梁建慶 何建成

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000)

1 上海中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院

病證結(jié)合帕金森病小鼠模型的構(gòu)建

梁建慶 何建成1

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000)

目的建立一種穩(wěn)定的、可操作性強(qiáng)的病證結(jié)合帕金森病(PD)小鼠模型。方法采用1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)腹腔注射法構(gòu)建PD動(dòng)物模型，同時(shí)設(shè)立正常對(duì)照組、復(fù)方地黃方組，從病因、癥狀、客觀指標(biāo)、藥物反證等方面對(duì)PD小鼠模型進(jìn)行綜合判斷，驗(yàn)證該模型的中醫(yī)證候?qū)傩?。結(jié)果模型組行為學(xué)、氧化應(yīng)激、酪氨羥化酶(TH)mRNA及蛋白等指標(biāo)與正常對(duì)照組差異顯著(P<0.01)。復(fù)方地黃方組可明顯改善PD小鼠的主觀癥狀和客觀指標(biāo)(P<0.01)。結(jié)論MPTP腹腔注射法制作的PD模型中醫(yī)證候?qū)傩允顷幪搫?dòng)風(fēng)證。

病證結(jié)合；動(dòng)物模型；帕金森病

在帕金森病(PD)的研究領(lǐng)域，缺乏病證結(jié)合動(dòng)物模型的支撐阻礙了中醫(yī)中藥的干預(yù)研究。本研究擬構(gòu)建病證結(jié)合小鼠PD模型。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 C57/BL6小鼠，雌性,體重(21.10±2.01)g，共48只，由上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)碼：SCXK(滬)2008-0016。SPF級(jí)飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物共分為正常對(duì)照組、模型組、復(fù)方地黃方組，每組16只。

1.2藥物和試劑 復(fù)方地黃方藥物組成：熟地20 g、白芍30 g、鉤藤15 g、珍珠母15 g，采用水煎法將藥液濃縮至0.59 g(生藥量)/0.4 ml,相當(dāng)于成人用量的2倍，4℃冰箱保存?zhèn)溆?，由上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥制劑實(shí)驗(yàn)室提供。1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP，Lot#SLBC4446V)為Sigma公司產(chǎn)品?？捡R斯亮藍(lán)法蛋白定量測(cè)試盒(批號(hào)：20140520)、丙二醛(MDA，批號(hào)：20140531)、谷胱甘肽(GSH，批號(hào)：20140520)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px，批號(hào)：20140516)、超氧化物歧化酶(SOD，批號(hào)：20140518)檢測(cè)試劑盒,購(gòu)自南京建成生物工程研究所?？俁NA提取(Trizol，批號(hào)：SK1312)、AMV First Strand cDNA合成酶試劑盒(批號(hào)：SK2445),購(gòu)自生工生物工程上海(股份)有限公司?？估野彼崃u化酶〔EP1533Y〕抗體(批號(hào)：ab75875),購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗(批號(hào)：HA1001),購(gòu)自杭州華安生物技術(shù)有限公司。

1.3實(shí)驗(yàn)儀器 多功能酶標(biāo)儀：Biotek Synergy 2，基因有限公司。熒光定量PCR儀：ABI 7500型，美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)中國(guó)公司。電熱恒溫水浴箱：HHS-1,上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠。高速冷凍離心機(jī)：GTR16-2，Beckman公司?；瘜W(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)：FC-M型，美國(guó)ProteinSimple。Western電泳儀：043BR41664，美國(guó)Bio-Rad公司。脫色搖床：TS-1型，江蘇海門市其林貝爾儀器有限公司。恒溫磁力攪拌器：81-2型，上海司樂(lè)儀器有限公司。超細(xì)勻漿機(jī)：F6/10，F(xiàn)luko(上海弗魯克流體機(jī)械制造有限公司)。移液器：Eppendorf公司。

1.4病證結(jié)合模型制備 48只C57/BL6小鼠，其中16只為正常對(duì)照組，其余32只參與模型制備，給MPTP 30 mg/kg腹腔注射，每日1次，連續(xù)注射5 d；予正常對(duì)照組腹腔注射等量生理鹽水〔1〕。造模共成功32只，采用隨機(jī)數(shù)字表法將32只小鼠分為模型組、復(fù)方地黃方組。復(fù)方地黃方組予復(fù)方地黃方灌胃(0.2 ml/10 g)；正常對(duì)照組、模型組予生理鹽水灌胃(0.2 ml/10 g)。每日1次，連續(xù)治療14 d。小鼠在最后一次行為學(xué)評(píng)價(jià)后斷頭處死，在冰上分離左右黑質(zhì)，-80℃冰箱保存。本實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物處置方法符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.5病證結(jié)合動(dòng)物模型的診斷標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)《中醫(yī)內(nèi)科學(xué)》中描述的顫震的證候表現(xiàn)及西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)確定〔2,3〕。

