chǎn)量水平相當(dāng)；楊成勛等[8]發(fā)現(xiàn)棉花化學(xué)打頂后，株寬顯著低于人工打頂，改善了冠層中下部透光率，增加了光合面積和光合時間，利于產(chǎn)量的形成；康正華等[9]對棉花進行了不同化學(xué)打頂劑處理，表明部分化學(xué)打頂劑處理具有增產(chǎn)效果；李莉等[10]研究表明，打頂后加速植物生長的激素含量降低，促進植物成熟與衰老的激素含量升高，加速了棉花的衰老。氟節(jié)胺打頂處理后棉花倒四葉內(nèi)源激素發(fā)生了不同程度的變化，與人工打頂處理相比變化趨勢及作用時間存在差異，最終達到打頂?shù)男Ч鸞11]。由上可知，激素在棉花生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用，研究植物激素的信號傳導(dǎo)和作用機理也是蛋白質(zhì)組學(xué)的重要內(nèi)容之一。楊惠娟等[12]針對煙草打頂?shù)难芯堪l(fā)現(xiàn)，打頂前后有9個蛋白質(zhì)差異表達，其中，促進煙草葉片光合作用和抗性相關(guān)蛋白的表達增強，與光呼吸能量代謝相關(guān)的蛋白表達下調(diào)。iTRAQ技術(shù)[13]是一種植物蛋白質(zhì)應(yīng)答分子機制有效研究技術(shù)?；趇TRAQ技術(shù)研究化學(xué)打頂條件下的蛋白質(zhì)組學(xué)，有利于了解打頂后棉花的生理與分子反應(yīng)機制?！颈狙芯壳腥朦c】前人對化學(xué)打頂技術(shù)研究多集中于農(nóng)藝性狀、經(jīng)濟性狀以及產(chǎn)量品質(zhì)等方面，對棉花蛋白質(zhì)組差異表達的影響鮮有報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過設(shè)置人工與化學(xué)打頂兩個處理，對棉花形態(tài)性狀、激素調(diào)控機制及蛋白質(zhì)差異表達情況開展研究，探究其生理調(diào)控的分子機制，為棉花輕簡化栽培提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與田間設(shè)計

試驗于2015—2016年在河北農(nóng)業(yè)大學(xué)清苑實驗農(nóng)場進行，土質(zhì)為壤土。2015年試驗地的土壤基礎(chǔ)地力情況：有機質(zhì)含量19.79 g·kg-1、堿解氮含量70.84 mg·kg-1、速效磷含量35.42 mg·kg-1、速效鉀含量149.45 mg·kg-1；2016年試驗地的土壤基礎(chǔ)肥力情況：有機質(zhì)含量18.41 g·kg-1、堿解氮含量52.14 mg·kg-1、速效磷含量28.66 mg·kg-1和速效鉀含量170.67 mg·kg-1。

供試品種為冀棉863，設(shè)人工打頂、化學(xué)打頂和未打頂3個處理。采用隨機區(qū)組試驗設(shè)計，3次重復(fù)，每個小區(qū)長12 m，寬11.5 m。寬窄行種植，大行行距100 cm，小行50 cm，密度45 000株/hm2。

所有處理于7月20日進行打頂處理?；瘜W(xué)打頂劑為水乳劑，主要成分包括縮節(jié)胺（N,N- Dimethylpiperidinium chloride，DPC）、緩釋劑、助劑等，由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院作物化學(xué)控制研究中心和北京市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站共同研發(fā)，新疆金棉科技有限責(zé)任公司生產(chǎn)?；瘜W(xué)打頂劑用量為1.125 L·hm-2，人工噴施。其他田間管理措施采用常規(guī)高產(chǎn)栽培模式。

1.2 田間取樣及調(diào)查

株高調(diào)查：在7月20日打頂后，每10 d選擇10株代表性植株進行調(diào)查，至株高不再變化。

激素樣品取樣：于打頂日開始，每10 d取一次樣品，共取6次，選取部位為主莖最高效葉片倒四葉，測定生長素（IAA）、赤霉素（GA3）、脫落酸（ABA）和玉米素核苷（ZR）含量。

