韓宇鵬 鮑秀琦 顏 玉 陳 剛 邱 冰 吳 宇 王 雪 姜 威

(佳木斯大學附屬第一醫(yī)院， 黑龍江 佳木斯 154007)

大鼠骨髓單核細胞移植對潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠的修復(fù)作用

韓宇鵬 鮑秀琦 顏 玉 陳 剛 邱 冰 吳 宇 王 雪 姜 威

(佳木斯大學附屬第一醫(yī)院， 黑龍江 佳木斯 154007)

目的探討骨髓單核細胞(BM-MNCs)移植對潰瘍性結(jié)腸炎(UC)的修復(fù)作用。方法將標記的異體大鼠BM-MNCs移植到大鼠UC模型內(nèi)，觀察大鼠的精神、進食、活動、大便情況及體重變化，結(jié)腸大體形態(tài)，黏膜組織損傷的情況。結(jié)果移植7 d后大鼠的一般情況、體重、排便情況明顯優(yōu)于磷酸鹽緩沖液(PBS)組；大鼠結(jié)腸組織大體及光鏡觀察，移植后3 d及7 d，移植組與PBS組結(jié)腸大體標本無明顯差別，移植后14 d，移植組結(jié)腸大體標本可見黏膜充血、水腫、糜爛、無明顯潰瘍；熒光顯微鏡觀察，移植14 d的大鼠結(jié)腸組織中均可觀察到DAPI標記的BM-MNCs細胞。結(jié)論BM-MNCs移植可以促進大鼠UC模型損傷結(jié)腸組織的修復(fù)。

骨髓單個核細胞；移植；潰瘍性結(jié)腸炎

目前，潰瘍性結(jié)腸炎(UC)的治療方法主要有藥物誘導(dǎo)緩解、藥物維持及外科手術(shù)，但具有一定的副作用和并發(fā)癥。骨髓單個核細胞(BM-MNCs)是成體組織干細胞，不僅具有組織的自我更新和細胞的定向分化潛能，又能產(chǎn)生一些可促進神經(jīng)、血管再生的細胞因子，包括造血干細胞、骨髓間充質(zhì)干細胞和內(nèi)皮祖細胞等〔1〕。近年來，大量的實驗研究〔2～12〕結(jié)果表明BM-MNCs可借助于受損部位的細胞因子、黏附因子等的趨化作用，向病變部位遷移，實現(xiàn)其向損傷組織的定植和歸巢。本實驗旨在研究BM-MNCs的培養(yǎng)及BM-MNCs對UC的治療效果。

1 材料與方法

1.1材料 清潔級健康成年雄性SD大鼠54只，體重(250±10)g，6～8周齡，購自哈爾濱醫(yī)科大學實驗動物學部；三硝基苯磺酸、弗氏完全佐劑均購自美國sigma公司；水合氯醛購自天津大茂化學制劑廠；DAPI購自北京華邁科世紀公司。

1.2方法

1.2.1分組 36只大鼠采用免疫復(fù)合法制備UC模型后，隨機分為BM-MNCs移植組及磷酸鹽緩沖液(PBS)組，每組18只，余18只用于提取BM-MNCs。

1.2.2制備家兔結(jié)腸黏膜抗原 剝離家兔的結(jié)腸并分離黏膜層，加入十二烷基硫酸鈉(SDS)裂解液，低溫研磨黏膜層組織成組織勻漿液， 95℃作用5 min，可將蛋白酶從組織勻漿液中去除，4℃，15 000 r/min離心10 min后，留取上清液轉(zhuǎn)入透析袋中，為了去除上清液中SDS，將透析袋逐步浸入梯度濃度的生理鹽水中。采用雙縮脲法測定蛋白后，取蛋白含量為20 mg/ml上清液與等體積弗氏完全佐劑充分混合，制備家兔抗原乳化液備用。

