賴人旭 麥 蕾 高敏照 任江南 茍新敏 郭惠學(xué)

(中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東 珠海 519000)

1 中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院病理科

·腫瘤·

結(jié)腸癌組織中Beclin1、p62的表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系

賴人旭 麥 蕾 高敏照 任江南 茍新敏1郭惠學(xué)

(中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東 珠海 519000)

目的探討結(jié)腸癌患者組織中Beclin1、p62的表達(dá)水平及其與臨床病理特征的關(guān)系。方法選取2013年1月至2015年12月中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院病理科保存的78例手術(shù)切除結(jié)腸癌組織標(biāo)本，并以癌旁正常黏膜組織(距離病灶組織>5 cm)標(biāo)本作為對(duì)照，采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)兩組組織標(biāo)本中Beclin1、p62的表達(dá)水平，分析其與臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果結(jié)腸癌組織中Beclin1陽(yáng)性表達(dá)率低于癌旁正常黏膜組織，p62陽(yáng)性表達(dá)率高于癌旁正常黏膜組織(P<0.05)。腫瘤直徑≥5 cm、低分化、Ⅲ+Ⅳ期、腸壁浸潤(rùn)深度T3～T4、有遠(yuǎn)處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌組織中Beclin1陽(yáng)性表達(dá)率更低，p62陽(yáng)性表達(dá)率更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Spearman秩相關(guān)分析顯示結(jié)腸癌組織中Beclin1與p62呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.571，P=0.012)。結(jié)論Beclin1在結(jié)腸癌組織中呈低表達(dá)水平，p62呈高表達(dá)水平，可能參與了結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，聯(lián)合檢測(cè)可作為早期輔助診斷結(jié)腸癌及評(píng)估預(yù)后的重要指標(biāo)。

結(jié)腸癌；Beclin1；p62

大多結(jié)腸癌患者在確診時(shí)已接近中晚期，手術(shù)切除聯(lián)合術(shù)后放、化療是目前臨床治療結(jié)腸癌的常見(jiàn)手段。但患者預(yù)后較差，術(shù)后易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，5年生存率較低〔1〕。研究表明〔2〕，細(xì)胞自噬在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中有重要作用。Beclin1是位于人17號(hào)染色體上的與自噬有關(guān)的基因，介導(dǎo)了腫瘤細(xì)胞的自噬、凋亡、分化過(guò)程。研究顯示Beclin1可評(píng)估局部晚期結(jié)腸癌的預(yù)后〔3〕。p62是在胞質(zhì)中合成，定位于細(xì)胞核中的磷酸化蛋白，研究發(fā)現(xiàn)p62表達(dá)增強(qiáng)與自噬抑制有關(guān)，其作為自噬標(biāo)志物參與了自噬降解和自噬抑制過(guò)程〔4〕。本研究旨在探討B(tài)elcin1、p62在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2013年1月至2015年12月中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院病理科保存的78例手術(shù)切除的結(jié)腸癌組織標(biāo)本，納入標(biāo)準(zhǔn)：①組織標(biāo)本經(jīng)活檢證實(shí)為結(jié)腸癌；②術(shù)前未經(jīng)任何放、化療治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①心臟功能不全者；②肝腎功能障礙者；③合并其他惡性腫瘤；④合并其他可能影響本研究結(jié)果的疾病。其中男45例，女33例；年齡52～77〔平均(63.5±4.9)〕歲；腫瘤直徑：<5 cm 38例，≥5 cm者40例；組織學(xué)分型：腺癌45例，黏液腺癌33例；分化程度：低分化29例，中高分化49例；TNM分期：Ⅰ+Ⅱ期43例，Ⅲ+Ⅳ期35例；腸壁浸潤(rùn)深度：T1～T2 37例，T3～T4 41例；有遠(yuǎn)處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移36例，無(wú)遠(yuǎn)處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移42例。并以癌旁正常黏膜組織(距離惡性腫瘤位置>5 cm)標(biāo)本作為對(duì)照。所有組織標(biāo)本均采用濃度為4%的多聚甲醛固定保存。

1.2方法

1.2.1主要試劑和儀器 美國(guó)AB-CAM公司提供的一抗Beclin1兔多抗、p62鼠單抗，稀釋為1∶100。鏈霉素抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶(Ultra Sensitive TMSP)超敏試劑盆、檸檬酸組織抗原修復(fù)液和DAB顯色試劑盒均購(gòu)于福州邁新公司。德國(guó)LEICA公司提供的HI-1220型烘片機(jī)，RM-2245型組織切片，HI-1210型展片臺(tái)。