蛋白質(zhì)組學(xué)樣品：在打頂后20 d（8月10日）選取人工打頂和化學(xué)打頂處理主莖倒四葉，葉片裝入樣品袋后，用液氮速凍后轉(zhuǎn)至-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 蛋白質(zhì)組測定分析

1.3.1 激素含量測定 激素測定方法采用間接酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）。試劑盒由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)化控室提供，使用美國BIO-RAD 680酶標(biāo)儀測定OD值，并制作logit曲線計算樣品中激素的含量。

1.3.2 蛋白質(zhì)組學(xué)測定 蛋白提取與定量：樣品用液氮磨成干粉，加入200 μL TEAB溶解；超聲破碎15 min后，12 000 r/min離心20 min取上清；加入4倍體積的冷丙酮（含終濃度為10 mmol·L-1DTT）沉淀2 h；12 000 r/min離心20 min，收集沉淀；再加入800 μL的冷丙酮（含終濃度為10 mmol·L-1DTT）重懸沉淀；12 000 r/min離心20 min，收集沉淀，然后風(fēng)干沉淀；加入100 μL TEAB溶解蛋白得到蛋白樣品。選擇常規(guī)的Bradford定量方法定量總蛋白質(zhì)。

蛋白酶切與標(biāo)記：選取100 μg蛋白質(zhì)，體積整體調(diào)節(jié)到100 μL，然后加入500 μL 50 mmol·L-1NH4HCO3稀釋，加入2 μg Tryspin 酶液；37℃消化過夜8—16 h；取出上述酶解液，加入等體積的0.1% FA酸化；將上述酸化后的酶解液加入到活化平衡后的Strata-X C18柱子中除鹽，冷凍抽干后用20 μL 0.5 mol·L-1TEAB復(fù)溶。標(biāo)記采用8-plex標(biāo)記，人工打頂樣品分別用115、116和117標(biāo)記，化學(xué)打頂樣品分別用118、119和121標(biāo)記，6個樣本標(biāo)記完以后等量混合。

肽段分離與蛋白質(zhì)鑒定：使用Thermo DINOEX Ultimate 3000 BioRS色譜儀進行分離，將混合后的樣本分成12個組分。分離后的肽段進行LC-MS/MS分析，質(zhì)譜儀是Thermo公司的Orbitrap質(zhì)量檢測器，型號為Q exactive HF。

蛋白質(zhì)功能鑒定：對鑒定蛋白質(zhì)進行GO、COG和KEGG分析，全面反映蛋白質(zhì)功能。Gene ontology（GO）是一個國際標(biāo)準(zhǔn)化的基因功能分類體系，提供了一套動態(tài)更新的標(biāo)準(zhǔn)詞匯表來全面描述生物體中基因和基因產(chǎn)物的屬性。Cluster of orthologous groups of proteins（COG，蛋白相鄰類的聚簇）是對蛋白質(zhì)進行直系同源分類的數(shù)據(jù)庫。Kyoto encyclopedia of genes and genomes（KEGG）是系統(tǒng)分析基因功能、基因組信息數(shù)據(jù)庫，它有助于把基因及表達信息作為一個整體網(wǎng)絡(luò)進行研究。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

株高及激素含量數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010進行統(tǒng)計，通過SPSS 21.0進行方差分析檢驗其差異顯著性。

蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)分析采用對MS/MS質(zhì)譜數(shù)據(jù)經(jīng)過系列優(yōu)化處理后與數(shù)據(jù)庫進行相似性比較打分從而進行蛋白鑒定。使用與AB Sciex 5600 plus配套的搜索引擎ProteinpilotTM V4.5。對于proteinpilot的鑒定結(jié)果進一步過濾，對于鑒定到的蛋白，認(rèn)為unused score≥1.3（即可信度水平在95%以上），每個蛋白至少包含一個unique肽段的蛋白為可信蛋白；對于鑒定的肽段，以conf≥95過濾，即可信度在95%以上認(rèn)為可信肽段，對于蛋白質(zhì)定量，為得到更全面的關(guān)于某蛋白的定量信息，Proteinpilot軟件使用了conf≥15的所有肽段，不符合該條件的肽段不包含在本報告中。