1.2.3提取BM-MNCs 緩慢腹腔注射10%水合氯醛溶液，麻醉SD大鼠，待其完全麻醉后用剪刀將腿部皮膚備皮，浸入75%酒精，消毒3～5 min。清除肌肉、筋膜后充分暴露股骨和脛骨并取出關(guān)節(jié)，分離股骨和脛骨兩端骨皮質(zhì)并在骨骺處注入5 ml抗凝液，反復(fù)沖洗骨髓腔，收集骨髓液至離心管中，4℃，1 500 r/min離心10 min，棄去上清液，沉淀中加入2 ml PBS液后充分渦旋混合，重復(fù)低溫離心。將骨髓液緩慢傾覆于等體積的淋巴細胞分離液上層，混合液4℃，2 000 r/min離心15 min，棄除上清液，留取白色細胞層4℃保存。

1.2.4DAPI標記BM-MNCs 用含DAPI(終濃度為50 μg/ml)的DIEM培養(yǎng)基重懸細胞，于含5%CO2飽和濕度、37℃培養(yǎng)箱中染色2 h，收集細胞并計數(shù)。

1.2.5制備UC模型及BM-MNCs靜脈移植 第1、14天時，將0.4 ml抗原乳化劑充分渦旋，混勻后緩慢注射大鼠腹股溝及足跖處，且末次注射后24 h內(nèi)需要給予大鼠禁食但不禁水，緩慢腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉，將硅膠管(直徑0.2 cm×長度15 cm)液體石蠟潤滑，輕柔插入肛門內(nèi)約8 cm，然后緩慢推注含有100 mg TNBS/kg+50%乙醇的灌注液，灌注后不僅保持身體平躺且臀部要抬高至自然清醒。UC模型成模24 h后，分別給予移植組大鼠經(jīng)尾靜脈注射1 ml BM-MNCs細胞懸液(3×106個/ml)；PBS組注入相同體積的PBS溶液。

1.2.6觀察一般情況 UC大鼠移植BM-MNCs后，進行常規(guī)飼養(yǎng)，溫度與濕度均適宜，每天觀察各組大鼠的精神狀態(tài)、食欲和食量情況、日?；顒印⒚l(fā)光澤度、大便次數(shù)和性狀等情況并記錄。分別于移植后的3、7、14 d每組隨機抽取6只大鼠麻醉后處死，剖取其結(jié)腸并小心縱行剪開，經(jīng)PBS沖洗干凈后，觀察大鼠的結(jié)腸組織的組織學和病理學變化和結(jié)腸表面黏膜層的損傷情況。

1.2.7熒光顯微鏡觀察BM-MNCs分布 避光取已固定的移植組結(jié)腸組織塊經(jīng)冰凍切片包埋劑包埋后制作冰凍切片(20 μm)。部分切片待風干后加熒光淬滅劑，封片。熒光顯微鏡下觀察結(jié)腸組織中并拍照，細胞核呈藍色熒光，即為DAPI標記的BM-MNCs。

1.3統(tǒng)計學方法 應(yīng)用SPSS21.0軟件行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1一般情況 兩組大鼠于造模1 d后，均開始出現(xiàn)食欲不振甚至厭食，背部拱起活動減少，肛門處可見暗紅色、黑色黏稠樣稀便，體重減輕。造模3 d后，出現(xiàn)UC的典型臨床癥狀，大鼠形體消瘦，表情淡漠精神不振，毛發(fā)枯干無光亮，懶動，大便次數(shù)減少，褐色伴有膿汁為黏稠樣的稀便，有腥惡臭味，體重減輕明顯。移植組大鼠7 d后，一般狀況有所改善，精神活動狀態(tài)有好轉(zhuǎn)，食欲漸強及體質(zhì)量增加，但肛周仍有少量的稀樣便；PBS組臨床癥狀無變化，但腹圍增加，體重減輕。移植后的第6天有1只SD大鼠死亡。移植組大鼠14 d后，一般精神活動狀態(tài)良好，喜動、毛色有光澤，進食量和體質(zhì)量明顯增加，仍排有稀便但無膿血；PBS組大鼠進食量較前稍有增加，其他癥狀改善不明顯，腹圍明顯增大，體質(zhì)量略有增加。 其中有1只SD大鼠在移植后9 d死亡。經(jīng)過BM-MNCs移植治療后，兩組大鼠體質(zhì)量變化百分比有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

