林曉萌 陳鵲汀 韓倩倩 張 英 丁琪瓊 張 剛 郝 鑫 李 中

(河北大學(xué)附屬醫(yī)院乳腺外科，河北 保定 071000)

1 北京協(xié)和醫(yī)院臨床與藥理中心 2 河北大學(xué)附屬醫(yī)院胃腸外科

3 河北大學(xué)附屬醫(yī)院 河北省腫瘤放化療機(jī)制與規(guī)程研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

納米活性炭聯(lián)合吲哚菁綠定位前哨淋巴結(jié)的效果

林曉萌 陳鵲汀 韓倩倩 張 英 丁琪瓊1張 剛2郝 鑫3李 中

(河北大學(xué)附屬醫(yī)院乳腺外科，河北 保定 071000)

目的探討納米活性炭聯(lián)合吲哚菁綠定位前哨淋巴結(jié)的效果。方法示蹤效果實(shí)驗(yàn)：動(dòng)物分為ICG組、ICG+ACNP組。ICG組于右后肢足蹼內(nèi)注射濃度為20 μg/ml的ICG溶液10 μl，ICG+ACNP組于右后肢足蹼內(nèi)注射濃度為20 μg/ml的ICG與ACNP的混懸液10 μl。注射后5、15、30、60 min分別觀察腘窩淋巴結(jié)的顯影成像情況并檢測(cè)熒光強(qiáng)度。肝腎毒性觀察實(shí)驗(yàn)：小鼠分為ICG組、 ICG+ACNP組、正常對(duì)照組(右后肢足蹼內(nèi)注射等量生理鹽水)，飼養(yǎng)2 w后，觀察血常規(guī)〔白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(RBC)、血小板計(jì)數(shù)(PLT)〕、肝功能〔谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、總膽紅素(TBIL)〕、腎功能〔尿素(Urea)、肌酐(Crea)〕等指標(biāo)的變化。結(jié)果ICG溶液的熒光強(qiáng)度與ICG+ACNP混懸液的發(fā)光強(qiáng)度比較無(wú)顯著性差異；注射后5、15、30 min，兩組無(wú)顯著性差異；60 min的時(shí)間點(diǎn)，ICG組的熒光劑發(fā)生轉(zhuǎn)移，熒光強(qiáng)度減弱，與ICG+ACNP組比較有明顯差異。兩組與正常對(duì)照組比較，血常規(guī)、肝功能、腎功能等指標(biāo)無(wú)顯著差異。結(jié)論納米碳聯(lián)合吲哚菁綠定位前哨淋巴結(jié)不容易發(fā)生次級(jí)引流，安全，可行性高。

納米活性炭；吲哚菁綠；前哨淋巴結(jié)

乳腺癌的治療方案目前有局部治療和全身治療兩種，但無(wú)論哪種方法，乳腺癌的診斷及分期都非常重要。在手術(shù)治療方面，腘窩淋巴結(jié)清掃是治療中的重要組成，對(duì)其預(yù)后有十分重要的影響〔1，2〕。腘窩在解剖結(jié)構(gòu)上不僅有著豐富的血管、神經(jīng)，也有大量的淋巴組織，淋巴清掃過(guò)程出現(xiàn)任何誤差都可能對(duì)預(yù)后造成影響。目前，臨床上對(duì)乳腺癌前哨淋巴結(jié)進(jìn)行示蹤定位活檢的方法主要有染料法、核素法以及綜合法〔3，4〕，這三種方法各有其利弊。近年提出的熒光法是前哨淋巴結(jié)示蹤的新方法，具有更高的檢出率，其中吲哚菁綠(ICG)已經(jīng)應(yīng)用于臨床，但由于ICG量子域較低、粒徑太小，導(dǎo)致其熒光信號(hào)持續(xù)時(shí)間不長(zhǎng)，且容易通過(guò)淋巴結(jié)進(jìn)入血液循環(huán)而代謝。在染料法中，納米活性炭(ACNP)是一種能長(zhǎng)時(shí)間停留在淋巴結(jié)且具有趨向性的示蹤染料。本研究探討ACNP聯(lián)合吲哚菁綠ICG定位前哨淋巴結(jié)的效果及毒副作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)BALB/C小鼠，雄性，2月齡，體重18～22 g，共64只，購(gòu)自河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào) SYXK(冀)2012-0022。BALB/C小鼠飼養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF實(shí)驗(yàn)室，室內(nèi)溫度20℃～26℃、相對(duì)濕度45%～70%，晝夜各12 h。動(dòng)物自由攝食飲水，其余飼養(yǎng)條件均符合中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB14925-2010中的規(guī)定。所有動(dòng)物試驗(yàn)過(guò)程均通過(guò)動(dòng)物保護(hù)委員會(huì)倫理學(xué)審查。

