蘇坤華

(三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 宜昌市中心人民醫(yī)院藥劑科，湖北 宜昌 443000)

磷脂酰肌醇-3-激酶/絲-蘇氨酸蛋白激酶在帕妥珠單抗耐藥機制中的作用

蘇坤華

(三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 宜昌市中心人民醫(yī)院藥劑科，湖北 宜昌 443000)

目的探討磷脂酰肌醇-3-激酶/絲-蘇氨酸蛋白激酶(PI3K/Akt)在帕妥珠單抗耐藥機制中的作用。方法建立人乳腺癌細胞株Hs578T耐帕妥珠單抗的耐藥亞株Hs-Her，(FISH)法分析耐藥細胞株Her表型；MTT法檢測帕妥珠單抗對Hs578T和Hs-Her細胞增殖的抑制情況；流式細胞術(shù)檢測帕妥珠單抗干預(yù)后細胞凋亡情況；PI3K/Akt抑制劑干預(yù)細胞后Western印跡檢測細胞P-Akt蛋白表達情況。結(jié)果本實驗建立的耐藥亞株Hs-Her基因表達FISH檢測呈強陽性；0.1～100 mg/L濃度帕妥珠單抗干預(yù)72 h后，Hs578T和Hs-Her細胞體外增殖均受到抑制，且隨帕妥珠單抗?jié)舛鹊脑黾佣嵘?，其中Hs578T的IC50值明顯低于Hs-Her(P<0.01)；10 mg/L的帕妥珠單抗干預(yù)后Hs578T細胞凋亡率明顯高于Hs-Her細胞(P<0.01)。預(yù)先經(jīng)PI3K/Akt抑制劑處理后再加入帕妥珠單抗，Hs578T和Hs-Her細胞均發(fā)生明顯凋亡，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。Western印跡檢測顯示，帕妥珠單抗可有效抑制Hs578T細胞Akt蛋白磷酸化，卻無法抑制Hs-Her細胞Akt蛋白磷酸化；PI3K/Akt信號通路抑制劑可同時抑制Hs578T和Hs-Her細胞的Akt蛋白磷酸化。結(jié)論帕妥珠單抗耐藥細胞Hs-Her存在Akt蛋白磷酸化，PI3K/Akt抑制劑可明顯抑制帕妥珠單抗耐藥細胞Akt蛋白磷酸化；PI3K/Akt信號通路與帕妥珠單抗耐藥性存在明確相關(guān)性。

帕妥珠單抗；磷脂酰肌醇-3-激酶絲蘇氨酸蛋白激酶；人乳腺癌細胞；耐藥

乳腺癌是中老年女性常見惡性腫瘤之一，發(fā)病率逐年上升。Her基因編碼跨膜受體型酪氨酸蛋白激酶在乳腺癌中過表達率>30%，且與保守治療低敏感性和不良預(yù)后密切相關(guān)〔1〕。帕妥珠單抗已逐漸成為治療Her基因陽性晚期乳腺癌的一線藥物，但仍有近半數(shù)的Her基因陽性患者對帕妥珠單抗敏感性差，多數(shù)患者給予帕妥珠單抗治療1年后會產(chǎn)生耐藥性〔2〕。帕妥珠單抗的耐藥機制復(fù)雜；相關(guān)研究顯示，磷脂酰肌醇-3-激酶/絲-蘇氨酸蛋白激酶(PI3K/Akt)信號通路激活是其耐藥的主要機制之一〔3〕。本研究旨在探討帕妥珠單抗的耐藥機制。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 人乳腺癌細胞株Hs578T購于上海拜力生物科技有限公司；帕妥珠單抗購于美國羅氏制藥公司。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶購于上海哈靈生物科技有限公司；雙染法細胞凋亡檢測試劑盒購于北京諾博萊德科技有限公司；兔抗人磷酸化蛋白激酶B抗體、PI3K/Akt抑制劑、兔抗人β-actin抗體購于上海萬疆生物技術(shù)有限公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG、原位雜交試劑盒購于上海拜力生物科技有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養(yǎng)和耐藥細胞株建立 常規(guī)貼壁法培養(yǎng)Hs578T細胞，培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的DMEM，置于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中孵育，0.25%胰蛋白酶消化傳代。按Narayan等〔4〕方法對Hs578T細胞連續(xù)處理6個月，建立耐帕妥珠單的耐藥亞株Hs-Her，從濃度為1 mg/L的帕妥珠單抗起，連續(xù)培養(yǎng)至可在帕妥珠單抗中穩(wěn)定生長，細胞形態(tài)與親代基本一致，之后逐漸提升培養(yǎng)液中帕妥珠單抗?jié)舛鹊?0 mg/L。每5 d換液1次；觀察細胞密度>70%時傳代，MTT法鑒定耐藥程度。

