王 靜,張程程,吉芳英*,晏 鵬

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磺胺類抗生素與胞外聚合物作用的熱化學(xué)機(jī)制

王 靜1,張程程2,吉芳英2*,晏 鵬3

(1.重慶建筑工程職業(yè)學(xué)院交通與市政工程系,重慶 400072；2.重慶大學(xué)三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶 400045；3.中國科學(xué)院重慶綠色智能技術(shù)研究院,重慶 400714)

本研究利用等溫滴定微量熱技術(shù)獲得了胞外聚合物和磺胺類抗生素的相互作用的熱力學(xué)參數(shù),探索了其作用機(jī)制.結(jié)果表明,胞外蛋白和磺胺二甲基嘧啶(SMZ)強(qiáng)烈結(jié)合,結(jié)合過程由疏水相互作用驅(qū)動(dòng)的熵作為主要驅(qū)動(dòng)力.結(jié)合強(qiáng)度顯著地受pH和離子強(qiáng)度的影響.在pH為6.8的近中性條件下,EPS和SMZ的結(jié)合反應(yīng)最有利,且構(gòu)象變化最大.離子強(qiáng)度對(duì)EPS和SMZ之間的相互作用有明顯的影響.該研究的結(jié)果表明,活性污泥中存在的EPS對(duì)抗生素的遷移轉(zhuǎn)化有顯著影響.

胞外聚合物；等溫滴定微量熱；磺胺二甲基嘧啶；pH值；離子強(qiáng)度

磺胺類抗生素是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中常用的一類人工合成的抗菌消炎藥,因生產(chǎn)成本低、抗菌廣譜等優(yōu)勢(shì)現(xiàn)已成為世界上應(yīng)用最為廣泛的抗生素之一[1-3].由于它們對(duì)微生物具有抑制效應(yīng),常規(guī)的活性污泥法對(duì)其去除效果非常有限,導(dǎo)致它們?cè)谖鬯畯S出水中有殘留,已在世界各地包括我國的污水處理廠出水中檢出[4].

胞外聚合物(EPS),是由微生物在一定條件下分泌的高分子物質(zhì),覆蓋在微生物細(xì)胞表面及填充在污泥絮體內(nèi)部空隙中[5].EPS具有大量的活性官能團(tuán)和疏水區(qū)域,有很強(qiáng)的吸附和絡(luò)合污染物的能力[6-8].

磺胺類抗生素在污水處理廠的有效去除主要依賴于污泥絮體的吸附和生物降解[9-10],其中作為活性污泥主要成分的EPS對(duì)磺胺類抗生素的吸附具有重要的研究意義和價(jià)值,這引起了國內(nèi)外污水處理領(lǐng)域相關(guān)學(xué)者的廣泛關(guān)注[11].目前,通常采用化學(xué)分析法結(jié)合吸附模型的方式研究EPS與磺胺類抗生素的相互作用[12].但是,該方法具有耗時(shí)、精度低、靈敏度低等缺點(diǎn),極大的阻礙了對(duì)其相互作用機(jī)制的認(rèn)識(shí).等溫滴定微量熱法是近年來發(fā)展起來的一種直接測(cè)量生物分子結(jié)合過程中的放熱或者吸熱的技術(shù),在單次實(shí)驗(yàn)中即可提供一系列有關(guān)分子相互作用的完整信息[13].等溫滴定微量熱法與常規(guī)分析方法相比具有靈敏度高、精度高、快速、免標(biāo)記、無損、原位等特點(diǎn).本研究運(yùn)用等溫滴定微量熱法探討EPS模擬物與磺胺類抗生素的結(jié)合程度,以及離子強(qiáng)度和pH值對(duì)結(jié)合程度的影響.從熱力學(xué)的角度深入探討EPS與磺胺類抗生素間的相互作用機(jī)制,明晰EPS在磺胺類抗生素去除過程中所起的作用,揭示磺胺類抗生素去除過程中的干擾因素和影響規(guī)律,為磺胺類抗生素在活性污泥系統(tǒng)中的高效去除提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

牛血清白蛋白、葡聚糖、腐殖酸鈉、磺胺二甲基嘧啶(SMZ),試劑均為分析純.枯草芽孢桿菌菌種(ATCC6633,廣州省微生物菌種保藏中心).酵母浸粉、蛋白胨均購于北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司.