2 結(jié)果

2.1 不同打頂處理對棉花株高的影響

由圖1可以看出，兩年試驗中3種打頂處理的株高從處理后20 d開始出現(xiàn)差異顯著，表現(xiàn)為未打頂處理最高，化學(xué)打頂處理次之，人工打頂最低。

2.2 不同打頂處理對棉花功能葉激素含量的影響

由圖2可以看出，2015年試驗中3種打頂處理棉花功能葉中GA3含量呈先升高后降低趨勢，在處理后20 d時未打頂處理含量顯著高于其他兩個處理，在處理后30 d時化學(xué)打頂處理顯著高于人工打頂處理，3種打頂處理之間差異顯著，處理后40 d時化學(xué)打頂與未打頂處理無顯著差異，顯著高于人工打頂處理。打頂處理后，棉花葉片IAA和ABA含量先升高，在處理后40 d時達到最大值，之后逐漸下降，在處理后30 d時未打頂處理IAA含量顯著低于其他兩個處理，未打頂處理ABA含量峰值顯著低于其他兩個處理，其余時期無顯著差異。ZR含量在處理后20 d內(nèi)逐漸升高，之后在250 ng·g-1值上下波動，3種打頂處理之間無顯著差異。

圖中處理間標(biāo)有相同字母表示差異不顯著（P＞0.05）。下同

圖2 2015年不同處理對棉花主莖功能葉激素含量的影響

由圖3可以看出，2016年試驗中3種打頂處理GA3含量變化差異較大，在處理后30 d時未打頂處理顯著高于其他兩個處理，在處理40 d之后未打頂＞化學(xué)打頂＞人工打頂，3種處理之間達到顯著差異。3種打頂處理的IAA和ABA含量變化均為單峰曲線，在處理后40 d時達到最大值，化學(xué)打頂處理IAA含量峰值顯著低于其他兩個處理，未打頂處理ABA含量峰值顯著低于其他兩處理。ZR含量呈先升高后降低的趨勢，在處理后40 d達到最大值，3種打頂之間無顯著差異。

綜上可知，不同打頂處理對棉花功能葉GA3含量影響較大，對IAA和ABA含量有一定影響，對ZR含量基本無影響。與人工打頂處理相比，化學(xué)打頂與未打頂處理后期葉片GA3含量下降相對較晚。

圖3 2016年不同處理對棉花主莖功能葉激素含量的影響

2.3 不同打頂處理對棉花蛋白質(zhì)組表達影響

2.3.1 蛋白質(zhì)定量分析 對人工打頂與化學(xué)打頂處理棉花主莖功能葉進行iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)分析，以人工打頂處理葉片為對照，比較兩者之間的差異表達蛋白，當(dāng)差異倍數(shù)達到1.2倍及以上（即up-regulate≥1.2和down-regulate≤0.83），且經(jīng)過顯著性統(tǒng)計檢驗其-value≤0.05時，視為顯著差異蛋白。結(jié)果顯示總鑒定蛋白為3 065個，兩個處理之間檢測到的總差異蛋白質(zhì)數(shù)量為69個，其中29個上調(diào)，40個下調(diào)表達。

本研究中，質(zhì)譜產(chǎn)生的二級譜圖數(shù)、解析的二級譜圖數(shù)分別為352 145和76 544，譜圖鑒定率達到了21%以上，鑒定到的肽段和蛋白數(shù)總體分別為14 676和3 147（表1）。

2.3.2 鑒定蛋白質(zhì)功能注釋 通過對鑒定蛋白質(zhì)進行GO、KEGG和COG注釋，以利用不同來源的數(shù)據(jù)庫全面反映蛋白質(zhì)的功能，揭示蛋白質(zhì)在各個生命活動中的生物學(xué)意義。從圖4可以看出，由于背景注釋庫的局限性，GO功能注釋到的蛋白質(zhì)最多，為2 996個蛋白質(zhì)，COG注釋到2 159個蛋白質(zhì)，KEGG注釋到1 858個蛋白質(zhì)。

