趙志英 胡志強(qiáng) 高洋洋

(內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014010)

當(dāng)藥醇苷對(duì)β淀粉樣蛋白誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞損傷模型GSK-3β及Akt表達(dá)的影響

趙志英 胡志強(qiáng) 高洋洋

(內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014010)

目的研究當(dāng)藥醇苷對(duì)阿爾茨海默病(AD)細(xì)胞模型糖原合成酶激酶(GSK)-3β及蛋白激酶 B(Akt)表達(dá)的影響及機(jī)制。方法10 μmol/L Aβ作用于PC12細(xì)胞制作成AD細(xì)胞模型。實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組，模型組，當(dāng)藥醇苷低劑量組，當(dāng)藥醇苷高劑量組，LY294002組，LY294002+當(dāng)藥醇苷高劑量組。結(jié)果與正常對(duì)照組比較，模型組p-Akt蛋白水平明顯下降(P<0.05)，而p-GSK-3β蛋白顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，當(dāng)藥醇苷高、低劑量組p-Akt蛋白表達(dá)水平明顯升高，p-GSK-3β蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.05)；當(dāng)藥醇苷高、低劑量組間比較差異不顯著(P>0.05)；用LY294002處理的兩組p-Akt蛋白和p-GSK-3β蛋白表達(dá)水平與正常對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05)，LY294002+當(dāng)藥醇苷高劑量組與當(dāng)藥醇苷高、低劑量組的p-Akt蛋白和p-GSK-3β蛋白表達(dá)水平比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。結(jié)論當(dāng)藥醇苷可以拮抗Aβ導(dǎo)致的AD神經(jīng)損傷，具有神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能通過(guò)激活PI3K/Akt 信號(hào)通路，提高p-Akt蛋白表達(dá)水平，抑制該通路下游靶分子 p-GSK-3β 活性而實(shí)現(xiàn)。

當(dāng)藥醇苷；阿爾茨海默病(AD)；PI3K/Akt通路；糖原合成酶激酶(GSK)-3β

糖原合成酶激酶(GSK)-3β是磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)通路下游分子，是少見(jiàn)的通過(guò)磷酸化而失活的蛋白激酶之一，其磷酸化后活性明顯降低。GSK-3β水平增高可以經(jīng)過(guò)一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致β淀粉樣蛋白(Aβ)異常沉積和tau蛋白過(guò)度磷酸化，在阿爾茨海默病(AD)患者腦內(nèi)水平明顯增高〔1〕。因此，對(duì)GSK-3β的調(diào)控可能成為治療AD的重要靶點(diǎn)。Xanthones(口山酮)是一類(lèi)有廣泛藥理活性的多酚類(lèi)化合物，具有神經(jīng)系統(tǒng)興奮、抗炎、保肝以及抗病毒等作用〔2〕?？谏酵?lèi)化合物包括雛菊葉龍膽酮和當(dāng)藥醇苷等，當(dāng)藥醇苷有緩解烏頭堿引發(fā)的心律失常及保護(hù)心肌細(xì)胞等作用〔3〕，而當(dāng)藥醇苷拮抗神經(jīng)損傷的研究少見(jiàn)。本文探討當(dāng)藥醇苷對(duì)Aβ引起神經(jīng)細(xì)胞損傷的影響及部分機(jī)制。

1 材料和方法

1.1材料 PC12細(xì)胞購(gòu)自上海細(xì)胞所；當(dāng)藥醇苷來(lái)源于包頭醫(yī)學(xué)院蒙藥藥用植物資源保護(hù)與開(kāi)發(fā)利用院士工作站，純度≥95%。Aβ，Sigma公司產(chǎn)品分裝，羊抗鼠IgG二抗購(gòu)于寶信生物科技公司。

1.2方法

1.2.1PC12細(xì)胞培養(yǎng) 復(fù)蘇PC12細(xì)胞，DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，2～3 d換液一次，待PC12細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，占瓶底70%～80%時(shí)傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)周期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。加入Aβ 10 μmol/L作用PC12細(xì)胞24 h后制作AD細(xì)胞模型。