1.2試劑與儀器 吲哚菁綠(ICG)，丹東醫(yī)創(chuàng)藥業(yè)有限責(zé)任公 司；納米活性炭(40 nm粒徑)，北京德科島金科技有限公司;聚乙烯吡咯烷酮(PVP-K30)德國(guó)BASF公司；活體成像系統(tǒng)IVIS Lumina Ⅱ，美國(guó)Caliper Life Sciences公司；MB2140-IC微量分析天平，德國(guó)Sigma-Aldrich公司。

1.3實(shí)驗(yàn)前淋巴結(jié)的確認(rèn) 參考文獻(xiàn)方法對(duì)小鼠淋巴結(jié)在解剖學(xué)上的命名定位標(biāo)準(zhǔn)〔5〕，采用聯(lián)合法對(duì)10只小鼠的淋巴結(jié)進(jìn)行定位，解剖腘窩及后續(xù)引流淋巴結(jié)。采用染料法輔助，辨認(rèn)出腘淋巴結(jié)、髂淋巴結(jié)和腎旁淋巴結(jié)。并根據(jù)本實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，區(qū)別前哨淋巴結(jié)以腘窩淋巴結(jié)作為指示，次級(jí)淋巴結(jié)以髂淋巴結(jié)作為指示，第3級(jí)淋巴結(jié)以腎旁淋巴結(jié)為指示。

1.4示蹤效果檢測(cè) 將24只BALB/C小鼠隨機(jī)分為ICG組、ICG+ACNP組，每組12只。腹腔注射3%戊巴比妥進(jìn)行麻醉，以8%硫化鈉脫去右后肢及腹部被毛。ICG組于右后肢足蹼內(nèi)注射濃度為20 μg/ml的ICG溶液10 μl，ICG+ACNP組于右后肢足蹼內(nèi)注射濃度為20 μg/ml的ICG與ACNP的混懸液10 μl，ICG與ACNP的比例為1∶4。所有動(dòng)物均在注射后5、15、30、60 min，取仰臥位于活體成像儀中分別觀察腘窩淋巴結(jié)的顯影成像情況。采用Living Image 3.1軟件檢測(cè)熒光強(qiáng)度，曝光時(shí)間為60 s。

1.5肝腎毒性觀察 取未經(jīng)處理的小鼠分為ICG組，ICG+ACNP組，正常對(duì)照組，每組10只。ICG組于右后肢足蹼內(nèi)注射濃度為20 μg/ml的ICG溶液10 μl，ICG+ACNP組于右后肢足蹼內(nèi)注射濃度為20 μg/ml的ICG與ACNP的混懸液10 μl，ICG與ACNP的比例為1∶4。正常對(duì)照組于右后肢足蹼注射等量生理鹽水，同樣飼養(yǎng)2 w。觀察血常規(guī)、肝功能、腎功能指標(biāo)的變化。

2 結(jié) 果

2.1ICG與ICG+ACNP的熒光強(qiáng)度比較 ICG組熒光強(qiáng)度〔(7.873±0.102)×109〕與ICG+ACNP組發(fā)光強(qiáng)度〔(7.982±0.914)×109〕比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2兩組小鼠不同時(shí)間熒光強(qiáng)度比較 在5、15、30 min時(shí)間點(diǎn)，兩組熒光強(qiáng)度無(wú)顯著性差異(P>0.05)，60 min的時(shí)間點(diǎn)，ICG組的熒光強(qiáng)度減弱，比ICG+ACNP組明顯降低(P<0.05)，見(jiàn)表1。

2.3兩組小鼠體內(nèi)不同時(shí)間熒光成像比較 在60 min時(shí)，兩組小鼠右側(cè)髂內(nèi)側(cè)淋巴結(jié)信號(hào)出現(xiàn)差異，ICG組出現(xiàn)ICG向第2級(jí)淋巴結(jié)流動(dòng)的情況。見(jiàn)圖1。