2.3.3 鑒定蛋白質(zhì)的COG注釋分析 COG是對蛋白質(zhì)進行直系同源分類的數(shù)據(jù)庫，通過對鑒定到的蛋白質(zhì)同COG數(shù)據(jù)庫進行了比對，對這些蛋白質(zhì)進行了功能分類（圖5）。其中，1.9%蛋白質(zhì)功能未知，10.5%參與能量代謝，7%參與氨基酸運輸及代謝，9%涉及碳水化合物運輸及代謝，其他差異蛋白可分別歸入翻譯后修飾、翻譯、輔酶運輸與代謝、信號傳導(dǎo)等方面。

圖4 不同功能注釋結(jié)果統(tǒng)計圖

表1 蛋白質(zhì)鑒定信息統(tǒng)計表

*表示可信度至少為95%，**表示至少含有2個unique肽段的鑒定蛋白質(zhì)數(shù)目

* means significant difference at 0.05 level, ** means the number of identified proteins containing 2 unique peptides at least

A：核糖核酸加工與修飾RNA processing and modification；B：染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和動態(tài)變化Chromatin structure and dynamics；C：能量產(chǎn)物與轉(zhuǎn)換Energy production and conversion；D：細胞循環(huán)調(diào)控、細胞分裂、染色體分裂Cell cycle control, cell division, chromosome partitioning；E：氨基酸轉(zhuǎn)運與代謝Amino acid transport and metabolism；F：核苷酸轉(zhuǎn)運與代謝Nucleotide transport and metabolism；G：碳水化合物轉(zhuǎn)運與代謝Carbohydrate transport and metabolism；H：輔酶轉(zhuǎn)運與代謝Coenzyme transport and metabolism；I：脂質(zhì)轉(zhuǎn)運與代謝Lipid transport and metabolism；J：翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物合成Translation, ribosomal structure and biogenesis；K：翻譯Translation；L：復(fù)制、重組和修飾Replication, recombination and repair；M：細胞壁/薄膜/膜的生物合成Cell wall/membrane/envelope biogenesis；N：細胞活力Cell motility；O：翻譯后修飾、蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)、伴侶Posttranslational modification, protein turnover, chaperones；P：無機離子轉(zhuǎn)運與代謝Inorganic ion transport and metabolism；Q：次級代謝產(chǎn)物的合成、轉(zhuǎn)運與分解Secondary metabolites biosynthesis, transport and catabolism；R：一般功能預(yù)測General function prediction only；S：未知功能Function unknown；T：信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制Signal transduction mechanisms；U：細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運、分泌和液泡運輸Intracellular trafficking, secretion, and vesicular transport；V：防御機制Defense mechanisms；Z：細胞骨架Cytoskeleton

2.3.4 鑒定和差異蛋白質(zhì)GO分析 為了能夠更加清楚的分析差異蛋白質(zhì)的功能，對差異蛋白質(zhì)進行獨立的功能注釋分析（圖6）。GO總共有3個本體，分別描述基因的分子功能、細胞組分、參與的生物過程。在生理過程中，有19個功能存在明顯差異，細胞成分組織或合成、細胞過程、代謝過程、生物調(diào)節(jié)等功能涉及的差異蛋白比例較大。在細胞組分中，細胞、細胞組分、膜腔、細胞器等兩處理之間差異蛋白顯著。在分子功能中，兩處理在抗氧化物酶活性、結(jié)合、催化酶活性和結(jié)構(gòu)分子活性等方面都出現(xiàn)了顯著差異。