1.6行為學(xué)評(píng)價(jià) 各組小鼠于實(shí)驗(yàn)前4 d每天進(jìn)行2次爬桿、懸掛、游泳行為訓(xùn)練。在給藥期間到處死動(dòng)物前，每天于注射MPTP后或給藥后2 h，分別進(jìn)行爬桿、懸掛、游泳的行為檢測(cè)，連續(xù)19 d，觀察小鼠肢體運(yùn)動(dòng)功能的變化〔4,5〕。具體方法及評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：①爬桿實(shí)驗(yàn)。制作一個(gè)直徑1 cm,長(zhǎng)50 cm的鐵桿,纏上紗布以增加摩擦,將桿豎直放置,然后將小鼠頭朝下放置于桿頂,記錄小鼠從桿頂爬至桿底所用的時(shí)間。②懸掛實(shí)驗(yàn)。小鼠用兩前爪懸掛在一水平金屬線上(直徑1 mm,距地面30 cm),記錄懸掛時(shí)間及動(dòng)作。兩后爪都抓金屬線3分,一后爪抓2分,兩后爪都不抓1分,30 s內(nèi)跌落0分,依動(dòng)作遲緩酌情加減0.5分。③游泳實(shí)驗(yàn)。將受試小鼠放入一個(gè)20 cm×30 cm×20 cm 規(guī)格的水箱中,水溫32℃～35℃。在受試時(shí)間(10 min)內(nèi)能連續(xù)不斷游泳者計(jì)3分,大部分時(shí)間游泳偶爾漂浮者計(jì)2.5分,漂浮占50%以上者計(jì)2分,偶爾游泳者計(jì)1.5分,偶爾用后肢游動(dòng)并漂浮在一邊者計(jì)1分。

1.7氧化應(yīng)激 取小鼠黑質(zhì),制備腦組織勻漿液，檢測(cè)黑質(zhì)中MDA、GSH、GSH-Px、SOD含量。按南京建成生物工程研究所試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行操作。

1.8TH mRNA 取小鼠黑質(zhì)，提取總RNA，合成cDNA模板，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。TH引物序列(Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì))：正向：5'-GGACGGCGACAG AGTCTCAT-3'，反向：5'-AGCTTCCGACGCTGGCGATA-3'，擴(kuò)增片段為512 bp。引物β-actin:正向：5'-TGTCCCTGTATGCCTCTGGT-3'，反向：5'-TTGATGTCACGCACGATTTC-3'，擴(kuò)增片段為217 bp。PCR擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min。相對(duì)定量2-△△Ct法分析各樣本目的基因。

1.9TH蛋白 取小鼠黑質(zhì)，Western印跡法檢測(cè)TH蛋白表達(dá)。檢測(cè)步驟是：蛋白質(zhì)抽提、BCA法蛋白濃度測(cè)定、電泳、半干轉(zhuǎn)膜、免疫反應(yīng)、化學(xué)發(fā)光法顯影，用AlphaView 圖像分析軟件對(duì)掃描圖像的目標(biāo)條帶進(jìn)行灰度分析，各目的條帶與β-actin的灰度值比值為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS18.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、方差分析及χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組行為學(xué)變化 與正常對(duì)照組比較，模型組出現(xiàn)不同程度的肢體運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力下降，爬桿、懸掛及游泳實(shí)驗(yàn)指標(biāo)均存在顯著差異(P<0.01)；與模型組比較復(fù)方地黃方組，可明顯改善各指標(biāo)(P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 各組行為學(xué)變化

與正常對(duì)照組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.01，下表同

2.2各組氧化應(yīng)激指標(biāo)變化 與正常對(duì)照組比較，模型組MDA明顯升高，GSH、GSH-Px、SOD明顯下降(P<0.01)；與模型組比較，復(fù)方地黃方組MDA、GSH、GSH-Px、SOD均顯著改善(P<0.01)。見(jiàn)表2。

表2 各組氧化應(yīng)激指標(biāo)、TH mRNA及蛋白變化

2.3各組TH mRNA及蛋白變化 與正常對(duì)照組相比，模型組TH mRNA及蛋白明顯下降(P<0.01)；與模型組比較，復(fù)方地黃方組可明顯改善TH mRNA及蛋白的表達(dá)(P<0.01)。見(jiàn)表2。

