郭連英 張 婷 黃 琳 張 雪 劉花麗 于向洋 王慧娟 高瑞芳 李發(fā)勝 曹 靖

(大連醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)與病理生理學(xué)，遼寧 大連 116044)

1 大連醫(yī)科大學(xué)麻醉學(xué)院

Hca-F抗原-HSP70BCG疫苗免疫對(duì)小鼠肝癌Hca-F的免疫保護(hù)效應(yīng)

郭連英 張 婷 黃 琳 張 雪1劉花麗1于向洋1王慧娟1高瑞芳1李發(fā)勝 曹 靖

(大連醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)與病理生理學(xué)，遼寧 大連 116044)

目的探討化學(xué)交聯(lián)法構(gòu)建的Hca-F抗原-卡介苗熱休克蛋白70(HSP70BCG)復(fù)合物對(duì)Hca-F肝癌的主動(dòng)免疫保護(hù)效應(yīng)及其機(jī)制。方法采用ADP親和層析方法提取HSP70BCG，超速離心法提取粗制腫瘤抗原，采用化學(xué)連接法或加入ADP構(gòu)建Hca-F抗原-HSP70BCG復(fù)合物，免疫正常小鼠，3次后檢測(cè)對(duì)Hca-F攻擊的主動(dòng)免疫保化效應(yīng)，用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)Hca-F刺激下的脾細(xì)胞增殖反應(yīng)，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)脾細(xì)胞表型的變化。結(jié)果化學(xué)交聯(lián)法和加入ADP構(gòu)建的Hca-F抗原-HSP70BCG復(fù)合物免疫可延長(zhǎng)小鼠的存活時(shí)間，增強(qiáng)脾細(xì)胞對(duì)抗原刺激的應(yīng)答能力和細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒活性、提高γδT細(xì)胞的百分率。結(jié)論Hca-F抗原-HSP70BCG復(fù)合物免疫可誘導(dǎo)抗瘤免疫保護(hù)效應(yīng)。

腫瘤疫苗；卡介苗；熱休克蛋白；免疫保護(hù)效應(yīng)

熱休克蛋白(HSPs)表達(dá)增加能增加細(xì)胞對(duì)有害刺激的抵抗能力，是存在于從原核細(xì)胞到真核細(xì)胞的一種普遍的共同防御機(jī)制〔1〕。HSPs-肽復(fù)合物還具有提呈抗原等免疫學(xué)作用〔2〕。從腫瘤細(xì)胞中提取的HSPs-肽復(fù)合物具有腫瘤特異性抗原的作用，可誘導(dǎo)較強(qiáng)的抗腫瘤免疫應(yīng)答，從腫瘤細(xì)胞中提取的HSPs-肽復(fù)合物作為腫瘤疫苗的可能性日益受到重視。但腫瘤細(xì)胞中具有腫瘤抗原作用的HSPs-肽復(fù)合物量少，而手術(shù)切除的腫瘤組織量也不可能很多，從病人自體腫瘤提取HSPs-肽復(fù)合物作為腫瘤疫苗嚴(yán)重受限。本研究探討Hca-F抗原卡介苗熱休克蛋白(HSP70BCG)免疫對(duì)小鼠肝癌Hca-F的免疫保護(hù)效應(yīng)及其作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與瘤株 Balb/c小鼠(H-2d)，8～12周齡，體重20～24 g，雌雄各半。L929(H-2k)為小鼠成纖維瘤細(xì)胞系，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所張友會(huì)教授惠贈(zèng)，Hca-F為小鼠腹水型肝癌H22(H-2)的高淋巴道轉(zhuǎn)移亞系，由本校病理學(xué)教研室凌茂英教授惠贈(zèng)。

1.2主要藥品與儀器 噻唑藍(lán)(MTT，F(xiàn)luca，瑞士)，異硫氰酸熒光素(FITC)大鼠抗小鼠CD4、CD8a單克隆抗體和FITC-羊抗小鼠γδ單克隆抗體(Pharmingen，USA)，多孔酶標(biāo)測(cè)定儀(Clin-Bio 120c)，流式細(xì)胞儀(Coulter Epics XL，USA)。

