羅 燕 徐崇明 段麗群

(湖北省腫瘤醫(yī)院胸部放療科，湖北 武漢 430079)

PIM1對(duì)老年食管癌患者癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響

羅 燕 徐崇明 段麗群

(湖北省腫瘤醫(yī)院胸部放療科，湖北 武漢 430079)

目的探討PIM1對(duì)老年食管癌患者癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響。方法將RNAi重組質(zhì)粒(PIM1-shRNA-3) 經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染食管癌ECA-109細(xì)胞株。PIM1基因沉默(PPIM1-shRNA-3)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的ECA-109細(xì)胞(轉(zhuǎn)染組)，用空質(zhì)粒載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的ECA-109細(xì)胞(空白轉(zhuǎn)染組)和正常培養(yǎng)的ECA-109細(xì)胞(對(duì)照組)作為對(duì)照進(jìn)行體外研究。通過細(xì)胞計(jì)數(shù)法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線圖，RT-PCR法測(cè)量PIM1基因表達(dá)水平，CCK-8法計(jì)算其增殖抑制率，AnnexinV-FITC/PI流式法和TUNEL法測(cè)算凋亡情況來檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力。結(jié)果載體成功轉(zhuǎn)入到食管癌細(xì)胞中并表達(dá)，轉(zhuǎn)染組ECA-109細(xì)胞數(shù)量減少；轉(zhuǎn)染組腫瘤細(xì)胞PIM1基因表達(dá)水平明顯低于空白轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組(P<0.05)，且轉(zhuǎn)染組PIM1 mRNA相對(duì)表達(dá)與空白轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組相比顯著降低(P<0.05)；相比空白轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組，ECA-109細(xì)胞計(jì)數(shù)和增殖能力在轉(zhuǎn)染組明顯降低(P<0.05)；與空白轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組比較，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的細(xì)胞抑制率明顯升高，P<0.05；TUNEL和AnnexinV-FITC/PI法檢測(cè)結(jié)果表明：PIM1基因沉默可促進(jìn)細(xì)胞的凋亡反應(yīng)，進(jìn)而抑制細(xì)胞的增殖水平。結(jié)論食管癌ECA-109細(xì)胞株可通過PIM1基因沉默抑制增殖，增加凋亡。

食管癌；PIM1；基因沉默；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡

大多數(shù)食管癌患者在就診時(shí)已處于中晚期，相當(dāng)一部分病人已經(jīng)不能進(jìn)行手術(shù)治療，總的5年生存率低于10%，因此食管癌的治療仍強(qiáng)調(diào)早期診斷〔1〕。隨著我國(guó)人口老年化進(jìn)程，高齡食管癌患者日益增多〔2〕。當(dāng)前，從基因角度出發(fā)，探尋食管癌的發(fā)病機(jī)制、診斷標(biāo)準(zhǔn)以及治療手段對(duì)于食管癌的診療具有重要意義〔3,4〕。PIM1屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶PIM家族，可抑制細(xì)胞凋亡，被認(rèn)為與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)〔5〕。本研究擬探討PIM1基因沉默對(duì)食管癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響。

1 材料和方法

1.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 在含有10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中對(duì)食管癌ECA-109細(xì)胞株(購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所，常規(guī)培養(yǎng)質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自北京天為時(shí)代生物有限公司)常規(guī)培養(yǎng)。于轉(zhuǎn)染前1 d用2×105個(gè)/孔將細(xì)胞接種到24孔板上，具體轉(zhuǎn)染方法嚴(yán)格根據(jù)LipofectamineTM2000 Reagent的使用說明進(jìn)行。培養(yǎng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h后，再換成RPM1-1640完全培養(yǎng)基，此培養(yǎng)基含有G418(600 mg/L)。經(jīng)過大約3 w的篩選，最后獲取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的 PIM1基因沉默的重組質(zhì)粒組(轉(zhuǎn)染組)；與此同時(shí)，采用空載體質(zhì)粒組轉(zhuǎn)染的PIM1細(xì)胞作為陰性對(duì)照組(空白轉(zhuǎn)染組)，以正常ECA-109細(xì)胞作為對(duì)照組。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行收集并冷凍保存，留置待用。

1.2熒光定量RT-PCR法檢測(cè)PIM1基因表達(dá) 采用Trizol(Invitrogen公司)一步法〔6〕，提取標(biāo)本總RNA，并通過紫外分析技術(shù)及甲醛變性電泳檢測(cè)獲得的RNA質(zhì)量。取1 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄成DNA。內(nèi)參照β-actin上游引物5'-TCCCGGCATGTGCAAGGCC-3'，下游引物5'-CATCTCTTGCTCGAAGTCCA-3'，目的片段545 bp；PIM1上游引物5'-CTCCACCGCGACATCAAGGA-3'，下游引物5'-GATGGTCTCAGGGCCAAGCA-3'，目的片段338 bp。PCR反應(yīng)條件：94℃ 5 min→(94℃ 30 s→50℃ 30 s→72℃ 30 s)30個(gè)循環(huán)→72℃ 10 min，在1% 瓊脂糖凝膠中對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析〔7〕。