2.4各組TH 蛋白變化 與正常對(duì)照組相比，模型組TH 蛋白明顯下降(P<0.01)；復(fù)方地黃方組與模型組比較可明顯改善TH 蛋白的表達(dá)(P<0.01)，見(jiàn)表2，圖1。

圖1 各組黑質(zhì)TH蛋白Western印跡

3 討 論

1983年，Langston報(bào)道了人類因一種不完全合成的海洛因中毒后，產(chǎn)生了嚴(yán)重的PD臨床表現(xiàn)。后來(lái)研究者證明這種藥物的化學(xué)成分是MPTP。1986年Bankiewicz等給猴一側(cè)頸動(dòng)脈內(nèi)注入MPTP，只摧毀同側(cè)半球的黑質(zhì)，研發(fā)出了一種半側(cè)PD動(dòng)物模型，每只模型猴都有一個(gè)作為對(duì)照的未損傷半球和一個(gè)同體的用來(lái)測(cè)試的損傷半球，實(shí)現(xiàn)在一只猴子身上既能測(cè)試，又有對(duì)照〔6〕。這個(gè)模型對(duì)PD的實(shí)驗(yàn)研究極為有用?，F(xiàn)已證實(shí)MPTP是一種針對(duì)多巴胺(DA)能神經(jīng)元的神經(jīng)毒素，對(duì)MPTP敏感的動(dòng)物除靈長(zhǎng)類外,嚙齒類特別是某些種屬的小鼠,如C57BL/6,能夠復(fù)制出大部分PD生化及病理?yè)p害特征,至今仍是PD研究的首選動(dòng)物模型之一。MPTP有高度的脂溶性，容易透過(guò)血腦屏障，進(jìn)入腦組織后被膠質(zhì)細(xì)胞中的酸性細(xì)胞器捕獲,在單胺氧化酶(MAO)-B作用下轉(zhuǎn)化為離子化的甲基-苯基-雙氫吡啶(MPDP)，進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為甲基-苯基吡啶離子(MPP+),由DA轉(zhuǎn)運(yùn)體載入DA能神經(jīng)元胞體內(nèi)，再進(jìn)入線粒體，抑制線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ的活性，使三磷酸腺苷(ATP)合成減少，自由基生成增加，使細(xì)胞內(nèi)乳酸堆積、Ca2+平衡紊亂、一氧化氮(NO)合成增加、GSH合成減少，這些因素均可增加自由基的大量生成，削弱細(xì)胞對(duì)自由基損傷的抵抗能力，最終導(dǎo)致DA能神經(jīng)元變性死亡〔7〕。

按照病證結(jié)合動(dòng)物模型的診斷標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)照模型組小鼠的臨床癥狀，我們可以推斷PD模型小鼠的證候?qū)傩浴Ｃ看谓o小鼠腹腔注射MPTP后數(shù)分鐘至半小時(shí)，可出現(xiàn)全身抖動(dòng)、肌肉震顫、豎毛、豎尾征(即尾巴強(qiáng)直上翹)、牙齒顫動(dòng)、煩躁亂動(dòng)等癥狀，類似PD患者震顫、肌強(qiáng)直等癥狀，西醫(yī)理論認(rèn)為此種震顫可能與基底節(jié)功能受損有關(guān)。客觀指標(biāo),小鼠毛發(fā)干枯，大便干燥呈顆粒狀，小便量少色黃，顯微舌象是紅舌。平均每只小鼠飲水量10 ml/24 h。綜合癥狀體征，中醫(yī)解釋為藥邪(MPTP)內(nèi)侵，斫傷肝腎陰液，繼發(fā)水虧火旺，陰不斂陽(yáng)，筋膜失養(yǎng)，虛風(fēng)內(nèi)動(dòng)，證明該模型的證候?qū)傩允顷幪搫?dòng)風(fēng)證，相當(dāng)于西醫(yī)的PD。

研究證明，DA能神經(jīng)元含有神經(jīng)遞質(zhì)DA，DA在代謝過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生氧自由基(OFR)，容易使DA能神經(jīng)元處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，極易產(chǎn)生氧化損傷〔8〕。TH是DA合成的限速酶，TH蛋白由兩部分構(gòu)成，N端為調(diào)節(jié)區(qū)域，C端為催化活性區(qū)，其所有的活性催化殘基都位于其C-端的330個(gè)氨基酸中〔9〕。如前所述，TH在DA的合成調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用。在人體內(nèi)，一部分DA存在于黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)中，當(dāng)TH的質(zhì)或量發(fā)生變化都會(huì)干擾L-DOPA的生物合成，導(dǎo)致PD的發(fā)生〔10〕。這就表明，PD患者處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，TH表達(dá)量顯著減少為該病的顯著特征。

