劉盛權(quán) 李 琳 龍俊蓉 譚文婷 唐 芬 劉茂軍 梁 彪 李子寧 褚 春 楊 軍

(南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科，湖南 衡陽 421001)

1 南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院藥劑科

硫化氫通過下調(diào)MMP-11和MMP-16改善高甲狀腺素誘導(dǎo)的大鼠心肌纖維化

劉盛權(quán) 李 琳 龍俊蓉 譚文婷 唐 芬 劉茂軍 梁 彪 李子寧 褚 春1楊 軍

(南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科，湖南 衡陽 421001)

目的觀察硫化氫(H2S)對甲狀腺激素誘導(dǎo)的甲狀腺功能亢進(jìn)大鼠心肌纖維化的影響。方法通過左旋甲狀腺素溶液(L-Thy，250 μg/ml)腹腔注射(10 ml·kg-1·d-1)4 w，建立甲狀腺功能亢進(jìn)大鼠模型。以硫氫化鈉(NaHS)作為外源性H2S供體，隨機(jī)將40只SD雄性大鼠等分為對照組(Control組)、模型組(L-Thy組)、H2S干預(yù)組(L-Thy+H2S組)和H2S對照組(H2S組)，4 w后處死大鼠，取左室心肌組織行Masson染色觀察心肌纖維化，測量膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF)，Western印跡檢測MMP-11、MMP-16、PKCα靶蛋白的表達(dá)。結(jié)果與Control組相比，L-Thy組心肌膠原纖維堆積明顯增加，CVF增高(P<0.05)，而與L-Thy組相比，L-Thy+H2S組纖維化得到明顯改善，CVF降低(P<0.05)；H2S組與Control組鏡下改變類似，CVF無明顯差異(P>0.05)；與Control組相比，L-Thy組MMP-11、MMP-16表達(dá)有顯著差異(P<0.05)；與L-Thy組相比，L-Thy+H2S組MMP-11、MMP-16表達(dá)明顯減低(P<0.05)，H2S組與Control組上述蛋白表達(dá)水平無明顯差異(P>0.05)。各組之間PKCα蛋白表達(dá)沒有明顯差異(P>0.05)。結(jié)論H2S可改善甲狀腺激素誘導(dǎo)的甲狀腺功能亢進(jìn)大鼠心肌纖維化，其機(jī)制可能與下調(diào)MMP-11、MMP-16表達(dá)有關(guān)，但與PKCα通路無關(guān)。

甲狀腺功能亢進(jìn)；心肌纖維化；H2S；MMP-11、MMP-16；PKCα

心肌重構(gòu)及心肌纖維化是甲亢性心臟病主要的病理變化，其機(jī)制與甲狀腺激素引起的心肌細(xì)胞代謝加速、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)激活、交感-迷走神經(jīng)張力失衡及心肌組織間炎性細(xì)胞浸潤、水腫、壞死、氧化應(yīng)激等有關(guān)〔1〕。心肌纖維化是多種病理因素作用下心肌間質(zhì)成纖維細(xì)胞過度增殖、膠原沉積異常增加所致心肌結(jié)構(gòu)與功能重構(gòu)，其機(jī)制與細(xì)胞外基質(zhì)的合成與降解失衡有關(guān)〔2〕?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)具有降解多種細(xì)胞外基質(zhì)的生物活性并可導(dǎo)致瀑布效應(yīng)，是心肌纖維化進(jìn)程中的主要參與者。硫化氫(H2S)可清除氧自由基及硝基自由基，改善氧化應(yīng)激損傷，目前許多研究發(fā)現(xiàn)其具有一定的心臟保護(hù)作用〔3〕，但H2S可否改善過量甲狀腺激素作用下的心肌纖維化以及是否通過調(diào)控蛋白激酶C(PKC)α信號通路發(fā)揮作用，目前尚無相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究擬探索H2S對過量甲狀腺激素作用下心肌纖維化的影響及其調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 40只雄性SD大鼠(200±10)g，購于南華大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，均分籠飼養(yǎng)在恒溫(23±1)℃環(huán)境下，采用人工照明(晝夜交替)12 h，均可自由獲得糧食和水。

1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑 左旋甲狀腺素粉劑(L-Thy)和硫氫化鈉(NaHS，H2S 供體)均購自Sigma公司；MMP-11、MMP-16和PKCα一抗以及羊抗兔二抗均購自武漢博士德公司；鼠源GAPDH 一抗購自晶欣生物公司；BCA 蛋白定量試劑盒、Masson染色試劑盒及細(xì)胞裂解液均由碧云天公司提供；電泳槽(儀)、轉(zhuǎn)膜儀均購自Bio-Rad公司(美國)。