1.3檢測(cè)細(xì)胞增殖及其抑制率并繪制生長(zhǎng)曲線 分別取各組的PIM1細(xì)胞，以1×104/孔接種到24孔板中，每小組分別取4個(gè)平行孔，接種48 h后，倒立放置在顯微鏡下觀察并進(jìn)行拍照記錄，記錄72 h和96 h后的細(xì)胞數(shù)。每個(gè)小組接種7個(gè)復(fù)孔，并在37℃和5% CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，每天對(duì)1孔進(jìn)行3次計(jì)數(shù)，連續(xù)7 d，采用3次的平均數(shù)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。以4×105/孔接種3組細(xì)胞到在96孔培養(yǎng)板上，每小組24復(fù)孔。分別添加CCK-8試劑(購(gòu)于同仁化學(xué)研究所)10 μl，在接種后的24、48、72 h，測(cè)定450 nm處的吸光度值(OD值)。取培養(yǎng)液作為空白對(duì)照，取其平均值。細(xì)胞增殖抑制率公式：抑制率 = (1-實(shí)驗(yàn)組 OD值/對(duì)照組OD值)×100%〔8〕。

1.4TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 預(yù)置蓋玻片的24孔板中對(duì)各組食管癌細(xì)胞進(jìn)行接種，培養(yǎng)72 h，使用TUNEL試劑盒法(TUNEL法凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于Roche公司)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況；采用光學(xué)顯微鏡觀察凋亡細(xì)胞，計(jì)算凋亡指數(shù)。結(jié)果判定：隨機(jī)選取5個(gè)400倍高倍鏡視野，凋亡細(xì)胞為出現(xiàn)在細(xì)胞核內(nèi)的棕黃色或深褐色顆粒。

1.5AnnexinV-FITC/PI流式法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 各組轉(zhuǎn)染細(xì)胞接種在6孔板中，并置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，長(zhǎng)至80% 融合時(shí)，換新的DMEM培養(yǎng)基。以不含EDTA的胰酶消化處理后，收集1×105細(xì)胞，加入500 μl binding buffer重懸細(xì)胞，然后加入5 μl Annexin V-FITC溶液混勻后加入5 μl Propidum Iodide混勻(凱基生物有限公司,南京，中國(guó))，室溫下避光反應(yīng)5～15 min。以流式細(xì)胞儀FACSCalibur(BD Bioscience,USA) 檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件計(jì)量資料組間比較采用t檢驗(yàn)，多組之間的比較采用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組細(xì)胞株的轉(zhuǎn)染效果 轉(zhuǎn)染PIM1基因沉默的重組質(zhì)粒組和陰性對(duì)照組中，約70%～80%的細(xì)胞都能檢測(cè)到熒光信號(hào)，而在正常對(duì)照組中不出現(xiàn)熒光信號(hào)。見圖1。

2.2各組腫瘤細(xì)胞基因PIM1表達(dá)水平 轉(zhuǎn)染組腫瘤細(xì)胞PIM1基因表達(dá)水平(0.29±0.02)明顯低于空白轉(zhuǎn)染組(0.42±0.03)和對(duì)照組(0.44±0.04)，轉(zhuǎn)染組與空白轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組相比差異顯著(均P<0.05)；空白轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組間無明顯差異(P>0.05)。

2.3細(xì)胞生長(zhǎng)曲線 3組細(xì)胞均隨著時(shí)間生長(zhǎng)，但增殖能力和速率不一樣。相比空白轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組，轉(zhuǎn)染組ECA-109細(xì)胞在各檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)明顯減少(均P<0.05)。而空白轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

圖1 熒光顯微鏡檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率

組別48h72h96h轉(zhuǎn)染組229±0211)314±0251)398±0331)空白轉(zhuǎn)染組411±028603±038712±041對(duì)照組434±028639±041754±059

與空白轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組相比:1)P<0.05

2.4細(xì)胞增殖抑制率測(cè)定 結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染組在24、48、72 h的細(xì)胞抑制率分別為(30.32±4.24)%、(38.39±5.87)%、(58.45±7.22)%，與空白轉(zhuǎn)染組〔(3.32±0.10)%，(4.01±0.14)%，(6.24±0.18)%〕和對(duì)照組(0)相比明顯升高(P<0.05)；而空白轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組比較差異不明顯(P>0.05)。

2.5各組細(xì)胞凋亡情況比較 經(jīng)過TUNEL染色后，凋亡細(xì)胞將會(huì)顯示棕黃色，在對(duì)照組和空白轉(zhuǎn)染組中棕色顆粒并不明顯，反映細(xì)胞凋亡程度并不高。而在轉(zhuǎn)染的 PIM1基因沉默的重組質(zhì)粒組(轉(zhuǎn)染組)中，能觀察到明顯的凋亡細(xì)胞，說明凋亡程度較高。與空白轉(zhuǎn)染組〔(3.02±0.14)%〕和對(duì)照組〔(2.95±0.10)%〕相比，轉(zhuǎn)染組〔(12.36±0.45)%〕的凋亡率較高(P<0.05)，而空白轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組比較無顯著差異(P>0.05)。