1.2.2免疫組化染色 采用免疫組化SP法對(duì)結(jié)腸癌組織、癌旁正常黏膜組織中的Beclin1、p62表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)：分別取各自經(jīng)濃度4%的多聚甲醛固定3 d的組織標(biāo)本，采用磷酸緩沖液(含20%～30%蔗糖)梯度脫水后將其置于-20℃的冰凍切片機(jī)上連續(xù)切片，并進(jìn)行免疫組化染色，再以二甲苯進(jìn)行脫蠟處理，并酒精梯度脫水，在3%的過(guò)氧化氫，溫度為27℃的環(huán)境下孵育10 min，將內(nèi)源性過(guò)氧化物酶滅活，滴加一抗過(guò)夜處理，在滴加經(jīng)生物素標(biāo)記的二抗后于27℃環(huán)境下孵育1 h，最后滴加經(jīng)辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素工作液，再以二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色后以蘇木素復(fù)染，封片后在顯微鏡下觀察染色結(jié)果。

1.3結(jié)果判定 Beclin1陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)：Beclin1主要在細(xì)胞質(zhì)中呈棕黃色顆粒，陰性則為淡藍(lán)色樣的核樣結(jié)果；p62陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)：p62在細(xì)胞質(zhì)中呈棕黃色顆粒。在每個(gè)高倍視野(×400)下讀取Beclin1、p62陽(yáng)性染色細(xì)胞的數(shù)量，連續(xù)讀5個(gè)高倍視野，并取平均值；染色細(xì)胞強(qiáng)度評(píng)分：0分為無(wú)染色，1分為淡黃色顆粒，2分為黃色顆粒，3分為棕黃色顆粒；染色細(xì)胞比例評(píng)分：陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)<25%為0分，25%～50%為1分，51%～75%為2分，≥76%為3分；染色細(xì)胞強(qiáng)度評(píng)分與染色細(xì)胞比例評(píng)分相加評(píng)價(jià)最終結(jié)果：陰性(-)計(jì)0分，弱陽(yáng)性(+)計(jì)1～2分，中強(qiáng)陽(yáng)性()計(jì)3～4分，強(qiáng)陽(yáng)性()計(jì)5～6分〔5〕。陽(yáng)性率=(+)+()+()/總例數(shù)×100%。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行t、χ2檢驗(yàn)、Spearman秩相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1結(jié)腸癌組織和癌旁正常黏膜組織中Beclin1、p62表達(dá)水平比較 結(jié)腸癌組織中Beclin1、p62陽(yáng)性表達(dá)率分別為26.92%(-57例，+11例，7例，3例)、62.82%(-29例，+29例，13例，7例)，癌旁正常黏膜組織中分別為71.79%(-22例，+29例，15例，12例)、21.79%(-61例，+10例，5例，2例)，結(jié)腸癌組織中Beclin1陽(yáng)性表達(dá)率低于癌旁正常黏膜組織，p62陽(yáng)性表達(dá)率高于癌旁正常黏膜組織(χ2=31.415,26.893；均P=0.000)。

2.2結(jié)腸癌組織中Beclin1、p62陽(yáng)性表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 腫瘤直徑≥5 cm、低分化、Ⅲ+Ⅳ期、腸壁浸潤(rùn)深度T3～T4、有遠(yuǎn)處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌組織中Beclin1陽(yáng)性表達(dá)率低于腫瘤直徑<5 cm、中高分化、Ⅰ+Ⅱ期、腸壁浸潤(rùn)深度T1～T2、無(wú)遠(yuǎn)處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌組織，腫瘤直徑≥5 cm、低分化、Ⅲ+Ⅳ期、腸壁浸潤(rùn)深度T3～T4、有遠(yuǎn)處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌組織中p62陽(yáng)性表達(dá)率高于腫瘤直徑<5 cm、中高分化、Ⅰ+Ⅱ期、腸壁浸潤(rùn)深度T1～T2、無(wú)遠(yuǎn)處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌組織(P<0.05)，結(jié)腸癌組織中Beclin1、p62陽(yáng)性表達(dá)率與年齡、組織學(xué)分型無(wú)關(guān)(P>0.05)。見(jiàn)表1。

2.3結(jié)腸癌組織中Beclin1與p62相關(guān)性分析 結(jié)腸癌組織中Beclin1與p62呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.571，P=0.012)；其中Beclin1-,且p62-23例，p62+34例；Beclin 1+,且p62-6例，p62+15例。

表1 結(jié)腸癌組織中Beclin1、p62陽(yáng)性表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系〔n(%)〕

