查木哈格 于建設(shè)

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院麻醉科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050)

七氟烷在大鼠心臟再灌注心律失常中的作用及對心肌細胞電生理的影響

查木哈格 于建設(shè)

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院麻醉科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050)

目的探討七氟烷在大鼠心臟再灌注心律失常中的作用及對心肌細胞電生理的影響。方法取SD大鼠40只，采用Langendoeff灌注建立心臟再灌注心律失常模型，采用重碳酸鹽緩沖液(KH)進行15 min處理后分為空白對照組、缺血再灌注組、七氟烷預處理組和七氟烷后處理組，每組10只，采用標準的全細胞膜片鉗技術(shù)進行電生理實驗。結(jié)果缺血再灌注組再灌注15、30 min左心室舒張壓(LVDP)及心率水平低于空白對照組(P<0.05)；七氟烷后處理組、七氟烷預處理組及缺血再灌注組再灌注15、30 min左室舒張末壓(LVEDP)水平高于空白對照組(P<0.05)；七氟烷后處理組、七氟烷預處理組處理后肌鈣蛋白Ⅰ水平低于缺血再灌注組，高于空白對照組(P<0.05)；七氟烷后處理組、七氟烷預處理組和缺血再灌注組均可見明顯的心肌梗死；七氟烷后處理組處理后細胞內(nèi)鈣離子和活性氧水平低于七氟烷預處理組和缺血再灌注組(P<0.05)；七氟烷后處理組、七氟烷預處理組、缺血再灌注組心肌細胞動作電位參數(shù)低于空白對照組(P<0.05)；七氟烷后處理組、七氟烷預處理組電位參數(shù)高于缺血再灌注組(P<0.05)。結(jié)論心臟再灌注心律失常大鼠采用七氟烷處理后能改善其血流動力學，減少梗死面積，減少對心肌細胞電生理的影響。

心肌缺血；再灌注心律失常；七氟烷；血流動力學

有研究提出機體短暫心肌缺血能對心肌缺血產(chǎn)生一定的保護作用，成為缺血預處理〔1〕。隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷發(fā)展，相關(guān)學者提出〔2〕，機體產(chǎn)生時間缺血后，在復灌時進行反復短暫缺血處理，能緩解患者癥狀，降低再灌注損傷發(fā)生率。研究顯示〔3〕，麻醉藥物預處理或麻醉藥后處理，均能進一步激發(fā)內(nèi)源性保護機制，從而能減輕心肌缺血再灌注損傷(MIRI)程度。此外，通過麻醉藥物實施預處理和后處理較機械性處理安全性較高，可控性也較強，臨床應(yīng)用的可行性較大，能作為缺血性心臟病患者心臟或非心臟手術(shù)的一種保護性干預方法。目前，臨床上常用的麻醉藥物包括異氟烷、七氟烷、恩氟烷等，但揮發(fā)性麻醉藥物在缺血中的處理普遍認為：被動保護作用機制可能與機體內(nèi)細胞內(nèi)鈣超載、降低氧自由基水平等有關(guān)，而主動保護則與機體相關(guān)酶通路有關(guān)，同時調(diào)控相關(guān)酶的活性從而控制蛋白的翻譯、轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生心肌保護作用，該結(jié)論尚未得到進一步證實〔4〕。本文擬探討七氟烷在大鼠心臟再灌注心律失常中的作用及對心肌細胞電生理的影響。

1 材料與方法

1.1動物與分組 于2015年1月至2016年7月取SD大鼠40只，SPF級，雌雄隨機，體重250～300 g，平均(278.1±5.3)g，采用重碳酸鹽緩沖液(KH液)進行15 min處理后分為空白對照組、缺血再灌注組、七氟烷預處理組和七氟烷后處理組，每組10只。均由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學醫(yī)學動物實驗中心提供。實驗過程中對大鼠飼養(yǎng)、處理均符合《關(guān)于善待實驗動物的指導性意見》〔5〕相關(guān)規(guī)則。試驗均通過醫(yī)院動物委員會批準同意。