ITC200型等溫滴定微量熱儀,DW-86L386型超低溫冰箱,Virtis BT4KXL型冷凍干燥機(jī).

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)菌培養(yǎng)與EPS 提取冷凍干燥的枯草芽孢桿菌菌種,于滅活培養(yǎng)基(5g/L酵母浸粉,10g/L蛋白胨,5g/L NaCl)中在30℃下培養(yǎng)24h,隨后取1~2mL轉(zhuǎn)移至250mL滅活培養(yǎng)基中,培養(yǎng)40h(30℃),然后提取EPS.將細(xì)胞懸浮液分裝于50mL離心管中離心(5000,4℃,20min),去除上清液,小心清洗剩余球團(tuán)1~2次,后加入去離子水將球團(tuán)沖洗下來至燒杯或錐形瓶超聲(功率40%,時(shí)間3min×2次),將懸浮液轉(zhuǎn)移至離心管,在4℃(7800~ 8000)離心50min,上清液即為EPS.經(jīng)0.45μm濾膜過濾,而后冷凍干燥,于–40℃保存?zhèn)溆?

1.2.2 EPS模擬物與SMZ結(jié)合實(shí)驗(yàn) EPS的主要組成物質(zhì)為蛋白質(zhì)和多糖,腐殖質(zhì),通常以牛血清白蛋白(BSA)、葡聚糖(Glucan)和腐殖酸鈉(HA-Na)為EPS組分中的蛋白、多糖和腐殖質(zhì)類物質(zhì)的模擬物[14-16].所有溶液均用PBS緩沖液(1mmol/L, pH 6.8)配制.等溫滴定的主體牛血清白蛋白(BSA)、葡聚糖和HA-Na濃度均為5g/L,配體SMZ濃度為0.5g/L.所有的溶液在滴定前進(jìn)樣過程中真空脫氣,以防出現(xiàn)氣泡干擾熱量檢測(cè).

1.2.3 環(huán)境因素實(shí)驗(yàn) 采用磷酸鹽緩沖體系調(diào)節(jié)pH值為5.7、6.8和8.0的緩沖液(1mmol/L).用NaCl調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度分別為5mmol/L、50mmol/L和500mmol/L的 IS 1、IS 2 和IS 3溶劑.不同pH值和離子條件下主體EPS的濃度為5g/L,配體SMZ的濃度為0.5g/L,用ITC-200測(cè)定反應(yīng)中吸收和放出的熱量.

1.2.4 等溫滴定微量熱法 反應(yīng)體積: 0.2mmol/L,進(jìn)樣針容積為40μL,反應(yīng)溫度:20℃;總注射次數(shù): 19次;參照功率:5μCal/s;攪拌器轉(zhuǎn)速:1000r/min.磺胺二甲基嘧啶溶液和PBS緩沖液分別滴定EPS模擬物,其中緩沖液滴定EPS模擬物為實(shí)驗(yàn)對(duì)照,用于扣除反應(yīng)過程中的稀釋熱量.數(shù)據(jù)用Origin 7.0進(jìn)行擬合分析得到結(jié)合化學(xué)計(jì)量數(shù)(),結(jié)合常數(shù)()和焓變(Δ).

2 結(jié)果與討論

2.1 EPS組分對(duì)結(jié)合反應(yīng)的影響

對(duì)EPS模擬物與SMZ的結(jié)合反應(yīng)進(jìn)行ITC檢測(cè),熱譜圖見圖１,獲得的結(jié)合參數(shù)見表１.由圖1可知,SMZ與BSA和HA-Na結(jié)合的每一次滴定有明顯的負(fù)峰出現(xiàn),表明相互作用均是放熱過程;而與葡聚糖的滴定反應(yīng)熱譜圖中,每一次滴定基本出現(xiàn)正峰,第二滴的峰面積為0.57313μcals,低于1μcals,且每滴的熱量變化微弱,表明SMZ與EPS中多糖模擬物葡聚糖的結(jié)合十分微弱.