3 討 論

有關(guān)研究顯示，在前列腺癌中，PIM1有顯著的高表達(dá)，提示PIM1可為診斷前列腺癌的新標(biāo)志物〔9〕。PIM1表達(dá)與前列腺癌的分期和預(yù)后有關(guān)〔10〕。不僅僅是前列腺癌，與配對(duì)的正常組織相比，PIM1 mRNA水平在肺癌、膀胱癌、胃癌等眾多疾病組織中均呈高表達(dá)狀態(tài)，這也提示了PIM1基因高表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖〔11，12〕。

本研究表明PIM1基因沉默對(duì)食管癌細(xì)胞有顯著抑制作用。有研究顯示，經(jīng)過轉(zhuǎn)染的PC細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)PIM1表達(dá)，且過表達(dá)PIM1的細(xì)胞增殖速度明顯大于對(duì)照組，表明PIM1基因?qū)C細(xì)胞增殖有調(diào)控作用〔13〕。Li等〔14〕在研究食管癌細(xì)胞株EC9706中，用siRNA干擾PIM1的表達(dá)后得出結(jié)論：通過下調(diào)食管癌細(xì)胞中PIM1的表達(dá)，癌細(xì)胞的凋亡速度隨著PIM1基因表達(dá)量下降而增快，而增殖速度則隨著PIM1基因表達(dá)量下降而減慢。提示在食管癌的進(jìn)展中PIM1可能發(fā)揮相當(dāng)重要的作用，也為大家提供了一條新的研究思路，抑制PIM1表達(dá)也許可作為對(duì)食管癌分子的靶向治療。

1Zhang Y.Epidemiology of esophageal cancer〔J〕.World Journal of Gastroenterology,2013;19(34):5598.

2王 凱.高齡食管癌患者術(shù)后肺不張防治分析〔J〕.浙江臨床醫(yī)學(xué),2012;14(11):1407-8.

3Ghadimi MR,Rasouli M,Mahmoodi M,etal.Prognostic factors for the survival of patients with esophageal cancer in Northern Iran〔J〕.J Res Med Sci,2011;16(10):1261-72.

4Li GN,Li XM,Liu YQ,etal.Association between glutathione S-transferases M1 and T1 gene polymorphisms and esophageal cancer prognosis〔J〕.Int J Clin Exp Med,2015;8(3):3300-8.

5Zhang G,Liu Z,Cui G,etal.MicroRNA-486-5p targeting PIM-1 suppresses cell proliferation in breast cancer cells〔J〕.Tumor Biol,2014;35(11):11137-45.

6Liu SG,Qin XG,Zhao BS,etal.Differential expression of miRNAs in esophageal cancer tissue〔J〕.Oncol Lett,2013;5(5):1639-42.

7Sharma P,Saraya A,Gupta P,etal.Decreased levels of circulating and tissue miR-107 in human esophageal cancer〔J〕.Biomarkers,2013;18(4):322-30.

8鄭學(xué)芝,孫 衛(wèi),張緒東,等.Nucleostemin基因沉默對(duì)食管癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志,2011;31(21):3121-3.

9Kim J,Roh M,Abdulkadir SA.Pim1 promotes human prostate cancer cell tumorigenicity and c-MYC transcriptional activity〔J〕.BMC Cancer,2010;10(1):1-15.

10He HC,Bi XC,Zheng ZW,etal.Real-time quantitative RT-PCR assessment of PIM-1 and hK2 mRNA expression in benign prostate hyperplasia and prostate cancer〔J〕.Med Oncol,2009;26(3):303-8.

11Guo S,Mao X,Chen J,etal.Overexpression of Pim-1 in bladder cancer〔J〕.J Exp Clin Cancer Res,2010;29(1):1-7.

12Yan B,Yau EX,Samanta S,etal.Clinical and therapeutic relevance of PIM1 kinase in gastric cancer〔J〕.Gastric Cancer,2012;15(2):188-97.

13Kim J,Roh M,Abdulkadir SA.Pim1 promotes human prostate cancer cell tumorigenicity and c-MYC transcriptional activity〔J〕.Bmc Cancer,2010;10(3):1-15，443-51.

14Li S,Xi Y,Zhang H,etal.A pivotal role for PIM-1 kinase in e-sophageal squamous cell carcinoma involving cell apoptosis in-duced by reducing Akt phosphorylation〔J〕.Oncol Rep，2010;24( 4):997-1004.

羅 燕 (1979-)，女，博士，住院醫(yī)師，主要從事腫瘤學(xué)研究。

R73

A

1005-9202(2017)20-5005-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.20.022

〔2017-04-06修回〕

(編輯 曲 莉)