1.2儀器及試劑 主要儀器和試劑主要有七氟烷(Sevoflurane)(Mamishi Pharmaceutical 公司，日本)，Ⅱ型膠原酶(Worthington公司)，F(xiàn)ura-2AM和DCFH-DA熒光探針(南通碧云天公司)，2，3，5-氯三苯四唑(Sigma公司)，血流動力學監(jiān)測設(shè)備(AD Instruments 公司，Colorado Springs，美國)，熒光分光光度計(型號：F320，港東公司，天津)，微電極控制儀(型號SUTTER P-97 (美國Sutter公司))，微電極拋光儀(型號 MF-830，日本 NARISHIGE 公司)。

1.3方法

1.3.1模型構(gòu)建 向入選大鼠其腹腔內(nèi)注射1 000 U/kg肝素完成肝素化處理，10 min后向腹腔內(nèi)注射1.5 g/kg烏拉坦進行麻醉，待麻醉生效后將其固定在實驗室操作臺上。找到解剖標志劍突后，沿著胸骨下緣剪開胸腔，然后輕輕剪開心包，游離心臟周圍的組織和脂肪，確定心底部的主動脈，了解心臟周圍的結(jié)構(gòu)、聯(lián)系，沿著心底部快速橫斷主動脈，取出心臟并放入4℃無鈣式液中，去除心腔中的殘留血液和組織。在剪取心臟的同時，預留長為2 mm的主動脈，便于懸掛在灌注設(shè)備上。然后將心臟在取出后30 s內(nèi)懸掛在Langendoeff灌注裝置上，結(jié)扎并固定主動脈，設(shè)置相關(guān)參數(shù)，控制流速為10 ml/min向主動脈泵入濃度為95.0%、5%CO2飽和的KH液，整個灌注裝置提前采用水浴箱進行處理，控制心臟灌注液溫度為37℃，從而完成大鼠模型建立〔6〕。

1.3.2處理方法 四組大鼠模型建立完畢后，根據(jù)預先分組進行相應(yīng)的處理。空白對照組在建模后給予普通KH液進行75 min灌注；缺血再灌注組建模后在平衡器進行20 min灌注，隨后停止灌注25 min，再次進行30 min灌注；七氟烷預處理組建模后平衡器給予濃度為3%七氟烷飽和的KH液進行15 min灌注，然后采用KH液進行5 min洗脫，然后停止灌注25 min，然后采用普通KH液進行30 min復灌；七氟烷后處理組建模成功后灌注普通KH液進行20 min灌注，停止灌注25 min，復灌之初采用濃度為3%七氟烷飽和KH液進行15 min灌注，然后采用普通KH液進行15 min灌注〔7〕。

1.4觀察指標 (1)血流動力學：采用Langendoeff灌注監(jiān)測系統(tǒng)測定四組大鼠血流動力學變化情況，了解大鼠處理后血流動力學情況〔8〕。(2)肌鈣蛋白 Ⅰ：四組大鼠分別在平衡期、復灌結(jié)束時采用1 ml冠脈流出液，采用180全自動化學發(fā)光免疫系統(tǒng)及配套試劑盒完成肌鈣蛋白I的測定。(3)心肌梗死面積：采用2，3，5-氯三苯四唑染色法進一步確定四組大鼠的心肌梗死面積。在灌注結(jié)束后，采集各組大鼠心臟，沿著短軸切成厚度為1～2 mm切片，拍照后采用相關(guān)軟件進行圖像分析，根據(jù)梗死面積占總面積的百分數(shù)進行計算〔9〕。(4)細胞內(nèi)鈣離子或活性氧水平。采用熒光指示劑Fura-2 AM測定細胞內(nèi)鈣離子濃度。采用熒光指示劑2′7′-二氨熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)完成四組大鼠心肌細胞內(nèi)活性氧水平的測定，相關(guān)操作步驟嚴格遵循儀器、試劑盒操作說明進行。(5)電生理實驗：根據(jù)醫(yī)院現(xiàn)有條件采用膜片鉗系統(tǒng)，包括電極支持系統(tǒng)、膜片鉗反饋系統(tǒng)、計算機設(shè)備等?？刂茖嶒炇覝囟群愣?，將整個膜片鉗實驗在恒溫下，向灌流槽中滴加0.5 ml細胞懸液，5～10 min靜置，待細胞貼壁后采用純氧飽和的細胞外液進行5～10 min灌流，速度為1～2 ml/min。經(jīng)膜片鉗反饋的信號經(jīng)過電極導絲傳入細胞，產(chǎn)生電流信號經(jīng)過負反饋放大器進行測定，經(jīng)過數(shù)模轉(zhuǎn)換后傳入到計算機中，記錄相關(guān)數(shù)據(jù)〔10〕。