2.4ICG與ICG+ACNP對(duì)血常規(guī)及肝腎功能的影響 兩組白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(RBC)、血小板計(jì)數(shù)(PLT)，與正常對(duì)照組比較無(wú)明顯差異；兩組谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、總膽紅素(TBIL)、尿素(Urea)、肌酐(Crea)與正常對(duì)照組比較也無(wú)明顯差異。見(jiàn)表2。

表1 兩組不同時(shí)間熒光強(qiáng)度比較

與ICG組比較：1)P<0.05

圖1 ICG與ICG+ACNP在小鼠體內(nèi)不同時(shí)間熒光成像比較

組別WBC(×109/L)RBC(×1012/L)PLT(×109/L)ALT(U/L)TBIL(μmol/L)Urea(mmol/L)Crea(pmol/L)TCG組334±021473±02363221±22173185±3221200±242564±1336703±624TCG+ACNP組328±020412±01663033±15673143±4011189±179601±1026659±566正常對(duì)照組320±013478±01462510±19813076±4481223±231547±0876823±754

3 討 論

ICG已經(jīng)獲得FDA用于臨床試驗(yàn)的批準(zhǔn)，目前在臨床上多用于檢測(cè)心血管系統(tǒng)及肝功能，并作為檢測(cè)后葡萄膜炎、視網(wǎng)膜炎等的造影劑。目前的文獻(xiàn)已有報(bào)道將ICG用于、乳腺癌〔6〕、皮膚癌〔7，8〕、胃腸癌〔9～11〕及黑色素瘤〔12〕的前哨淋巴結(jié)活檢(SLNB)示蹤定位活檢的研究及臨床應(yīng)用中，并取得良好的效果。前哨淋巴結(jié)是腫瘤淋巴引流的第一站淋巴結(jié)，對(duì)于腫瘤轉(zhuǎn)移的研究尤為重要，其輸入管直接連接著腫瘤原發(fā)部位。腘窩淋巴結(jié)解剖結(jié)構(gòu)復(fù)雜，有著豐富的神經(jīng)、血管以及大量的淋巴管連接著淋巴結(jié)或原發(fā)腫瘤部位，如定位不清，在進(jìn)行淋巴結(jié)清掃時(shí)容易對(duì)周圍神經(jīng)血管造成損傷從而增加并發(fā)癥的發(fā)生。熒光法雖然是近年來(lái)新興的方法，但因其出色的檢出率以及對(duì)機(jī)體的低損害性受到關(guān)注。熒光材料進(jìn)入乳腺癌原發(fā)部位及其周圍組織后，被吸收進(jìn)入淋巴系統(tǒng)并停留其中，通過(guò)儀器可見(jiàn)熒光顯示成像，從而定位前哨淋巴結(jié)，為乳腺癌外科手術(shù)中進(jìn)行淋巴結(jié)清掃提供幫助。

ICG初期由于突出的檢出率而受到青睞，但由于ICG量子域較低且粒徑小導(dǎo)致其在淋巴結(jié)停留時(shí)間縮短然后進(jìn)入血液循環(huán)代謝，減弱了其熒光信號(hào)而影響到檢出率。在染料示蹤材料中，ACNP是一種能長(zhǎng)時(shí)間停留在淋巴結(jié)且具有趨向性的示蹤染料，有臨床資料顯示對(duì)92名早期乳腺癌患者以ACNP混懸液示蹤前哨淋巴結(jié)，具有98%的檢出率、96%的準(zhǔn)確率以及較低的假陰性率〔13〕；且其具有多孔蜂窩樣結(jié)構(gòu)，能較好地吸附藥物及在淋巴結(jié)中停留。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ACNP對(duì)ICG的熒光效果無(wú)明顯影響，二者結(jié)合后能延長(zhǎng)ICG在淋巴結(jié)的停留時(shí)間并能較好地保持熒光強(qiáng)度，優(yōu)于ICG單用的效果；而ACNP聯(lián)合定位前哨淋巴結(jié)不容易發(fā)生次級(jí)引流，安全可行性高。

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河北省衛(wèi)計(jì)委2016年度醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題(20160045)

李 中(1966-)，男，碩士，主任醫(yī)師，主要從事乳腺分子生物學(xué)及臨床研究。

林曉萌(1981-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事乳腺保乳及整形技術(shù)方面研究。

R73

A

1005-9202(2017)20-4990-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.20.015

〔2016-11-19修回〕

(編輯 徐 杰)