SMZ與BSA和HA-Na非線性擬合出的熱力參數(shù)、推導(dǎo)得到的吉布斯自由能變?chǔ)ぜ办刈儲(chǔ)と绫?所示.SMZ與BSA和HA-Na結(jié)合的吉布斯自由能變?chǔ)ず挺そ詾樨?fù)值,表明均為典型的可自發(fā)進(jìn)行的放熱反應(yīng).SMZ與BSA的結(jié)合化學(xué)計(jì)量數(shù)為0.865sites,是SMZ與HA-Na的結(jié)合化學(xué)計(jì)量數(shù)(0.176sites)的近5倍; SMZ與BSA結(jié)合的結(jié)合常數(shù)比與HA-Na結(jié)合的結(jié)合常數(shù)略小1個(gè)數(shù)量級(jí),表明EPS中的蛋白模擬物BSA較腐殖質(zhì)模擬物HA-Na與SMZ的結(jié)合容量更大,但后者的復(fù)合物更穩(wěn)定.SMZ與BSA結(jié)合過程中的熵變?chǔ)? 0,｜Δ｜>｜ＴΔ｜,表明結(jié)合后體系構(gòu)象變化受到限制[17],BSA與SMZ的結(jié)合是以氫鍵和范德華力為主要作用力的焓驅(qū)動(dòng)過程.而SMZ與HA-Na結(jié)合過程中的熵變?chǔ)? 0,｜Δ｜<｜ＴΔ｜,說明體系的無序度增加[18],反應(yīng)主要是以疏水性相互作用為主要驅(qū)動(dòng)力的熵驅(qū)動(dòng)過程[19].

圖1 SMZ與EPS模擬物結(jié)合的熱譜圖和非線性擬合

a- SMZ to BSA,b- SMZ to HA-Na,c- SMZ to Glucan

表1 SMZ與EPS模擬物的反應(yīng)熱力學(xué)參數(shù)

2.2 pH、離子強(qiáng)度對(duì)結(jié)合反應(yīng)的影響

不同pH條件下EPS分別與SMZ的滴定反應(yīng)的熱譜圖及非線性擬合圖分別如圖2所示.熱譜圖均有典型的負(fù)峰,表明EPS與SMZ的結(jié)合在不同pH條件下均為放熱反應(yīng).EPS與SMZ在接近中性條件時(shí)結(jié)合放出的熱量相對(duì)酸性和堿性條件下較小,擬合曲線斜率較低.由表2中EPS與SMZ結(jié)合的熱力學(xué)參數(shù)可知,不同pH條件下,吉布斯自由能變?chǔ)ぞ∮诹?且–ΔpH6.8>– ΔpH8.0>–ΔpH5.7,表明EPS與SMZ的結(jié)合反應(yīng)在熱力學(xué)上是有利的自發(fā)反應(yīng),在pH 6.8時(shí)反應(yīng)在熱力學(xué)上最為有利;結(jié)合常數(shù)的大小順序?yàn)?pH6.8>pH8.0>pH5.7,且pH6.8高出一個(gè)數(shù)量級(jí),表明EPS-SMZ結(jié)合物在近中性條件下穩(wěn)定性最好;EPS與SMZ結(jié)合過程中反映構(gòu)象變化的熵變?chǔ)ぞ笥诹?大小順序?yàn)棣H6.8>ΔpH8.0>ΔpH5.7,表明體系的無序度均增加[18],且在近中性條件時(shí)體系構(gòu)象變化最大;由|Δ|<|TΔ|,表明EPS與SMZ的結(jié)合反應(yīng)是以疏水性相互作用為主要驅(qū)動(dòng)力的熵驅(qū)動(dòng)過程[19],不同pH條件下EPS與SMZ結(jié)合的化學(xué)計(jì)量數(shù)變化不大且均接近1sites,皆略大于與EPS的蛋白類模擬物BSA與SMZ的結(jié)合化學(xué)計(jì)量數(shù)(0.865sites),表明EPS中的蛋白類物質(zhì)在結(jié)合SMZ的過程中發(fā)揮著重要作用.由此可知,EPS與SMZ的結(jié)合化學(xué)計(jì)量比受到溶液pH的影響程度不大,但在近中性條件pH 6.8時(shí),EPS與SMZ的結(jié)合反應(yīng)熱力學(xué)上最為有利,構(gòu)象變化最大,EPS-SMZ結(jié)合物穩(wěn)定性最高.