1.2方法

1.2.1模型建立及處理方案 所有參與實(shí)驗(yàn)的大鼠均適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w，此后，將40只SD大鼠隨機(jī)等分為4組：對照組(Control 組)、模型組(L-Thy組)、H2S干預(yù)組(L-Thy+H2S組)和H2S對照組(H2S組)，予L-Thy(以生理鹽水溶解，250 μg/ml)腹腔注射(10 ml·kg-1·d-1)4 w，建立甲亢大鼠模型；L-Thy+H2S組及H2S組每日同時(shí)予以NaHS溶液(100 μmol/kg)腹腔注射〔4〕。Control組予腹腔注射等量的生理鹽水，4 w后處死并開胸取出大鼠心臟后，以 0.9%生理鹽水(4℃)反復(fù)沖洗，剪去游離心肌組織，剝離后僅留左室及室間隔，取部分組織用甲醛固定，石蠟包埋，備用于Masson染色。所剩心肌組織置于-80℃保存，行Western印跡檢測。

1.2.2Masson染色觀察心肌纖維化〔5〕大鼠心肌組織以甲醛浸潤固定，常規(guī)石蠟包埋，繼之脫水，制成切片(4 μm)，Masson染色，光鏡下觀察心肌組織膠原纖維堆積情況，鏡下膠原纖維被染成深藍(lán)色，胞核呈藍(lán)褐色，胞質(zhì)呈紅色，共取不包含血管的5個(gè)不同視野，采用IPP6.0圖像分析軟件進(jìn)行分析處理，測量每組大鼠膠原纖維容積分?jǐn)?shù)(CVF)。

1.2.3Western印跡檢測心肌組織中MMP-11、MMP-16及PKCα蛋白的表達(dá)水平 取大鼠組織標(biāo)本，經(jīng)稱量、研磨及提取總蛋白后采用BCA比色法定量，蛋白標(biāo)本常規(guī)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育24 h(4℃)，繼之用TBST溶液漂洗3次(每次10 min)，再以HRP 標(biāo)記的二抗(稀釋比例為1∶2 000)孵育1 h(37℃)，再次以TBST溶液漂洗3次(每次10 min)，ECL顯影，曝光掃描，采用Image J軟件對靶蛋白條帶進(jìn)行光密度分析，以相應(yīng)條帶與內(nèi)參GAPDH灰度比值表示MMP-11、MMP-16、PKCα靶蛋白相對表達(dá)水平。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0軟件，計(jì)量資料行方差齊性檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較行單因素方差分析(ANOVA)。

2 結(jié) 果

2.1大鼠存活情況 4 w后，有32只大鼠存活，其中Control組9只，L-Thy組7只，L-Thy+H2S組8只，H2S組8只。

2.2大鼠心肌組織Masson 染色 與Control 組相比，L-Thy組大鼠心肌細(xì)胞間大量的藍(lán)色深染的膠原纖維堆積，CVF明顯增加(P<0.05)；而與L-Thy組相比，L-Thy + H2S 組大鼠心肌細(xì)胞間膠原纖維明顯減少，CVF顯著減少(P<0.05)。Control 組與H2S組之間鏡下膠原纖維沉積類似，CVF未見明顯差異(P>0.05)，見圖1。

2.3H2S對心肌組織中MMP-11、MMP-16及PKCα蛋白表達(dá)的影響 與Control 組相比，L-Thy組MMP-11、MMP-16蛋白表達(dá)明顯增高(P<0.05)；與L-Thy組相比，L-Thy+H2S組MMP-11、MMP-16蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)；Control 組與H2S組之間MMP-11、MMP-16蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。各組之間PKCα蛋白表達(dá)未見明顯差異(P>0.05)，見圖2，表1。

圖1 各組大鼠心肌組織Masson染色(×400)

圖2 各組大鼠MMP-11、MMP-16及PKCα蛋白表達(dá)

組別MMP?11MMP?16PKCαCVFControl組0．718±0．0180．693±0．0430．580±0．0070．026±0．0003L?Thy組0．968±0．1111)1．009±0．0091)0．585±0．0080．128±0．00251)L?Thy+H2S組0．701±0．0162)0．649±0．0472)0．553±0．0080．083±0．00342)H2S組0．705±0．0040．731±0．0150．576±0．0140．033±0．0033