1.2.2分組 將培養(yǎng)的PC12細(xì)胞分為六組。(A)正常對(duì)照組(正常培養(yǎng)的PC12細(xì)胞)；(B)神經(jīng)細(xì)胞損傷模型組(在培養(yǎng)的PC12細(xì)胞中加入Aβ 10 μmol/L)；(C)當(dāng)藥醇苷低劑量組(Aβ 10 μmol/L+當(dāng)藥醇苷25 mmol/L)；(D)當(dāng)藥醇苷高劑量組(Aβ 20 μmol/L+當(dāng)藥醇苷50 mmol/L)；(E)LY294002組(在PC12細(xì)胞中加入Aβ 10 μmol/L+LY294002即PI3K/Akt信號(hào)通路抑制劑)；(F)LY294002+當(dāng)藥醇苷高劑量組(Aβ10 μmol/L+LY294002+當(dāng)藥醇苷50 mmol/L)。

1.2.3Western印跡檢測(cè) 將各組PC12細(xì)胞分別加入裂解液提取蛋白，用Bradford法蛋白定量，蛋白質(zhì)樣品用SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜。三乙醇胺緩沖鹽水溶液洗膜后加入堿性磷酸酶(AP)標(biāo)記的二抗，ECL檢測(cè)液顯色，β-actin為內(nèi)參，用凝膠圖像軟件系統(tǒng)分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS19.0軟件，定量資料兩樣本均數(shù)間比較行t檢驗(yàn)，多個(gè)樣本均數(shù)間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組 Akt與p-Akt 表達(dá)水平比較 與正常對(duì)照組〔(101.31±9.98)%〕比較，模型組p-AKT/AKT水平〔(61.29±6.58)%〕明顯下降(P<0.05)；與模型組比較，25、50 μmol/L當(dāng)藥醇苷組p-AKT/AKT表達(dá)水平〔(99.89±10.23)%，(101.67±10.86)%〕明顯升高(P<0.05)，而當(dāng)藥醇苷二組間比較差異不顯著(P>0.05)；用LY294002處理的LY294002組和LY294002+當(dāng)藥醇苷高劑量組，p-AKT/AKT表達(dá)水平〔(63.36±6.81)%，(65.27±7.02)%〕與正常對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05)，LY294002組與25、50 μmol/L當(dāng)藥醇苷組的p-Akt蛋白表達(dá)水平比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

A：正常對(duì)照組；B：模型組；C：當(dāng)藥醇苷低劑量組；D：當(dāng)藥醇苷高劑量組；E：LY294002組；F：LY294002+當(dāng)藥醇苷高劑量組；下圖同圖1 Western印跡檢測(cè)各組細(xì)胞Akt、p-Akt表達(dá)

2.2各組 GSK-3β 及 p-GSK-3β 蛋白表達(dá)水平比較 與正常對(duì)照組〔(63.24±6.45)%〕比較，模型組p-GSK-3β/GSK-3β〔(34.67±4.32)%〕顯著降低(P<0.05)。與模型組比較，25、50 μmol/L當(dāng)藥醇苷組p-GSK-3β/GSK-3β表達(dá)明顯升高〔(89.13±9.16)%，(92.64±9.03)%〕(P<0.05)；25、50 μmol/L當(dāng)藥醇苷組間比較差異不顯著(P>0.05)；LY294002組和LY294002+當(dāng)藥醇苷高劑量組，p-GSK-3β/GSK-3β蛋白表達(dá)水平〔(75.23±7.22)%，(71.46±7.17)%〕與正常對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05)，LY294002+當(dāng)藥醇苷高劑量組與25、50 μmol/L當(dāng)藥醇苷組的表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 Western印跡檢測(cè)各組細(xì)胞GSK-3β、p-GSK-3β表達(dá)