1.3Hca-F抗原-HSP70BCG疫苗制備 無(wú)菌取Hca-F腹水，低滲法破壞紅細(xì)胞離心制成瘤細(xì)胞懸液，調(diào)細(xì)胞濃度至1×108/ml，用電動(dòng)勻漿器研磨制成細(xì)胞勻漿，100 000 r/min離心取上清組分作為粗制腫瘤抗原。超聲碎BCG菌、超速離心后取上清，用ADP親和層析法〔3〕分離HSP70 BCG，提取物經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳鑒定。分別用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量后調(diào)整到所需濃度后，按比例將兩類成分混合，加入化學(xué)交連劑或ADP使之相互作用形成結(jié)(復(fù))合物用于實(shí)驗(yàn)中。

1.4體內(nèi)Hca-F抗原-HSP70BCG疫苗免疫 健康Balb/C小鼠隨機(jī)分成五組，分別于第0、7、14天皮下注射磷酸鹽緩沖液(PBS)、Hca-F溶解物、HSP70BCG、Hca-F 抗原-HSP70BCG(CL)和Hca-F 抗原-HSP70BCG(ADP)，末次免疫后10 d用有活性Hca-F細(xì)胞(2×106/ml/只)攻擊，觀察小鼠存活時(shí)間，觀察60 d；或腹腔注射多聚甲醛固定的Hca-F細(xì)胞，3 d后活殺小鼠，取脾細(xì)胞測(cè)定增殖活性、細(xì)胞毒活性和細(xì)胞表型。

1.5細(xì)胞增殖與細(xì)胞毒性試驗(yàn) 均采用MTT法。無(wú)菌取小鼠脾臟制備脾細(xì)胞懸液，低滲法破紅細(xì)胞后調(diào)細(xì)胞濃度至4×106/ml，取100 μl加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(CORNING，USA)。細(xì)胞增殖試驗(yàn)時(shí)向96孔板中加入Hca-F溶解物、HSP70BCG、Hca-F抗原-HSP70BCG(CL)和Hca-F抗原-HSP70BCG(ADP)，對(duì)照孔中加入1640全培基，ConA作為陽(yáng)性對(duì)照，5% CO2、37℃培養(yǎng)72 h；細(xì)胞毒試驗(yàn)時(shí)向96孔培養(yǎng)板中加入Hca-F或L929細(xì)胞，每孔100 μl，濃度為2×105/ml，培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)結(jié)束前4 h加MTT(5 μg/ml)20 μl，于570 nm測(cè)光密度值。

1.6細(xì)胞表型測(cè)定 取小鼠脾細(xì)胞1×106個(gè)，加入FITC標(biāo)記的單抗，4℃溫育20 min，用PBS洗3次后用染色固定液固定后，流式細(xì)胞儀測(cè)定。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS16.0軟件行方差分析和t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1Hca-F 抗原-HSP70BCG免疫對(duì)Hca-F的免疫保護(hù)效應(yīng) 與攻擊對(duì)照組〔(25.9±4.2)d〕相比，單用Hca-F溶解物免疫并不能延長(zhǎng)小鼠的存活時(shí)間〔(26.5±4.6)d〕，HSP70BCG免疫小鼠存活時(shí)間〔(39.3±4.6)d〕有所延長(zhǎng)，但無(wú)1只小鼠能長(zhǎng)期存活，用兩種Hca-F 抗原-HSP70BCG免疫的小鼠分別有3/8和2/8長(zhǎng)期存活，平均存活時(shí)間〔(36.3±3.3)d，(29.5±2.8)d〕也有所延長(zhǎng)。

2.2體內(nèi)預(yù)刺激小鼠脾細(xì)胞對(duì)體外Hca-F抗原-HSP70BCG再刺激的增殖反應(yīng) Hca-F抗原-HSP70BCG免疫小鼠脾細(xì)胞不僅對(duì)體內(nèi)免疫物再刺激發(fā)生增殖反應(yīng),對(duì)多聚甲醛固定的Hca-F(PF fixed Hca-F)的再刺激也發(fā)生了較強(qiáng)的增殖反應(yīng)。見(jiàn)表1。

2.3免疫小鼠的脾細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用 HSP70BCG、Hca-F抗原-HSP70BCG(化) Hca-F抗原-HSP70BCG(ADP)免疫小鼠的脾細(xì)胞對(duì)Hca-F和L929兩種靶細(xì)胞的細(xì)胞毒活性都增強(qiáng)，與注射PBS的對(duì)照小鼠脾細(xì)胞相比差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05 或P<0.01)。見(jiàn)表2。