復(fù)方地黃方由熟地黃、白芍、鉤藤、珍珠母組成，方中熟地性溫味甘，歸肝腎經(jīng)，善補(bǔ)益腎精、滋陰養(yǎng)血、固本培元，故為君藥。白芍性味苦酸微寒，歸肝脾經(jīng)，養(yǎng)肝血、滋肝陰、柔肝氣，為養(yǎng)血濡筋、緩急止顫之良藥，為臣藥。鉤藤甘涼，入肝心經(jīng)，功效熄風(fēng)定驚，為佐藥。珍珠母性味咸寒，歸肝心經(jīng)，可滋陰潛陽(yáng)、定驚止顫、養(yǎng)血舒筋，柔肝與熄風(fēng)兩者兼顧，滋陰與養(yǎng)血并療，乃平肝潛陽(yáng)之要藥，為使藥。上述諸藥合用，可補(bǔ)益肝腎、滋陰熄風(fēng)。根據(jù)“方證相應(yīng)，以方測(cè)證”的理論，復(fù)方地黃方的適應(yīng)證應(yīng)是陰虛動(dòng)風(fēng)證。藥物反證,復(fù)方地黃方灌胃后PD小鼠的臨床癥狀及客觀指標(biāo)明顯改善。以方測(cè)證，MPTP小鼠PD模型的中醫(yī)證候?qū)傩允顷幪搫?dòng)風(fēng)證。

上世紀(jì)60年代鄺安堃教授發(fā)現(xiàn)過(guò)量腎上腺皮質(zhì)激素可誘發(fā)小鼠呈現(xiàn)類似中醫(yī)陽(yáng)虛癥狀以來(lái)，證候動(dòng)物模型的探索已逾50年〔11〕。本文所建病證結(jié)合動(dòng)物模型具有疾病和證候的雙重特征，為PD動(dòng)物模型首次提供了證候物質(zhì)基礎(chǔ)。通過(guò)以方測(cè)證，進(jìn)一步證實(shí)該模型的合理性，填補(bǔ)了這一研究領(lǐng)域的空白。

1梁建慶.陰虛動(dòng)風(fēng)證帕金森病模型鼠神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子與神經(jīng)遞質(zhì)表達(dá)的變化及復(fù)方地黃制劑的干預(yù)作用〔D〕.上海:上海中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,2015.

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EstablishmentofamicemodelofParkinson'sdiseasewithcombinationofdiseaseandsyndromeforpreliminarystudy

LIANGJian-Qing,HEJian-Cheng.

SchoolofBasicMedicine,GansuUniversityofTCM，Lanzhou730000,Gansu,China

ObjectiveTo establish of a steady and simplify operation mice model of Parkinson's disease(PD) with combination of disease and syndrome,in order to meet the demand of study medication on treatment of PD evaluation.MethodsThe animal model of PD had been induced by intraperitoneal injection of MPTP.At the same time normal control,compound rehmannia prescription groups were set up to estimate PD model from the etiology,symptoms,objective index,drugs prove therapy,in order to investigate the syndrome properties of this mice model.ResultsThere were statistically significant differences in behavior,oxidative stress,TH mRNA and protein between model and normal control groups(P<0.01).Compound rehmannia prescription group could significantly improve the subjective symptoms and objective indexes(P<0.01).ConclusionsThe syndrome property of PD mice model induced by intraperitoneal injection of MPTP is mainly Yin Xu Dong Feng Zheng.

The combination of disease and syndrome；Animal model；Parkinson's disease

國(guó)家自然科學(xué)基金(No.81573899,No.81670767)；上海市科委新藥開(kāi)發(fā)研究項(xiàng)目(No.12401900302)；甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中青年科研基金(No.ZQ2015-17)；敦煌醫(yī)學(xué)與轉(zhuǎn)化省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題(No.DHYX151608)

何建成(1966-)，男，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事中藥治療帕金森病研究。

梁建慶(1976-)，男，副教授，在讀博士后，主要從事中醫(yī)證候動(dòng)物模型研究。

R742

A

1005-9202(2017)20-4961-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.20.003

〔2016-11-17修回〕

(編輯 曹夢(mèng)園)