1.5統(tǒng)計學方法 采用SPSS18.0軟件進行分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗，計量資料采用t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1四組再灌注15、30 min血流動力學參數(shù)比較 缺血再灌注組再灌注15、30 min左心室舒張壓(LVDP)及心率水平低于空白對照組(P<0.05)；七氟烷后處理組、七氟烷預處理組及缺血再灌注組再灌注15、30 min左室舒張末壓(LVEDP)水平高于空白對照組(P<0.05)；七氟烷后處理組再灌注15、30 min LVDP、心率及LVEDP高于七氟烷預處理組及缺血再灌注組(P<0.05)。見表1。

表1 四組再灌注15、30 min血流動力學參數(shù)及處理前后肌鈣蛋白Ⅰ水平比較

與空白對照組比較：1)P<0.05；與七氟烷后處理組比較：2)P<0.05；與缺血再灌注組比較：3)P<0.05；下表同

2.2四組大鼠處理前及處理后肌鈣蛋白Ⅰ水平比較 四組大鼠處理前肌鈣蛋白Ⅰ水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；七氟烷后處理組、七氟烷預處理組處理后低于缺血再灌注組，高于空白對照組(P<0.05)。見表1。

2.3四組心肌梗死面積比較 空白對照組未見心肌梗死，故未列入統(tǒng)計。七氟烷后處理組、七氟烷預處理組和缺血再灌注組均可見明顯的心肌梗死，七氟烷后處理組、七氟烷預處理組梗死面積差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但小于缺血再灌注組(P<0.05)。見圖1。

2.4四組處理前后細胞內(nèi)鈣離子和活性氧水平比較 兩組處理前細胞內(nèi)鈣離子和活性氧水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；七氟烷后處理組處理后細胞內(nèi)鈣離子和活性氧水平低于七氟烷預處理組和缺血再灌注組(P<0.05)。見表2。

圖2 各組心肌梗死面積比較

組別鈣離子(mmol/L)處理前處理后活性氧水平(ng/ml)處理前處理后七氟烷后處理組230±12132±11253±32157±13七氟烷預處理組229±11145±122)251±31171±162)缺血再灌注組231±13164±162)255±34189±182)

2.5四組處理后心肌細胞動作電位參數(shù)變化比較 七氟烷后處理組、七氟烷預處理組、缺血再灌注組心肌細胞動作電位參數(shù)低于空白對照組(P<0.05)；七氟烷后處理組、七氟烷預處理組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但高于缺血再灌注組(P<0.05)。見表3。

表3 四組處理后心肌細胞動作電位參數(shù)變化比較

3 討 論

七氟烷是臨床上使用較多的麻醉藥物，該藥物具有誘導快、血流動力學穩(wěn)定及冠脈竊血發(fā)生率低等特點，對于大鼠心臟再灌注心律失常中具有良好的保護作用，能作為手術(shù)中心肌保護的一種重要手段，從而能有效改善患者預后。七氟烷根據(jù)給藥時間及心肌缺血發(fā)生先后順序可以分為缺血前使用、缺血時使用及缺血后使用。通過七氟烷能完成心肌的保護，能降低機體內(nèi)肌鈣蛋白I水平，從而降低心肌梗死面積〔11〕。

