何建林 李 玨 楊 娜

(云南省第二人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，云南 昆明 650021)

1 胸外科

siRNA TPM4對(duì)肺癌細(xì)胞增殖凋亡的影響

何建林 李 玨1楊 娜

(云南省第二人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，云南 昆明 650021)

目的探討原肌球蛋白(TPM)4小干擾RNA(siRNA TPM4)對(duì)肺癌細(xì)胞增殖凋亡的影響。方法以人肺癌細(xì)胞A549為研究對(duì)象，細(xì)胞轉(zhuǎn)染TPM4 siRNA(TPM4 siRNA組)、siRNA control(siRNA control組)，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，對(duì)照組中只加入轉(zhuǎn)染試劑。培養(yǎng)48 h后，Western印跡檢測(cè)細(xì)胞TPM4、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Cleaved Caspase)-3、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病(Bcl)-2的表達(dá)水平，噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果siRNA control組細(xì)胞中TPM4、Cleaved Caspase-3、Bcl-2表達(dá)水平及細(xì)胞存活率、細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組相比均無明顯差異(P>0.05)。TPM4 siRNA組細(xì)胞中TPM4表達(dá)水平及細(xì)胞存活率均明顯低于對(duì)照組(P<0.01)。TPM4 siRNA組細(xì)胞中Cleaved Caspase-3表達(dá)水平及細(xì)胞凋亡率均明顯高于對(duì)照組，而Bcl-2明顯低于對(duì)照組(P<0.01)。結(jié)論TPM4 siRNA能夠抑制肺癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡。

肺癌；增殖；凋亡；原肌球蛋白4

據(jù)統(tǒng)計(jì)，肺癌的發(fā)病率在男性全部惡性腫瘤中位居第一，在女性全部惡性腫瘤中位居第3位〔1〕。常見的治療肺癌的方法是手術(shù)治療、放療和化療。原肌球蛋白(TPM)是一種廣泛存在于哺乳動(dòng)物體內(nèi)的肌肉調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白。TPM4是TPM家族的成員之一，與腫瘤的發(fā)展有關(guān)〔2〕。研究表明，TPM4在乳腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌、膠質(zhì)瘤、膀胱癌等多種癌癥中均過度表達(dá)〔3〕。下調(diào)結(jié)直腸癌細(xì)胞中的TPM4表達(dá)能抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡〔4〕。本研究旨在探討TPM4對(duì)肺癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞 人肺癌細(xì)胞A549購自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫。

1.2主要儀器及試劑 二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度檢測(cè)試劑盒購于碧云天生物技術(shù)研究所；胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素、噻唑藍(lán)(MTT)均購于美國(guó)Sigma；胎牛血清購于美國(guó)Gibco；TPM4單克隆抗體、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved Caspase-3)單克隆抗體、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)單克隆抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)單克隆抗體均購于美國(guó)CTS；LipofectamineTMRNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑購于美國(guó)Invitrogen；流式細(xì)胞儀購于美國(guó)Thermo。

1.3細(xì)胞培養(yǎng) 取出保存在液氮灌中的肺癌細(xì)胞A549，迅速放在37℃融化后，用含有10%胎牛血清、100 μg/ml鏈霉素、100 U/ml青霉素的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞后，1 000 r/min離心10 min，棄上清液，加入5 ml細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，接種到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，放置于37℃，飽和濕度，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察細(xì)胞融合度超過85%時(shí)，倒掉細(xì)胞培養(yǎng)液，加入0.25%的胰蛋白酶，放在37℃消化2 min，加入適量的細(xì)胞培養(yǎng)液，根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求按照不同比例接種到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中且細(xì)胞濃度為70%的人肺癌細(xì)胞A549，分為對(duì)照組、TPM4 siRNA組、siRNA control組。根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，把Opti-MEM Reduced serum Medium 和MAX按照體積比為40∶1的比例混合為A液，將TPM4 siRNA、siRNA control分別與Opti-MEM Reduced serum Medium混合后為B液，將A液與B液混合，放置于室溫條件下反應(yīng)20 min。取濃度為70%的人肺癌細(xì)胞A549，吸除上清液，每孔中加入Opti-MEM Reduced serum Medium 2 ml孵育20 min。取A液與B液的混合物加入到細(xì)胞中，放在37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，更換細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

1.5Western印跡檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中TPM4表達(dá)水平 取轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h的人肺癌細(xì)胞A549，加入蛋白抽提試劑，放在冰上裂解20 min。將裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中，4℃，12 000 r/min離心15 min。移液槍吸取蛋白上清至EP管中，BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒對(duì)提取的蛋白定量。將提取的蛋白與5倍上樣緩沖液按照體積比為4∶1的比例混合，放置在100℃的孵育器中反應(yīng)5 min后，按照每孔50 μl變性蛋白樣品加入到聚丙烯酰胺凝膠上樣孔中，80 V電壓電泳30 min后，觀察溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠和濃縮膠邊緣時(shí)，120 V電壓至電泳結(jié)束。取出蛋白凝膠4℃轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上。5%脫脂奶粉封閉2 h，依次與一抗(500倍稀釋，4℃孵育過夜)、二抗(2 000倍稀釋，37℃反應(yīng)2 h)孵育后，滴加顯色液，以GAPDH為內(nèi)參，Image圖像分析軟件分析蛋白表達(dá)含量。