圖2 不同pH下對(duì)SMZ與EPS結(jié)合的熱譜圖及其非線性擬合

a- pH 5.7,b- pH 6.8,c- pH 8.0

表2 不同pH下SMZ與EPS反應(yīng)的熱力學(xué)參數(shù)

不同離子強(qiáng)度(IS)下EPS與SMZ滴定反應(yīng)的熱譜圖及非線性擬合圖分別如圖3所示.從圖3可以看出,離子強(qiáng)度IS 1(5mmol/L)和IS 3(500mmol/L)條件下,EPS和SMZ反應(yīng)的熱譜圖均出現(xiàn)典型的負(fù)峰,表明在低離子強(qiáng)度和高離子強(qiáng)度下的結(jié)合均為放熱反應(yīng);而在IS 2(50mmol/L)條件下,EPS與SMZ反應(yīng)的熱譜圖均為正峰,表明該條件下的結(jié)合反應(yīng)為吸熱反應(yīng).

據(jù)表3,各離子強(qiáng)度下EPS與SMZ結(jié)合的吉布斯自由能變?chǔ)ぞ鶠樨?fù),表明反應(yīng)均是熱力學(xué)上有利的自發(fā)過程.在離子強(qiáng)度為5mmol/L時(shí),Δ為–4.10′104cal/(mol×K),表明EPS與SMZ在該條件下的結(jié)合中體系有序度大幅增加,結(jié)合化學(xué)計(jì)量數(shù)極小.在離子強(qiáng)度為50mmol/L時(shí),Δ(1555 ± 394.0) cal/mol為正,表明在該條件下的反應(yīng)是一個(gè)吸熱過程.由式知,負(fù)焓變和正熵變有利于熱力學(xué)的自發(fā)反應(yīng),在溶液離子強(qiáng)度50mmol/L時(shí),Δ> 0,Δ> 0,表明該反應(yīng)是一個(gè)由熵驅(qū)動(dòng)的過程;離子強(qiáng)度500mmol/L時(shí),Δ< 0,Δ> 0,表明在高離子強(qiáng)度下,EPS與SMZ的結(jié)合反應(yīng)是一個(gè)由焓熵共同驅(qū)動(dòng)的過程,但｜Δ｜<｜ＴΔ｜,表明結(jié)合反應(yīng)主要是以疏水性相互作用為主要驅(qū)動(dòng)力的熵驅(qū)動(dòng)過程[17].對(duì)比離子強(qiáng)度分別為5mmol/L、50mmol/L及500mmol/L條件下EPS與SMZ結(jié)合的熱力學(xué)參數(shù)大小,發(fā)現(xiàn)離子強(qiáng)度5mmol/L時(shí),EPS與SMZ結(jié)合微弱;IS在50mmol/L和500mmol/L之間,溶液離子強(qiáng)度越高,EPS與SMZ的結(jié)合常數(shù)和負(fù)吉布斯自由能變–Δ越大,表明高離子強(qiáng)度下EPS與SMZ的結(jié)合更易自發(fā)進(jìn)行,且EPS-SMZ結(jié)合物更穩(wěn)定;但焓變絕對(duì)值｜Δ｜、熵變?chǔ)ず徒Y(jié)合化學(xué)計(jì)量數(shù)越小,表明高離子強(qiáng)度不利于EPS與SMZ的大量結(jié)合.綜上表明,EPS與SMZ的相互作用受離子強(qiáng)度影響顯著,過低和過高離子強(qiáng)度均不利于二者的結(jié)合.