與Control組比較：1)P<0.05；與L-Thy組比較：2)P<0.05

3 討 論

高甲狀腺素作用于心臟引起的病理改變主要是心肌纖維化，后者是甲亢性心臟病發(fā)展到心肌重構(gòu)和心功能不全的主要因素，而目前針對心肌纖維化的有效治療策略相當(dāng)有限。心肌纖維化是心肌細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)進(jìn)行重塑的結(jié)果，主要與膠原的合成與降解失衡有關(guān)。MMPs是一組鋅離子依賴性內(nèi)肽酶，因其具有降解多種細(xì)胞外基質(zhì)并形成瀑布效應(yīng)的生物活性，故成為心肌纖維化進(jìn)程中的主要參與者。當(dāng)MMPs表達(dá)異常時(shí)導(dǎo)致ECM降解失衡，其在很大程度上推動(dòng)了心肌纖維化的進(jìn)展，目前許多研究也發(fā)現(xiàn)在心肌纖維化組織中，MMPs蛋白表達(dá)明顯增加。MMP-11又稱為基質(zhì)裂解素-3，在正常的器官組織中其低表達(dá)甚至不表達(dá)，反之，則高表達(dá)，能下調(diào)體內(nèi)的纖連蛋白，參與細(xì)胞凋亡及ECM重構(gòu)〔6，7〕。MMP-16也稱為模型基質(zhì)金屬蛋白酶(MT-MMP)，能特異性激活下游的MMP-2，而MMP-2屬于明膠酶，既能分解變性膠原明膠，亦可分解Ⅳ、Ⅴ和Ⅶ型膠原以及纖維連接蛋白等，從而參與纖維化的進(jìn)程〔8〕。本研究結(jié)果顯示，過量的甲狀腺激素引起了心肌纖維化，同時(shí)，高甲狀腺素誘導(dǎo)下可導(dǎo)致明顯大鼠心肌纖維化，并與MMP-11、MMP-16水平明顯上調(diào)有關(guān)。PKC是絲氨酸/蘇氨酸(Ser/Thr)蛋白激酶家族中的一員，具有多種亞型，而PKCα為蛋白激酶家族表達(dá)最豐富的亞型(屬于經(jīng)典型)，參與細(xì)胞炎癥反應(yīng)、增殖與凋亡、氧化應(yīng)激等的調(diào)控〔9〕。PKC也參與調(diào)節(jié)MMPs 的水平和活性的調(diào)控。Song等〔10〕發(fā)現(xiàn)在大鼠心衰模型中PKCα表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)心肌纖維化發(fā)生。但PKC 在纖維化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的作用極其復(fù)雜，即使是同一種亞型的PKC在不同心臟疾病中也具有不同的作用，如PKCε激活在高血壓誘導(dǎo)的心功能不全的發(fā)生機(jī)制中顯示損害作用，卻在心肌梗死模型中具有保護(hù)作用〔11〕。本研究也提示，PKCα通路可能沒有參與高甲狀腺素誘導(dǎo)的大鼠心肌纖維化的調(diào)控機(jī)制。

有研究表明，內(nèi)源性或者一定濃度的外源性的H2S具有抗炎、舒張血管、促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞凋亡和抗氧化應(yīng)激等多種生物學(xué)效應(yīng)，在心腦血管疾病保護(hù)中有一定作用；外源性的H2S能抑制促纖維化基因及Galectin-3 mRNA 表達(dá)水平，降低纖維化指標(biāo)CTGF〔12〕。eNOS調(diào)控NO的合成是心血管保護(hù)的關(guān)鍵，而H2S通過調(diào)節(jié)eNOS活化及使NO生物利用度增加，在調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝、減輕纖維化及炎癥反應(yīng)等方面延緩心肌纖維化及心功能不全的發(fā)生與發(fā)展〔13〕。本研究提示H2S可改善甲亢性心肌纖維化。H2S干預(yù)可通過下調(diào)MMP-11和MMP-16水平改善高甲狀腺素誘導(dǎo)的大鼠心肌纖維化。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)H2S能夠調(diào)控PKCα、磷脂酰激酶-3(PI3K)及細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，改善心肌缺血缺氧時(shí)的炎癥反應(yīng)、凋亡及氧化應(yīng)激，從而改善心功能及心肌纖維化〔14〕；而H2S的心肌保護(hù)作用也與下調(diào)PKC的表達(dá)有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，H2S下調(diào)MMP-11和MMP-16水平以及改善大鼠心肌纖維化的機(jī)制可能與調(diào)控PKCα通路無關(guān)。本研究結(jié)果為防治甲亢性心肌病以及高甲狀腺素誘導(dǎo)的心肌纖維化提供了新的治療靶點(diǎn)及新的思路，但其具體的調(diào)控機(jī)制及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路仍需進(jìn)一步研究。

1Fadel BM，Ellahham S，Ringel MD，etal.Hyperthyroid heart disease〔J〕.Clin Cardiol，2000；23(6)：402-8.

2Antonio M，Chantal Di S，Sebastiano R，etal.Thyroid hormones，oxidative stress，and inflammation〔J〕.Mediators Inflamm，2016；2016:6757154.