3 討 論

PI3K/Akt信號(hào)通路的調(diào)控在神經(jīng)元生存、代謝、增殖、分化以及最終的凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要作用〔4〕。Akt是PI3K/Akt信號(hào)通路中位于核心環(huán)節(jié)的重要信號(hào)蛋白，PI3K 通過(guò)磷酸化Akt使其活性增強(qiáng)，Akt活化后引發(fā)下游信號(hào)分子GSK-3β、Bcl-2相關(guān)蛋白、caspase系列蛋白酶等磷酸化，從而起到抗神經(jīng)元凋亡及促進(jìn)神經(jīng)元存活的作用〔5,6〕。GSK-3β 是一種通過(guò)磷酸化作用而抑制糖原合成酶的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，GSK-3β磷酸化后其生物活性即受到相應(yīng)抑制。GSK-3β的過(guò)度表達(dá)及活性增高可以導(dǎo)致tau蛋白過(guò)度磷酸化，而tau 蛋白過(guò)度磷酸化是AD的病因之一，也是該病重要的分子生物學(xué)改變特征。GSK-3β通過(guò)調(diào)節(jié)APP的裂解導(dǎo)致Aβ的生成增加〔7〕，因此，通過(guò)采取相應(yīng)措施抑制GSK-3β的磷酸化，可能成為AD治療的靶點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)藥醇苷可以拮抗Aβ導(dǎo)致的AD神經(jīng)損傷，抑制GSK-3β磷酸化，具有神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)的作用。AD發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，其中Aβ級(jí)聯(lián)學(xué)說(shuō)被廣為接受，即腦內(nèi)在遺傳及內(nèi)外環(huán)境因素發(fā)生變化刺激下生成Aβ，Aβ在腦內(nèi)特定區(qū)域聚集，產(chǎn)生相應(yīng)的神經(jīng)毒性，造成神經(jīng)突觸損傷、神經(jīng)元凋亡，最終引發(fā)認(rèn)知障礙。而Aβ可能主要通過(guò)PI3K/Akt 信號(hào)通路途徑引發(fā)神經(jīng)元凋亡〔8〕。PI3K/Akt 通路下游分子中的GSK-3β是多種重要凋亡相關(guān)蛋白之一，GSK-3β可以促進(jìn)過(guò)量Aβ生成、Tau蛋白過(guò)度磷酸化，并可以促使下游底物促凋亡蛋白caspase-9以及 caspase-3的磷酸化。磷酸化GSK-3β可以導(dǎo)致神經(jīng)突觸功能可塑性障礙下降以及神經(jīng)元的凋亡〔9〕。因此抑制GSK-3β的活性可能對(duì)AD的治療起到有益的作用，GSK-3β將成為治療AD藥物作用的強(qiáng)有力的靶點(diǎn)之一。龍膽科龍膽屬(Gentiana)植物及其提取物具有抑制乙酰膽堿酯酶、保肝、抗氧化、抗炎、抗抑郁、抗腫瘤等多方面的藥理作用〔10,11〕。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Aβ能降低PC12細(xì)胞中p-Akt蛋白表達(dá)水平，提高p-GSK-3β蛋白表達(dá)水平，當(dāng)藥醇苷可拮抗Aβ引起的這種效應(yīng)，即下調(diào)Aβ引起的PC12細(xì)胞p-Akt蛋白表達(dá)水平和上調(diào)p-GSK-3β蛋白表達(dá)水平；若預(yù)先用PI3K/Akt信號(hào)通路處理PC12細(xì)胞，再應(yīng)用當(dāng)藥醇苷處理細(xì)胞，則不會(huì)出現(xiàn)PC12細(xì)胞p-Akt蛋白表達(dá)水平和p-GSK-3β蛋白表達(dá)水平的改變，這與當(dāng)藥醇苷對(duì)抗PC12細(xì)胞損傷的效果是一致的，說(shuō)明GSK-3β磷酸化水平下降可能是通過(guò)激活了上游的 Akt 活性，促使Akt磷酸化水平升高而引起，從而對(duì)P12細(xì)胞起到保護(hù)作用。

1Mohan ML，Jha BK，Gupta MK，etal.Phosphoinositide 3-kinase gamma inhibits cardiac GSK-3 independently of Akt〔J〕.Sci Signal，2013;6(259)：a4.

2呂麗娟，王艷芳，閆 墩，等.尖葉假龍膽中當(dāng)藥醇苷的制備及其抗烏頭堿致小鼠心律失常作用〔J〕.中國(guó)新藥與臨床雜志，2015;34(8)：630-5.

3Karran E，Mercken M，De Strooper B.The amyloid cascade hypothesis for Alzheimer's disease:an appraisal for the development of therapeutics〔J〕.Nat Rev Drug Discov，2011;10(9):698-712.

4代文博，曾 亮.PI3K/Akt信號(hào)通路與阿爾茨海默病關(guān)系的研究進(jìn)展〔J〕.現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2014;30(10)：1499-501.