1.2.2FISH法分析耐藥細胞株Her表型 消化細胞配成密度為1×107/L的細胞懸液，取10 ml，2 000 r/min離心20 min，棄去上清。滴加濃度為0.56%的KCl溶液10 ml，吹打重懸細胞，水浴孵育30 min。滴加2 ml固定液，2 000 r/min離心20 min，棄上清至留下1 ml，加5 ml固定液重懸細胞，離心后留下1 ml，重懸后滴于玻片表面；自然晾干后在雜交區(qū)域滴加5 μl探針，封片后放入全自動雜交儀中過夜；拿去蓋玻片，洗滌后放入70%乙醇中浸泡5 min，暗處晾干；每張切片表面滴加10 μl DAPI，熒光顯微鏡下通過濾波片觀察，計數(shù)50個細胞，計算Ratio值。FISH熒光原位雜交檢測試劑盒包含兩種DNA探針：GLP Her和CSP17，其中Her探針熒光信號為橘紅色，CSP17為藍綠色，兩種信號的比值可用來判斷是否存在Her基因擴增。Ratio<1.8為陰性，無Her基因擴增；>2.2為陽性，存在Her基因擴增；在1.8～2.2之間時增加細胞計數(shù)重新判斷結(jié)果。

1.2.3細胞增殖抑制檢測 取對數(shù)期細胞，按1×107/L密度接種到96孔板中，培養(yǎng)24 h后滴加不同濃度的帕妥珠單抗，同時設(shè)置陰性對照，常規(guī)孵育72 h，往各細胞培養(yǎng)孔中加入10 μl濃度為10 g/L的MTT，繼續(xù)培養(yǎng)6 h后終止反應(yīng)，滴加100 μl的二甲基亞砜(DMSO)，振蕩15 min，放入酶標儀中讀取450 nm處的吸光度值，計算細胞增殖抑制率。

1.2.4細胞凋亡檢測 不同濃度帕妥珠單抗處理細胞，預(yù)先使用10 μmol/L的PI3K/Akt信號通路抑制劑處理細胞6 h后，再用10 mg/L的帕妥珠單抗共同處理細胞。收集貼壁和懸浮的細胞，2 000 r/min離心10 min，磷酸緩沖液洗滌細胞后計數(shù)；結(jié)合緩沖液重懸細胞，調(diào)整濃度至1×108/L，將200 μl細胞懸液轉(zhuǎn)入5 ml流式管中，滴加Annexin V 和PI各5 μl，混合均勻后避光靜置5 min，流式細胞儀檢測，計算早期細胞凋亡率。

1.2.5Western印跡檢測細胞P-Akt蛋白表達 分別用帕妥珠單抗和PI3K/Akt信號通路抑制劑處理578T細胞和耐藥亞株Hs-Her細胞，培養(yǎng)24 h，加入細胞裂解靜置30 min，4℃ 12 000 r/min離心30 min，取上清；行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，濕法轉(zhuǎn)移至聚偏氧乙烯(PVDF)膜，室溫封閉3 h，滴加兔抗人磷酸化蛋白激酶B抗體(1∶500)，孵育過夜，滴加二抗，室溫孵育2 h，凝膠成像系統(tǒng)掃描并分析條帶中的灰度值。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析 使用SPSS18.0軟件進行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1耐藥亞株Hs-Her細胞的FISH檢測情況 Hs578T細胞中Ratio為1.52，呈陰性，無Her基因擴增；Hs-Her細胞中Ratio為2.81，呈陽性，存在Her基因擴增。見圖1。

2.2帕妥珠單抗對Hs578T和Hs-Her細胞增殖的抑制和凋亡情況 不同濃度帕妥珠單抗干預(yù)72 h后，Hs578T和Hs-Her細胞體外增殖均受到抑制，且隨帕妥珠單抗?jié)舛鹊脑黾佣嵘?。帕妥珠單抗對Hs578T的IC50為1.447 mg/L，Hs-Her的IC50為34.015 mg/L，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。不同濃度Hs578T和Hs-Her細胞增殖抑制率之間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表1。流式細胞儀檢測顯示，10 mg/L的帕妥珠單抗干預(yù)Hs578T和Hs-Her細胞后細胞凋亡率分別為25.69%±0.62%、7.05%±0.38%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