4Polhemus DJ，Lefer DJ.Emergence of hydrogen sulfide as an endogenous gaseous signaling molecule in cardiovascular disease〔J〕.Circ Res，2014；114(4)：730-7.

5肖 婷，羅 健，吳志雄，等.硫化氫對糖尿病大鼠心肌纖維化及CX40和CX45表達(dá)的影響〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2015；35(21)：6025-7.

6Jenkins MH，Alrowaished SS，Goody MF，etal.Laminin and matrix metalloproteinase 11 regulate fibronectin levels in the zebrafish myotendinous junction〔J〕.Skelet Muscle，2016；6(1)：18.

7Mathew S，F(xiàn)u L，Takashi H，etal.Tissue-dependent induction of apoptosis by matrix metalloproteinase stromelysin-3 during amphibian metamorphosis〔J〕.Birth Defects Res C Embryo Today，2010；90(1)：55-66.

8何同梅，陳麗芳，何 時(shí)，等.MMP16在胰腺癌組織中的表達(dá)及其臨床意義〔J〕.臨床與病理雜志，2016；36(10)：1600-4.

9李云峰.PKC在細(xì)胞凋亡中的作用〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2004;24(1)：87-8.

10Song X，Qian X，Shen M，etal.Protein kinase C promotes cardiac fibrosis and heart failure by modulating galectin-3 expression〔J〕.Biochim Biophys Acta，2015；1853(2)：513-21.

11王立英，楊世杰.蛋白激酶C在心肌纖維化中的作用〔J〕.藥學(xué)學(xué)報(bào)，2010;45(12)：1467-71.

12Zheng D，Dong S，Li T，etal.Exogenous hydrogen sulfide attenuates cardiac fibrosis through reactive oxygen species signal pathways in experimental diabetes mellitus models〔J〕.Cell Physiol Biochem，2015；36(3)：917-29.

13King AL，Polhemus DJ，Bhushan S，etal.Hydrogen sulfide cytoprotective signaling is endothelial nitric oxide synthase-nitric oxide dependent〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A，2014；111(8)：3182-7.

14Lavu M，Bhushan S，Lefer DJ.Hydrogen sulfide-mediated cardioprotection：mechanisms andtherapeutic potential〔J〕.Clin Sci(Lond)，2011；120(6)：219-29.

Hydrogensulfideattenuatingmyocardialfibrosisinducedbyhighthyroidhormonethroughdown-regulatingtheexpressionsofMMP-11andMMP-16inratmodels

LIUSheng-Quan,LILin,LONGJun-Rong,etal.

DepartmentofCardiology,theFirstAffiliatedHospitalofUniversityofSouthChina,Hengyang421001,Hunan,China

ObjectiveTo observe the effects of Hydrogen sulfide (H2S) on myocardial fibrosis in rat models of hyperthyroidism induced by high thyroid hormone.MethodsThe hyperthyroidism in rats were induced by intraperitoneal injection of the L-Thyroxine solution (250 μg/ml,10 ml·kg-1·d-1) for 28 days. Sodium hydrosulfide was taken as the exogenous donor of hydrogen sulfide.40 male SD mice were randomly divided into control， model， intervention of H2S(L-Thyroxine+H2S group)and control of H2S(H2S group)groups. All the mice were killed after 4 weeks, then Masson staining was performed to observe the myocardial fibrosis and the collagen volume fraction(CVF) was measured, the expression of MMP-11， MMP-16 and PKCα was detected by Western blot.ResultsCompared with control group, the myocardial fibrosis and CVF were obviously increased in the L-Thyroxine group (P<0.05). Compared with L-Thyroxine group, the myocardial fibrosis and CVF were significantly decreased in L-Thyroxine+H2S group (P<0.05), and there was no difference between control and H2S groups (P>0.05). Compared to control group, the expression of MMP-11 and MMP-16 were up-regulated in L-Thyroxine group (P<0.05), while the expression of above target proteins were down-regulated obviously in L-Thyroxine+H2S group (P<0.05), there was still no difference between control group and H2S group (P>0.05). Also, the expression of PKCα was similar in each group (P>0.05).ConclusionsThe H2S may improve the rats myocardial fibrosis of hyperthyroidism induced by thyroid hormone through regulating the expression of protein of MMP-11, MMP-16 but has nothing to do with the pathway of PKCα.

Hyperthyroidism；Myocardial fibrosis；H2S；MMP-11;MMP-16;PKCα

國家自然科學(xué)基金(81270181；81202830)

楊 軍(1972-)，男，博士，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事老年心血管疾病研究。

劉盛權(quán)(1992-)，男，在讀碩士，主要從事心血管疾病及老年醫(yī)學(xué)研究。

R581.1

A

1005-9202(2017)20-4985-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.20.013

〔2017-01-15修回〕

(編輯 李相軍)