5Kong J,Ren G,Jia N,etal.Effects of nicorandil in neuroprotective activation of PI3K/AKT pathways in a cellular model of Alzheimer's disease〔J〕.Eur Neurol,2013;70(3/4):233-41.

6Jha SK,Jha NK,Kar R,etal.p38 MAPK and PI3K/AKT signalling cascades in Parkinson's disease〔J〕.Int J Mol Cell Med,2015;4(2):67-86.

7Benek O,Aitken L,Hroch L,etal.A direct interaction between mitochondrial proteins and amyloid-beta peptide and its significance for the progression and treatment of Alzheimer's disease〔J〕.Curr Med Chem,2015;22(9):1056.

8Sancheti H,Akopian G,Yin F,etal.Age-dependent modulation of synaptic plasticity and insulin mimetic effect of lipoic acid on a mouse model of Alzheimer's disease 〔J〕.PLoS One,2013;8(7):e69830.

9Forlenza OV，e-Paula VJ，Diniz BS.Neuroprotective effects of lithium:implications for the treatment of Alzheimer's disease and related neurodegenerative disorders〔J〕.ACS Chem Neurosci，2014；5(6):443-50.

10呂麗娟，王艷芳，閆 暾，等.尖葉假龍膽中當(dāng)藥醇苷的制備及其抗烏頭堿致小鼠心律失常作用〔J〕.中國(guó)新藥與臨床雜志，2015;34(8)：630-5.

11倉(cāng)木決，黃宛雨.藏藥蒂達(dá)的藥理作用〔J〕.西藏科技，2017;(1)：40-1.

TheeffectofswertianolinontheexpressionsofGSK-3betaandAktinnervecellinjurymodelinducedbyAβ

ZHAOZhi-Ying,HUZhi-Qiang,GAOYang-Yang.

InnerMongoliaUniversityOfScience&Technology,BaotouMedicalCollege,Baotou014010,InnerMongolia,China

ObjectiveTo explore the effect of Swertianolin against the Aβ-inducing PC12 cells(Alzheimer's disease, AD) and evaluate the expression of glycogen synthase kinase(GSK)-3β and protein kinase B (Akt) after the treatment with Swertianolin to explore the mechanism involved in it.MethodsAD model was induced by 10 μmol/L Aβ in PC12 cells. Cells were divided into: control, Aβ-inducing (model), low, high dose of Swertianolin, LY294002 inhibitor, LY294002 inhibitor + high dose of Swertianolin groups.ResultsCompared with control group, the p-Akt protein level was significantly decreased (P<0.05), while the p-GSK-3 protein was significantly increased(P<0.05) in model group. Compared with model group, p-Akt protein was significantly increased and p-GSK-3β protein was significantly decreased in high and low dose groups (P<0.05). There were no significant differences in p-Akt and p-GSK-3β protein between high and the low dose groups (P>0.05). There were no significant differences in expressions of p-Akt and p-GSK-3β protein among LY294002 inhibitor, LY294002 inhibitor + high dose of Swertianolin groups and control group (P>0.05). There were significant differences in expressions of p-Akt and p-GSK-3β protein between LY294002 inhibitor + high dose of Swertianolin and low, high dose of Swertianolin groups.ConclusionsSwertianolin could reduce Aβ-inducing nerve injury in PC12 cell by increasing the expression of p-Akt protein and decreasing the activity of p-GSK-3βin the PI3K/Akt signaling pathway.

Swertianolin;Alzheimer's disease(AD);PI3K/Akt signaling pathway;Glycogen synthase kinase-3 beta (GSK-3 beta)

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81560195)；內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.2015MS0864)；包頭醫(yī)學(xué)院科學(xué)研究基金資助項(xiàng)目(No.BYJJ-YF201624)

胡志強(qiáng)(1975-)，男，在職碩士，副主任醫(yī)師，主要從事神經(jīng)損傷與保護(hù)研究?，F(xiàn)在烏蘭浩特市人民醫(yī)院工作。

趙志英(1970-)，男，教授，博士，主要從事神經(jīng)退行性疾病發(fā)病機(jī)制及防治研究。

R285.5

A

1005-9202(2017)20-4969-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.20.006

〔2017-03-17修回〕

(編輯 徐 杰)