A：生物附著biological adhesion；B：生物調(diào)節(jié)biological regulation；C：碳固定carbon utilization；D：細胞增殖cell proliferation；E：細胞成分組成或生物合成cellular component organization or biogenesis；F：細胞過程cellular process；G：死亡death；H：發(fā)育過程developmental process；I：建立定位establishment of localization；J：生長growth；K：免疫系統(tǒng)過程immune system process；L：定位localization；M：轉(zhuǎn)移locomotion；N：代謝過程metabolic process；O：多機體過程multi-organismal process；P：多細胞生物過程multicellular organismal process；Q：生物過程的負調(diào)節(jié)negative regulation of biological process；R：色素沉著pigmentation；S：生物過程的正調(diào)節(jié)positive regulation of biological process；T：生物過程調(diào)節(jié)regulation of biological process；U：復(fù)制reproduction；V：繁殖過程reproductive process；W：刺激響應(yīng)response to stimulus；X：周期過程rhythmic process；Y：信號signaling；Z：病毒繁殖viral reproduction；AB：細胞cell；AC：細胞組分cell part；AD：胞外區(qū)extracellular region；AE：胞外區(qū)組分extracellular region part；AF：高分子配合物macromolecular complex；AG：膜封閉腔membrane-enclosed lumen；AH：細胞器organelle；AI：細胞器組分organelle part；AJ：抗氧化活性antioxidant activity；AK：結(jié)合binding；AL：催化活性catalytic activity；AM：電子載體活性electron carrier activity；AN：酶調(diào)節(jié)劑活性enzyme regulator activity；AO：分子傳導(dǎo)活性molecular transducer activity；AP：核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性nucleic acid binding transcription factor activity；AQ：蛋白結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性protein binding transcription factor activity；AR：結(jié)構(gòu)分子活性structural molecule activity；AS：轉(zhuǎn)移載體活性transporter activity

2.3.5 鑒定差異蛋白質(zhì)基本信息 表2列出了所有差異蛋白質(zhì)的相關(guān)信息。差異表達蛋白質(zhì)為69個，其中涉及碳水化合物和能量代謝的蛋白質(zhì)有14個，涉及蛋白質(zhì)和氨基酸代謝有16個，應(yīng)激與防御相關(guān)蛋白有14個，還涉及其他代謝過程。主要富集的Pathway途徑有精氨酸和脯氨酸代謝、光合作用碳固定過程、谷胱甘肽代謝和苯丙氨酸代謝等。能量代謝相關(guān)蛋白多下調(diào)表達，應(yīng)激相關(guān)蛋白多上調(diào)表達。

3 討論

3.1 不同打頂處理下棉花株高與激素含量的差異

由本研究結(jié)果可知，不同打頂處理后棉花株高出現(xiàn)顯著差異，處理后期化學(xué)打頂處理顯著高于人工打頂，但顯著低于未打頂處理，這可能是噴施化學(xué)打頂劑后棉花需要一定的時間吸收轉(zhuǎn)化，在這期間棉花繼續(xù)生長，這與袁青鋒等[7-8]研究結(jié)果一致。這說明化學(xué)打頂處理能在一定程度上控制棉花株高。不同打頂處理后棉花主莖功能葉激素含量也表現(xiàn)出一定差異，但兩年結(jié)果中3種打頂處理的ZR含量在各時期差異不顯著。兩年試驗中3種打頂處理前期各激素含量基本無差異，這與趙強[14]研究結(jié)果一致，但與葉春秀等[11]研究結(jié)果不相同；前人研究表明人工打頂導(dǎo)致棉花生長中后期GA合成量減少[10]，本試驗后期化學(xué)打頂?shù)腉A3含量顯著高于人工打頂，說明化學(xué)打頂可以緩解人工打頂后期GA含量快速下降，可能利于防止棉花早衰，有待于進一步研究證實。

表2 差異蛋白質(zhì)相關(guān)信息

3.2 不同打頂處理下棉花功能葉的蛋白質(zhì)組差異

在蛋白質(zhì)組水平上，應(yīng)用iTRAQ技術(shù)對兩種打頂方式下棉花主莖功能葉進行了蛋白質(zhì)組學(xué)分析，鑒定出了一定數(shù)量差異蛋白，涉及與植物生長發(fā)育密切相關(guān)的碳水化合物和能量代謝等諸多方面，一些與GA代謝相關(guān)的蛋白質(zhì)表達豐度也發(fā)生了變化。