七氟烷能改善機體左心室后負荷，有效抑制左心房、心臟收縮，從而能降低心室舒張功能，機體能藥物依賴的降低血壓水平，改善機體血流動力學水平。本實驗結(jié)果提示，七氟烷能穩(wěn)定機體血流動力學，改善機體癥狀，能直接抑制心臟L型鈣通道，從而阻礙鈣離子的跨膜轉(zhuǎn)運，降低肌漿網(wǎng)對于鈣離子的利用，從而抑制心肌收縮力。此外，七氟烷還能調(diào)節(jié)心肌氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而能保護心肌細胞膜，保護再灌注心肌功能。本研究結(jié)果提示，七氟烷在大鼠心臟再灌注心律失常中具有良好的作用，藥物能維持心肌細胞運動電位正常，避免正常心肌再灌注損傷后運動電位引起的差異，從而能降低室壁離散度，能有效預防再灌注心律失常發(fā)生率。此外，七氟烷能減少心肌細胞間的異質(zhì)性，進一步預防心肌復極離散度，降低再灌注心律失常的嚴重程度〔12〕。

1王學勝，張學平，陳 慧，等.穩(wěn)心顆粒聯(lián)合美托洛爾治療老年人冠心病心律失常的臨床療效觀察〔J〕.中華老年醫(yī)學雜志，2013;32(11):1159-60.

2蔡全云.貝那普利與美托洛爾聯(lián)合治療老年充血性心力衰竭療效觀察〔J〕.新鄉(xiāng)醫(yī)學院學報，2014;31(3):224-5.

3Ylanen K，Eerola A，Vettenranta K，etal.Three～dimensional echocardiography and cardiac magnetic resonance imaging in the screening of long～term survivors of childhood cancer after cardiotoxic therapy〔J〕.Am J Cardiol，2014;113(11):1886-92.

4李昭蓉，何 濤，秦 超，等.3種傳導異常心律失常的心率變異性分析〔J〕.廣西醫(yī)科大學學報，2016;33(3)：492-4.

5Kang MH，Kim HH,Han YM.Generation of bladder urothelium from human pluripotent stem cells under chemically defined serum-and feeder-free system〔J〕.Int J Mol Sci，2014;15(5):7139-57.

6唐 欣，王 巖，易海波，等.人臍帶間充質(zhì)干細胞誘導分化為心肌細胞的特異性基因表達〔J〕.中國組織工程研究，2013;17(27):4988-91.

7劉 毅，唐 軍，李世龍.基因轉(zhuǎn)染臍帶間充質(zhì)干細胞與絲素蛋白構(gòu)建組織工程脂肪〔J〕.中國組織工程研究，2013;17(14):2501-8.

8Lee Y，Jung J，Cho KJ，etal.Increased SCF/c-kit by hypoxia promotes autophagy of human placental chorionic plate-derived mesenchymal stem cells via regulating the phosphorylation of mTOR〔J〕.J Cell Biochem，2013；114(1):79-88.

9劉林奇，高建華，袁 藝,等.低氧預處理對人脂肪來源干細胞的活性及表面標志的影響〔J〕.中國美容整形外科雜志，2013;24(3)：180-3.

10蔡 炳，李 科，脫 穎，等.誘導多能干細胞向尿道上皮細胞分化體系的建立〔J/CD〕.中華腔鏡泌尿外科雜志:電子版，2016;10(3):400-3.

11王朝元，胡 蝶.玉柏石松甾體化合物對體外培養(yǎng)成骨細胞的活性的影響〔J〕.中南民族大學學報(自然科學版)，2014;33(2):22-7.

12周長輝，田 毅，楊 波，等.人臍帶沃頓膠間充質(zhì)干細胞對人外周血T淋巴細胞的免疫調(diào)節(jié)作用〔J〕.中國組織工程研究與臨床康復，2010;14(14):2485-91.

內(nèi)蒙古自治區(qū)自然基金項目(No.2016MS(LH)0820);內(nèi)蒙古自治區(qū)衛(wèi)生和計劃委員會項目(No.201303056)

于建設(shè)(1963-)，男，主任醫(yī)師，主要從事臨床麻醉研究。

查木哈格(1979-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事臨床麻醉研究。

R54

A

1005-9202(2017)20-4971-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.20.007

〔2017-02-18修回〕

(編輯 袁左鳴)