圖1 Hs-Her細胞株對帕妥珠單抗耐藥性的FISH檢測結(jié)果

2.3PI3K/Akt抑制劑和帕妥珠單抗對細胞凋亡和P-Akt蛋白表達的影響 流式細胞儀檢測顯示，預(yù)先經(jīng)PI3K/Akt抑制劑處理后再加入帕妥珠單抗，Hs578T和Hs-Her細胞均發(fā)生明顯凋亡，分別為28.30%±4.35%、27.92%±2.71%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。Western印跡檢測顯示，10 mg/L的帕妥珠單抗可有效抑制Hs578T細胞Akt蛋白磷酸化，卻無法抑制Hs-Her細胞Akt蛋白磷酸化，10 μmol/L的PI3K/Akt信號通路抑制劑可同時抑制Hs578T和Hs-Her細胞的Akt蛋白磷酸化。見圖2。

表1 不同濃度帕妥珠單抗對Hs578T和Hs-Her細胞增殖抑制率的影響

與Hs578T比較：1)P<0.01

1：空白對照；2：10 mg/L的帕妥珠單抗處理24 h；3：10 μmol/L的PI3K/Akt抑制劑處理6 h；4：10 μmol/L的PI3K/Akt抑制劑處理6 h后再用10 mg/L的帕妥珠單抗處理24 h圖2 PI3K/Akt抑制劑和帕妥珠單抗處理后Hs578T、Hs-Her中P-Akt蛋白表達情況

3 討 論

PI3K/Akt信號通路在細胞增殖中發(fā)揮重要調(diào)控作用，可誘導(dǎo)細胞增殖、分化，抑制細胞凋亡，是細胞惡性生物學(xué)特征的主要發(fā)生機制之一〔5〕。帕妥珠單抗藥效作用的一個重要機制未抑制Her-PI3K-Akt通路的傳導(dǎo)，與Her結(jié)合后可抑制其磷酸化，感染PI3Kp85調(diào)節(jié)亞單位形成，抑制PI3K激活，進而下調(diào)細胞周期蛋白，誘導(dǎo)癌細胞凋亡〔6〕。但同時還存在表皮生長因子(EGF)、胰島素樣生長因子(IGF)-1等多種細胞因子可活化Akt，導(dǎo)致帕妥珠單抗耐藥菌株可能存在Akt持續(xù)活化現(xiàn)象，是帕妥珠單抗耐藥的可能原因之一〔7〕。

帕妥珠單抗耐藥細胞Akt蛋白磷酸化活化，通過PI3K/Akt特異性抑制劑下調(diào)耐藥細胞PI3K/Akt活性，證實了帕妥珠單抗抑制了Hs578T的Akt蛋白磷酸化，但無法抑制耐藥亞株Hs-Her的Akt蛋白磷酸化。而PI3K/Akt特異性抑制劑可同時抑制Hs578T和Hs-Her細胞的Akt蛋白磷酸化。進一步闡明了PI3K/Akt特異性抑制劑下調(diào)該信號通路活性后，可逆轉(zhuǎn)帕妥珠單抗耐藥乳腺癌細胞對該藥物的抵抗作用。

1林哲洙，張 紅，張 磊，等.TRAIL-R4特異性單克隆抗體聯(lián)合衣霉素促進人乳腺癌細胞凋亡〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2015；35(19)：5433-5.

2張煒煜，楊修軍，王 博，等.吉林省238株耐多藥結(jié)核分枝桿菌藥敏結(jié)果分析〔J〕.中國衛(wèi)生工程學(xué)，2015；14(6)：540-1.

3李弘夏，謝智欽，杜立陽，等.基于HSP27的乳腺癌干細胞靶向治療研究進展〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2014；34(2)：561-3.

4Narayan M，Wilken JA，Harris LN，etal.Trastuzumab-induced HER reprogramming in resistant breast carcinoma cells 〔J〕.Cancer Res，2009；69(6)：2191-4.

5李 振，周愛軍，孫書峰，等.乳腺癌四個分子亞型與腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性研究〔J〕.北華大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2015；16(3)：338-41.

6張霄蓓.乳腺癌干細胞對靶向治療、化療及內(nèi)分泌治療藥物的敏感性研究〔D〕.天津：天津醫(yī)科大學(xué)，2012.

7王建麗.驅(qū)動蛋白Kif2a在乳腺癌中表達的臨床意義及功能研究〔D〕.濟南：山東大學(xué)，2011.

湖北省教育廳科學(xué)研究計劃指導(dǎo)性項目(B2015471-2)

蘇坤華(1972-)，男，主管藥師，主要從事藥學(xué)研究。

R39

A

1005-9202(2017)20-5001-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.20.020

〔2017-05-11修回〕

(編輯 李相軍/滕欣航)