3.2.1 與能量代謝及應(yīng)激代謝相關(guān)的蛋白質(zhì) 打頂處理后，棉花主莖功能葉中與參與碳水化合物和能量代謝相關(guān)的許多蛋白質(zhì)的表達豐度發(fā)生變化，涉及糖酵解、三羧酸循環(huán)、卡爾文循環(huán)等碳水化合物代謝途徑。在三羧酸循中，烏頭酸水合酶是三羧酸循環(huán)中的輔酶，催化檸檬酸和異檸檬酸相互轉(zhuǎn)化。檸檬酸合酶催化來自糖酵解或其他異化反應(yīng)的乙酰CoA與草酰乙酸縮合合成檸檬酸，是TCA循環(huán)的關(guān)鍵酶。本研究中順烏頭酸水合酶（aconitate hydratase）和ATP-檸檬酸合成酶鏈蛋白2（ATP-citrate synthase beta chain protein 2）表達上調(diào)，這表明化學(xué)打頂與人工打頂處理相比，促進了三羧酸循環(huán)，加快了碳水化合物代謝。V型質(zhì)子ATP酶催化亞基A蛋白（V-type proton ATPase catalytic subunit A-like protein）表達上調(diào)，促進了短鏈脂肪酸的代謝。

在C3植物葉片中，丙酮酸磷酸雙激酶（pyruvate orthophosphate dikinase，PPDK）是糖酵解途徑的關(guān)鍵酶，參與碳固定，并為氨基酸合成提供碳骨架[15]。3-磷酸甘油醛脫氫酶在細胞的碳代謝的中心環(huán)節(jié)，催化糖酵解中唯一的氧化反應(yīng)[16]。本試驗中丙酮酸磷酸雙激酶與3-磷酸甘油醛脫氫酶2（glyceraldehyde-3- phosphate dehydrogenase 2）均表達下調(diào)，這表明與人工打頂相比，化學(xué)打頂處理的葉片中糖酵解途徑減弱，這說明人工打頂后棉花需要更多的能量來響應(yīng)，棉花化學(xué)打頂有效緩解棉花因打頂造成的劇烈反應(yīng)，從而維持棉花的持續(xù)穩(wěn)定增長。

谷胱甘肽代謝途徑對維持細胞內(nèi)活性氧與自由基動態(tài)平衡、抵御脅迫具有重要作用[17]。此途徑中谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶F9樣蛋白（glutathione S-transferase F9-like protein）和谷胱甘肽合成酶（glutathione synthetase）表達上調(diào)，谷胱甘肽還原酶（glutathione reductase）表達下調(diào)，總體上加快了谷胱甘肽的合成以及對有害物質(zhì)的清除。精氨酸和脯氨酸代謝途徑中delta-1-吡咯啉-5-羧酸脫氫酶12A1（delta-1-pyrroline- 5-carboxylate dehydrogenase 12A1）和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase）表達上調(diào)，加快了三羧酸循環(huán)，乙酰谷氨酸激酶（acetylglutamate kinase）表達下調(diào)，對尿素循環(huán)造成了一定影響，精氨酸合成多胺調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育，從而提高棉花植株的抗逆能力[18]。

前人研究表明菠菜受到硫化氫脅迫后，光合作用和能量代謝提高來響應(yīng)脅迫[19]，本試驗中化學(xué)打頂處理后棉花葉片中碳水化合物和能量代謝相關(guān)蛋白多數(shù)下調(diào)表達，抗逆相關(guān)蛋白質(zhì)表達上調(diào)，這說明化學(xué)打頂對棉花的機械損傷更小，人工打頂后棉花提高能量代謝來抵御打頂造成的損傷，但化學(xué)打頂后可能產(chǎn)生抑制植株生長的物質(zhì)，棉株通過自身抗逆反應(yīng)來適應(yīng)自身變化。