1.6MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖 取轉(zhuǎn)染后的人肺癌細(xì)胞A549，胰蛋白酶消化后，調(diào)整細(xì)胞濃度使每毫升細(xì)胞懸浮液中含有1×105個(gè)細(xì)胞，按照每孔100 μl細(xì)胞懸浮液接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)48 h，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置空白組，空白組中不加細(xì)胞。加入5 mg/ml的MTT溶液，放在CO2培養(yǎng)箱中孵育反應(yīng)4 h。吸除上清液，加入二甲基亞砜溶液150 μl，在避光環(huán)境中孵育10 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)每孔的吸光度。

1.7流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取轉(zhuǎn)染后的人肺癌細(xì)胞A549，胰蛋白酶消化后，收集1×106個(gè)細(xì)胞，用冰預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞2次，加入結(jié)合緩沖液充分混合后，加入碘化丙啶(PI)和膜聯(lián)蛋白-V-FITC(Annexin-V-FITC)各5 μl，放置于避光條件下孵育反應(yīng)20 min，加結(jié)合緩沖液400 μl，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。同時(shí)用Western印跡檢測(cè)轉(zhuǎn)染48 h后的人肺癌細(xì)胞中Cleaved Caspase-3、Bcl-2的表達(dá)水平，步驟同1.5。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS22.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中TPM4表達(dá)檢測(cè)結(jié)果 siRNA control組細(xì)胞中TPM4表達(dá)水平(0.58±0.07)與對(duì)照組(0.58±0.06)無顯著差異(P>0.05)，TPM4 siRNA組(0.12±0.08)無明顯低于對(duì)照組(P<0.01)。見圖1。

2.2細(xì)胞增殖檢測(cè)結(jié)果 siRNA control組細(xì)胞存活率〔(99.89±1.49)%〕與對(duì)照組〔(100.24±1.06)%〕相比無顯著差異(P>0.05)，TPM4 siRNA組〔(62.34±1.15)%〕明顯低于對(duì)照組(P<0.01)。

2.3細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果 siRNA control組細(xì)胞凋亡率及Cleaved Caspase-3、Bcl-2水平與對(duì)照組相比無顯著差異(P>0.05)。TPM4 siRNA組細(xì)胞凋亡率及Cleaved Caspase-3水平均明顯高于對(duì)照組(P<0.01)，Bcl-2水平明顯低于對(duì)照組(均P<0.01)。見圖2，表1。

圖1 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中TPM4表達(dá)水平

圖2 細(xì)胞中Cleaved Caspase-3、Bcl-2表達(dá)檢測(cè)結(jié)果

組別凋亡率(%)CleavedCaspase?3Bcl?2對(duì)照組1120±132035±004051±006siRNAcontrol組1117±212035±005050±008TPM4siRNA組3247±1021)082±0081)029±0071)

與對(duì)照組比較：1)P<0.01

3 討 論

多種因素均能引起肺癌的發(fā)生，而且肺癌早期臨床癥狀不明顯，多數(shù)患者確診時(shí)已經(jīng)是肺癌晚期。TPM4是近年來研究發(fā)現(xiàn)的與腫瘤發(fā)展有關(guān)的一種與肌肉收縮有關(guān)的調(diào)節(jié)蛋白〔5〕。TPM4參與調(diào)控宮頸癌、肺癌、舌鱗癌、骨肉瘤、前列腺癌等多種癌細(xì)胞的生長(zhǎng)〔6〕。干擾結(jié)直腸癌細(xì)胞中的TPM4表達(dá)后，結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡增多〔4〕。

細(xì)胞增殖和凋亡是一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡的過程。在某系病理因素作用下，這種動(dòng)態(tài)平衡被打破，引起疾病的發(fā)生。細(xì)胞凋亡受多種因子共同調(diào)控。Caspase是一種與細(xì)胞凋亡相關(guān)的蛋白家族，在真核細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用〔7〕。正常情況下，細(xì)胞內(nèi)的Caspase前體沒有活性，在蛋白酶的作用下被激活，從而特異性的水解底物，引起細(xì)胞凋亡〔8〕。Caspase-3是Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的效應(yīng)因子，其激活標(biāo)志著細(xì)胞凋亡進(jìn)入不可逆階段〔9〕。Bcl-2蛋白家族是與細(xì)胞凋亡相關(guān)的另一蛋白家族，Bcl-2是Bcl-2蛋白家族的成員之一，在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮抑制作用〔10〕。有研究表明，癌細(xì)胞凋亡過程中，Caspase-3過度活化，Bcl-2表達(dá)下調(diào)〔11〕。本研究結(jié)果提示，干擾TPM4 能夠抑制人肺癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)人肺癌細(xì)胞凋亡。

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云南省科技計(jì)劃項(xiàng)目(No.2014FB054)

何建林(1978-)，男，主治醫(yī)師，主要從事呼吸重癥方面研究。

R734.2

A

1005-9202(2017)20-5003-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.20.021

〔2017-04-25修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)