2.2結(jié)腸黏膜組織形態(tài)學觀察 移植3 d后，兩組大鼠結(jié)腸回盲部結(jié)腸擴張，距離肛周13 cm內(nèi)的結(jié)腸黏膜有廣泛的腫脹充血、組織糜爛甚至壞死，同時還可見直徑0.5～1 cm的潰瘍灶存在。移植7 d后，兩組大鼠均表現(xiàn)結(jié)腸回盲部的管腔較前明顯擴張，結(jié)腸在距離肛周7～11 cm處與腸壁明顯增厚，皺襞消失，質(zhì)地脆，和周圍的組織可形成明顯的組織粘連及包裹，結(jié)腸的黏膜層出現(xiàn)廣泛的水腫、充血、組織糜爛和壞死等病變，并可見不同程度的潰瘍。移植14 d后，移植組大鼠表現(xiàn)為結(jié)腸回盲部的管腔稍有縮窄，腸組織與周圍組織粘連不明顯，但結(jié)腸的黏膜層仍有水腫、充血，組織糜爛、未見明顯潰瘍，并可見局部瘢痕增生；PBS組大鼠回盲部的結(jié)腸管腔表現(xiàn)明顯擴張，部分可見巨結(jié)腸，結(jié)腸在距離肛周7～13 cm處與周圍的組織形成廣泛的粘連、包裹，結(jié)腸黏膜層廣泛而明顯的水腫、充血、組織糜爛及壞死。見圖1。

表1 兩組移植后大鼠體重變化

與PBS組比較：1)P<0.05

圖1 大鼠結(jié)腸黏膜形態(tài)學觀察(×10)

2.3BM-MNCs在大鼠結(jié)腸分布 DAPI標記細胞的細胞核呈藍綠色熒光，觀察在移植后14 d組的大鼠結(jié)腸組織中可見，被標記的細胞主要分布在結(jié)腸黏膜層及黏膜下層，而肌層未見分布。見圖2。

圖2 移植14 d后DAPI標記的BM-MNCs在大鼠結(jié)腸分布(×100)

3 討 論

UC是由遺傳、環(huán)境、免疫調(diào)節(jié)間復(fù)雜的相互作用等多個因素共同導(dǎo)致、嚴重威脅病人健康的炎癥性腸病(IBD)。傳統(tǒng)的UC治療一直是醫(yī)學的難題之一〔2〕。

本實驗成功在大鼠體內(nèi)提取了BM-MNCs，其成活率可達95%，熒光顯微鏡觀察，結(jié)果與Hayashi等〔5〕與和Wei等〔13〕的研究結(jié)果一致，表明BM-MNCs細胞可遷移和定植于損傷的結(jié)腸組織中。本實驗顯示在移植初期，BM-MNCs移植組大鼠的體重會出現(xiàn)短暫降低，隨后體重逐漸恢復(fù)；而PBS組大鼠的體重呈持續(xù)、急劇降低，結(jié)果與Hayashi等〔5〕通過BMSCs移植治療UC大鼠的實驗結(jié)果相一致。

雖然BM-MNCs移植療法治療UC效果顯著，較傳統(tǒng)治療手段有著明顯的優(yōu)越性，但是目前BM-MNCs移植對IBD的治療還處于理論研究和臨床試驗階段。

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13Wei YM,Nie YQ,Lai JY.etal.Comparison of the population caopacity of hematopoietic and mesenchymal stem cells in experimental colitis rat model〔J〕.Transplantation,2009;88(1):42-8.

黑龍江省自然科學基金項目(H201367)；黑龍江省衛(wèi)生廳科研項目(2013245)；黑龍江省大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(201610222023)

姜 威(1977-)，男，副主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事潰瘍性結(jié)腸炎的基礎(chǔ)與臨床研究。

韓宇鵬(1982-)，男，主治醫(yī)師，碩士，主要從事潰瘍性結(jié)腸炎的臨床研究。

R574

A

1005-9202(2017)20-4992-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.20.016

〔2017-03-22修回〕

(編輯 滕欣航)