3.2.2 與GA代謝相關(guān)的蛋白質(zhì) DELLA蛋白在GA和IAA、ABA等其他植物激素信號傳導(dǎo)途徑中具有交互調(diào)節(jié)作用，是GA調(diào)控作用的關(guān)鍵，其在其他環(huán)境信號間的調(diào)控機制也被逐一發(fā)現(xiàn)[20]，如光的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[21]。DELLA蛋白是一類被廣泛定性的GA信號抑制因子[22]。GID1蛋白與GA及DELLA蛋白結(jié)合后形成赤霉素受體GA-GID1-DELLA蛋白復(fù)合體，然后SCF聚合體標(biāo)記該三聚體，誘導(dǎo)泛素26S蛋白酶體降解DELLA蛋白，解除DELLA蛋白對植物生長的抑制作用，產(chǎn)生GA效應(yīng)[23-26]。該試驗中26S蛋白酶體的非ATP酶調(diào)節(jié)亞基6同源物（26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 6 homolog）表達上調(diào)，加快降解DELLA蛋白，促進植株生長。因此，與人工打頂處理相比，化學(xué)打頂處理更能促進棉花的縱向生長。

ABA抑制GA誘導(dǎo)的一些過程，如PKABA蛋白激酶是ABA正調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白，它過表達可抑制GA調(diào)節(jié)的GAMYB和-淀粉酶基因的表達[27-28]。GA也調(diào)節(jié)ABA的代謝和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[29]，HvSPY是GA負調(diào)控因子，卻在ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起正調(diào)節(jié)作用，但不依賴ABA途徑[30]。本研究中-雙加氧酶1（Alpha-dioxygenase 1）參與ABA負調(diào)控介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其表達上調(diào)，可能抑制ABA表達，延緩植物衰老。鎂螯合酶亞基Chl I-1（Magnesium-chelatase subunit ChlI-1）是葉綠素生物合成的關(guān)鍵酶，正調(diào)節(jié)ABA信號，但不與ABA結(jié)合[31]，該蛋白表達上調(diào)，促進ABA產(chǎn)生效應(yīng)。并且GA的變化會直接影響IAA的生物合成與降解，IAA又直接作用于細胞，導(dǎo)致細胞或者細胞壁的伸長變異，這又會導(dǎo)致植株節(jié)間長度或者節(jié)數(shù)變化，最終導(dǎo)致植株形態(tài)變化。此外，與光合作用相關(guān)的蛋白質(zhì)光合NDH亞基的亞基B 2（photosynthetic NDH subunit of subcomplex B 2）和葉綠素a、b結(jié)合蛋白CP26（chlorophyll a-b binding protein CP26）參與控制碳水化合物代謝，影響蔗糖利用效率和細胞壁的合成，其表達下調(diào)導(dǎo)致化學(xué)打頂處理植株光合能力減弱，本研究中后期人工打頂處理棉花主莖葉GA含量顯著低于化學(xué)打頂處理，光合能力也受到抑制，這與前人研究結(jié)果一致[32-33]。這說明打頂存在對GA調(diào)控的抑制，但化學(xué)打頂對GA的抑制比人工打頂要弱，GA減少會加速葉片的衰老，化學(xué)打頂能在一定程度上防止棉花早衰。

前人研究表明GA與類胡蘿卜素合成途徑有共同的前體，并且有些類胡蘿卜素能直接合成ABA[34]。糖酵解產(chǎn)物乙酰輔酶A和丙酮酸促進前體物質(zhì)IPP的生成，加快了植物MEP途徑，為棉花葉片GA含量升高提供了條件。GA代謝及信號傳導(dǎo)正相關(guān)蛋白多上調(diào)，與人工打頂相比，化學(xué)打頂促進了GA的合成與表達，植物通過減少赤霉素來減緩植株生長從而適應(yīng)環(huán)境，這同樣說明化學(xué)打頂與人工打頂相比，對植株造成的傷害更小，更有利于植株的生長發(fā)育，但關(guān)于不同打頂方式影響棉花生長的具體分子機制還有待于進一步研究。