3 討 論

結(jié)腸癌主要發(fā)生于直腸及直腸與乙狀結(jié)腸交界處，多發(fā)于男性。結(jié)腸癌早期主要行手術(shù)切除，但術(shù)后患者易復(fù)發(fā)和發(fā)生周?chē)馨徒Y(jié)轉(zhuǎn)移，而病理分期晚、分化程度較低、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理特征是影響預(yù)后的主要因素〔6〕。

自噬即為自體吞噬，是在自噬相關(guān)基因的調(diào)控下，細(xì)胞利用溶酶體對(duì)自身衰老的線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及異常蛋白等“異常結(jié)構(gòu)”消化降解的過(guò)程。自噬可預(yù)防病原微生物的侵入感染、腫瘤、神經(jīng)退行性病變等，是細(xì)胞適應(yīng)內(nèi)外環(huán)境所需要的基本調(diào)節(jié)方式〔7〕。Utaipan等〔8〕研究表明，腫瘤組織中自噬作用明顯低于正常組織；Sun等〔9〕實(shí)驗(yàn)表明，致癌物質(zhì)對(duì)鼠胰腺細(xì)胞誘導(dǎo)后，癌癥前期的腺瘤、結(jié)節(jié)自噬能力增加，但形成癌細(xì)胞以后自噬能力降低。上述結(jié)果表明，自噬與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程密切相關(guān)。Beclin1蛋白可與ClassⅢPI3K結(jié)合，以復(fù)合物的形式介導(dǎo)自噬體的形成，是自噬的整形調(diào)節(jié)基因。研究表明〔10〕，結(jié)直腸癌組織、胃癌組織中Beclin1 mRNA表達(dá)水平較癌旁組織顯著下降，同時(shí)Beclin1蛋白水平也明顯降低。P62蛋白由N端Phox和Beml結(jié)構(gòu)域、C端的泛素相關(guān)結(jié)構(gòu)域及中間段的鋅指結(jié)構(gòu)域3個(gè)結(jié)構(gòu)組成，它能夠與泛素化蛋白結(jié)合，并通過(guò)與LC3蛋白結(jié)合以復(fù)合物的形式促進(jìn)蛋白轉(zhuǎn)入自噬溶酶體內(nèi)發(fā)生降解，自噬發(fā)生表明蛋白不斷降解，p62逐漸降低，反之，自噬發(fā)生缺陷時(shí)，p62聚集，表達(dá)水平明顯升高，因此，p62可作為自噬活性的重要標(biāo)志蛋白〔11〕。

本研究結(jié)果提示Beclin1在結(jié)腸癌組織中表達(dá)水平降低，p62在結(jié)腸癌組織中表達(dá)水平升高，可能參與了結(jié)腸癌的發(fā)病過(guò)程，兩種指標(biāo)可作為臨床早期輔助診斷結(jié)腸癌的重要指標(biāo)。趙堅(jiān)培等〔10〕研究結(jié)果顯示Beclin1 mRNA在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)水平低于癌旁在組織，并證實(shí)自噬活性在結(jié)腸癌發(fā)病過(guò)程中明顯降低。Park等〔12〕發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌組織中p62明顯聚集，降解受阻。腫瘤大小、分化程度、TNM分期、浸潤(rùn)深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理特征與患者病情進(jìn)展密切相關(guān)，同時(shí)也是評(píng)價(jià)患者預(yù)后的重要參考指標(biāo)，腫瘤體積越大、分化越低、TNM分期越晚、浸潤(rùn)深度越深及有遠(yuǎn)處淋巴結(jié)周?chē)D(zhuǎn)移的患者，病情越嚴(yán)重，預(yù)后越差。本研究結(jié)果提示Beclin1、p62可能參與了結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，可作為早期評(píng)估患者病情的重要指標(biāo)。進(jìn)一步采用Spearman秩相關(guān)分析，結(jié)腸癌組織中Beclin1與p62呈負(fù)相關(guān)性，可能與Beclin1水平降低引起自噬活性降低，從而導(dǎo)致自噬底物p62的大量聚集，進(jìn)而通過(guò)介導(dǎo)NF-κB信號(hào)途徑而致細(xì)胞發(fā)生癌變有關(guān)。提示聯(lián)合檢測(cè)Beclin1和p62有助于早期評(píng)估患者病情，進(jìn)而評(píng)估患者預(yù)后。

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賴人旭(1967-)，男，博士，副主任醫(yī)師，主要從事消化腫瘤的診斷和治療研究。

R73

A

1005-9202(2017)20-5059-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.20.047

〔2017-03-21修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)