圖3 不同離子強(qiáng)度下對(duì)SMZ與EPS結(jié)合的熱譜圖及其非線性擬合

a-5mmol/L,b-50mmol/L,c-500mmol/L

表3 不同離子強(qiáng)度下SMZ與EPS反應(yīng)熱力學(xué)參數(shù)

3 結(jié)論

3.1 SMZ與BSA的結(jié)合化學(xué)計(jì)量數(shù)為0.865sites,結(jié)合是以氫鍵和范德華力為主要作用力的焓驅(qū)動(dòng)過程;SMZ與HA-Na的結(jié)合化學(xué)計(jì)量數(shù)為0.176sites,結(jié)合是以疏水性相互作用為主要驅(qū)動(dòng)力的熵驅(qū)動(dòng)過程.SMZ與葡聚糖無明顯結(jié)合.因此在活性污泥系統(tǒng)中,SMZ的去除過程EPS的蛋白類物質(zhì)發(fā)揮著重要作用,EPS與SMZ的結(jié)合是以疏水性相互作用為主要驅(qū)動(dòng)力的熵驅(qū)動(dòng)過程.

3.2 pH對(duì)EPS與SMZ結(jié)合化學(xué)計(jì)量數(shù)的影響較小,但在中性條件時(shí),EPS與SMZ的結(jié)合反應(yīng)在熱力學(xué)上最為有利,體系構(gòu)象變化最大,且EPS-SMZ結(jié)合物穩(wěn)定性最高.

3.3 離子強(qiáng)度對(duì)EPS與SMZ的相互作用具有顯著影響EPS與SMZ在離子強(qiáng)度5mmol/L時(shí),結(jié)合微弱;在50mmol/L和500mmol/L之間,離子強(qiáng)度越高,EPS與SMZ的結(jié)合更易自發(fā)進(jìn)行,且復(fù)合物更穩(wěn)定,但結(jié)合化學(xué)計(jì)量數(shù)較小.

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Thermochemical mechanism of the interaction between sulfamethazineantibiotics and extracellular polymers.

WANG Jing1, ZHANG Cheng-cheng2, JI Fang-ying2*, YAN Peng3

(1.Department of Traffic and Municipal Engineering, Chongqing Jianzhu College, Chongqing 400072, China；2.Key Laboratory of the Three Gorges Reservoir Region’s Eco-Environments, Ministry of Education, Chongqing University, Chongqing 400045, China；3.Chongqing Institute of Green and Intelligent Technology, Chinese Academy of Sciences, Chongqing 400714, China)., 2017,37(10)：3758~3763

Thermodynamic parameters of interactions between extracelluar polymeric substances (EPS) and sulfamethazine antibiotics were investigated by isothermal titration calorimetry (ITC) in this study. Results showed that extracellular proteins strongly combined with sulfamethazine (SMZ), and the binding process depended on entropy driven by the hydrophobic interaction as the main driving force. The binding was significantly affected by pH and ionic strength. The binding of EPS and SMZ and the conformational change was the most favorable and the maximal, respectively, at the condition of pH 6.8. The ionic strength had a significant effect on the interaction between EPS and SMZ. The results implied that EPS contained in activated sludge may had a significant influence on the fate of antibiotics in water environment.

extracelluar polymeric substances；isothermal titration calorimetry (ITC)；sulfamethazine；pH；ionic strength

X703

A

1000-6923(2017)10-3758-06

王 靜(1985-),女,四川樂山人,碩士,講師,主要從事水污染控制技術(shù)研究.發(fā)表論文10篇.

2017-03-30

國家水體污染控制與治理重大科技專項(xiàng)(2013ZX07315- 001-02);重慶市建設(shè)科技計(jì)劃項(xiàng)目(城科字2015第1-32號(hào));重慶市教委科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(:KJ1504207);重慶建筑工程職業(yè)學(xué)院青年基金項(xiàng)目.

* 責(zé)任作者, 教授, jfy@cqu.edu.cn