4 結(jié)論

與人工打頂相比，化學(xué)打頂處理有效控制了棉花株高，提高了生育后期GA含量，IAA、ABA和ZR含量無顯著差異。基于iTRAQ技術(shù)的蛋白質(zhì)組學(xué)分析，鑒定得到69個差異表達蛋白質(zhì)，與植物生長發(fā)育相關(guān)的碳水化合物和能量代謝相關(guān)蛋白多下調(diào)表達，與GA調(diào)控正調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白多上調(diào)表達，人工打頂激活了植物的能量代謝與應(yīng)激反應(yīng)來調(diào)控棉花的生長，而化學(xué)打頂更多的是通過調(diào)控GA激素的代謝過程來適應(yīng)外部環(huán)境的變化。

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（責(zé)任編輯 李莉，岳梅）

Differential Proteomics Analysis of Cotton Leaf Response to Chemical Topping Based on iTRAQ Technique

HOU XiaoMeng1,2, LIU LianTao1,2, LI Meng4, SUN HongChun1,2, ZHANG YongJiang1,2, DU Huan2,3, LI CunDong2

(1College of Agronomy, Hebei Agricultural University, Baoding 071000, Hebei;2Key Laboratory of Hebei Crop Growth Regulation, Baoding 071000, Hebei;3College of Life Sciences, Hebei Agricultural University, Baoding 071000, Hebei;4Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences, Shijiazhuang 050051)

【】The objective of this study is to compare the effects of manual topping and chemical topping on physiological changes and proteins differentially expression of cotton. The results of this study would provide a theoretical basis for the mechanism of chemical topping. 【】Manual topping, chemical topping and no top pruning were practiced on cultivar GM863 which was planted in large area of the Yellow River basin in 2015-2016. Cotton was treated on July 20th simultaneously. Artificial spraying chemical topping agent and the dosage was 1.125 L·hm-2. The plant height and hormone contents of functional leaves were determined regularly after topping. The plant height was measured with the height from the cotyledon node to the growth point of the main stem by using ruler. The hormone contents of functional leaves, including IAA, GA3, ABA and ZR were measured by enzyme-linked immunosorbent assay. The differential proteomics analysis was carried out on the functional leaves of manual topping and chemical topping by using iTRAQ technique. 【】Compared with the cotton of manual topping treatment, chemical topping treatment was significantly higher than manual topping treatment, which was 11.8% and 14.5% higher than others in the two-year trial, but was significantly lower than no top pruning, which was 6.0% and 6.5% lower than others, vertical growth was significantly inhibited after spraying. Different topping treatments greatly affected the GA3content of cotton functional leaves, the change of GA3content was a single peak curve, the contents of GA3were no top pruning＞chemical topping＞manual topping, and reached significant difference. The GA3contents of chemical topping and no top pruning were decreased at 30 d after topping and manual topping was decreased at 20 d. There was no significant difference among three treatments at 50 d after topping. The maximum IAA content in chemical topping treatment was significantly lower than that in the other two treatments at 40 d after topping in 2016, and there was no significant difference among the three treatments in 2015. The maximum ABA content in no top pruning treatment was significantly lower than that in the other two treatments at 40 d after topping. There was no significant difference among the three treatments of the contents of ZR. Compared with manual topping treatment, 69 differentially expressed proteins were detected by using iTRAQ in leaves of chemical topping treatment, 29 up-regulated and 40 down-regulated expressions, in which carbohydrate and energy metabolism related proteins were most down-regulated, and it was indicated that the growth of plants was decreased. The up-regulation of most GA regulated positive correlation proteins enhanced the GA effect. 【】Chemical topping can effectively control the plant height of cotton, and which has a great effect on the GA content of functional leaves. The contents of GA in chemical topping treated leaves were significantly higher than that of manual topping treatment. Compared with manual topping treatment, the proteins related to plant growth and development in chemical topping treatment were most down-regulated expression, may be the plants reduced carbohydrate synthesis and energy metabolism, and activated GA effect by increasing GA content to control plant height.

cotton; chemical topping; hormone; iTRAQ technique; differential proteins

10.3864/j.issn.0578-1752.2017.19.004

2017-03-20；接受日期：2017-05-16

國家自然科學(xué)基金（31171495，31571610）

侯曉夢，E-mail：houxiaomeng66@sina.com。通信作者李夢，E-mail：bdlimeng@163.com。通信作者李存東，E-mail：nxylcd@mail.hebau.edu.cn