2.4免疫小鼠脾細(xì)胞表型的變化 注射PBS的對(duì)照小鼠和Hca-F 溶解物免疫的小鼠脾細(xì)胞中γδT的百分率比較低，HSP70BCG 免疫后γδT細(xì)胞百分率增加，Hca-F抗原-HSP70BCG(CL)和 Hca-F抗原-HSP70BCG(ADP)免疫后γδT 細(xì)胞百分率也增加，而CD4和 CD8a百分率變化不大。見(jiàn)表3。

表1 小鼠脾細(xì)胞對(duì)刺激的免疫增殖反應(yīng)(OD750值)

與對(duì)照組比較：1)P<0.05，P<0.01；下表同

表2 小鼠脾細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性

表3 小鼠脾細(xì)胞表型的變化(%)

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，用Hca-F抗原-HSP70BCG(CL)和Hca-F抗原-HSP70BCG(ADP)免疫正常小鼠，對(duì)Hca-F的攻擊有較明顯的主動(dòng)免疫保護(hù)效應(yīng)，優(yōu)于 HSP70BCG 和Hca-F 溶解物(含腫瘤抗原)單用的效果，提示將腫瘤抗原與HSP70BCG連接形成復(fù)/結(jié)合物可用做腫瘤疫苗用于腫瘤的主動(dòng)特異性免疫治療；向反應(yīng)體系中加入化學(xué)連接劑使腫瘤抗原和HSP70BCG通過(guò)共價(jià)鍵或其他力連接形成結(jié)合物(Tumor antigens-HSP70BCG conjugates)，或者根據(jù)熱休克蛋白與蛋白質(zhì)/多肽結(jié)合與解離的特性(如向反應(yīng)體系中加ADP)制備腫瘤抗原-HSP70BCG復(fù)合物(Tumor antigens-HSP70BCG complexes)都是可行的辦法〔4〕。

癌癥患者針對(duì)自身癌細(xì)胞的T細(xì)胞已經(jīng)鑒定出許多腫瘤抗原。其中有些腫瘤抗原表位已被用于制備腫瘤疫苗或用于沖激樹(shù)突細(xì)胞(DC)制備DC腫瘤疫苗〔5〕，但上述腫瘤抗原中大多數(shù)都是通過(guò)T細(xì)胞受體(TCR)-MHC/抗原肽三元體相互作用機(jī)制啟動(dòng)免疫應(yīng)答的，TCR、MHC分子的高度多肽性將限制這些腫瘤抗原的應(yīng)用腫瘤抗原免疫原性弱和(或)機(jī)體對(duì)它們的免疫耐受等也影響腫瘤抗原的免疫效果〔6〕。HSPS是一組進(jìn)化上高度保守的蛋白質(zhì)，HSPs-肽復(fù)合物可通過(guò)多種機(jī)制與免疫系統(tǒng)相互作用，在細(xì)胞內(nèi)HSPs攜帶抗原肽到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與MHC分子裝配形成MHC-抗原肽復(fù)合物，外源性也有多種免疫學(xué)作用，HSPs是病原微生物的重要抗原之一，可為宿主免疫系統(tǒng)所識(shí)別，如γδT細(xì)胞可識(shí)別感染后產(chǎn)生或表達(dá)于受感染細(xì)胞表面的HSPs〔7〕。HSP96與不成熟DC表面的CD91結(jié)合誘導(dǎo)其活化與成熟，可能成為一種較為有用的抗原表位攜帶體〔8〕。BCG早已廣泛用于結(jié)核病〔9〕的預(yù)防和腫瘤〔10〕的非特異性免疫治療，因而優(yōu)于其他微生物來(lái)源的HSPS。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明HSP70BCG與腫瘤抗原形成結(jié)(復(fù))合物后不論是主動(dòng)免疫保護(hù)效應(yīng)還是誘導(dǎo)脾細(xì)胞活化和介導(dǎo)細(xì)胞毒作用都有所增強(qiáng)，γδT細(xì)胞百分率增加，提示HSP70BCG具有抗原載體和佐劑的作用，可用于制備腫瘤抗原疫。

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國(guó)家質(zhì)檢總局基金(2013K228)

曹 靖(1963-)，女，碩士，副教授，主要從事抗腫瘤研究。

郭連英(1962-)，女，實(shí)驗(yàn)師，主要從事腫瘤生物治療研究。

R392.9

A

1005-9202(2017)20-4995-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.20.017

〔2017-03-11修回〕

(編輯 袁左鳴)