曲 強 紀(jì)祿風(fēng) 石向慧 王利紅 伊 琳

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，甘肅 蘭州 730000)

1 甘肅省人民醫(yī)院

·基礎(chǔ)研究·

當(dāng)歸揮發(fā)油上調(diào)自發(fā)性高血壓大鼠TLR3，TRIB1基因的表達(dá)

曲 強1紀(jì)祿風(fēng) 石向慧 王利紅 伊 琳

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，甘肅 蘭州 730000)

目的通過研究當(dāng)歸揮發(fā)油對自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)肝臟組織中TRIB1、TLR3 mRNA水平表達(dá)的影響，探討當(dāng)歸揮發(fā)油對SHR脂代謝的改善作用及其機制。方法將8周齡雄性SHR隨機分為模型組，當(dāng)歸揮發(fā)油組低劑量組(含5%的揮發(fā)油)，當(dāng)歸揮發(fā)油組高劑量組(含10%的揮發(fā)油)和阿托伐他汀鈣組，并用同周齡的Wistar 大鼠作為正常對照組。各組大鼠分別灌胃4 w后，測定給藥前后血壓的變化。取大鼠肝臟組織，HE染色觀察各組大鼠肝臟組織的結(jié)構(gòu)變化，QT-PCR檢測TRIB1、TLR3 mRNA水平的表達(dá)。結(jié)果當(dāng)歸揮發(fā)油能降低SHR的血壓。TRIB1，TLR3在各用藥組表達(dá)上調(diào)，且呈差異性表達(dá)，在揮發(fā)油組不同劑量組之間亦呈差異性上調(diào)表達(dá)。結(jié)論當(dāng)歸揮發(fā)油對SHR脂代謝有調(diào)節(jié)作用，通過上調(diào)TRIB1、TLR3 mRNA水平抑制動脈粥樣硬化而降壓，從而影響脂代謝。

當(dāng)歸揮發(fā)油；脂代謝；TRIB1；Toll樣受體3

高血壓和脂代謝異常都是動脈硬化的危險因素，當(dāng)二者合并時，動脈硬化的危險性增加〔1〕。當(dāng)歸為甘肅省道地藥材，其味辛、甘，性微溫，歸心、肝、脾三經(jīng)，尤以岷縣當(dāng)歸為佳。據(jù)古籍記載，當(dāng)歸具有調(diào)經(jīng)止痛、補血活血、潤腸通便的功效。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)證明當(dāng)歸有明顯的降壓作用，對血脂和免疫都具有雙向調(diào)節(jié)作用，且對致粥樣硬化指數(shù)和血液流變學(xué)指標(biāo)均有一定的影響。當(dāng)歸作為抗高血壓和調(diào)節(jié)脂代謝藥物，對減輕動脈粥樣硬化、提高生活質(zhì)量有積極的臨床意義〔2〕。

1 材料與方法

1.1動物選擇與分組 32只8周齡雄性自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)(體重180～220 g)，SPF級，購自北京維通利華實驗動物有限責(zé)任公司，動物合格證號SCXK(京)2012-0001，動物檢疫合格證No.1100562901。8只正常血壓 Wistar 大鼠(體重180～220 g)，雄性，SPF級，購自甘肅中醫(yī)學(xué)院實驗動物中心〔動物合格證號SYXK(甘) 2011-0001〕。隨機分為模型組與當(dāng)歸治療組(低、高)，阿托伐他汀鈣組，Wistar 大鼠為正常對照組，每組8只。試驗程序和方法得到甘肅中醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)會批準(zhǔn)。

1.2藥物與試劑選擇 當(dāng)歸購于甘肅省岷縣，由甘肅中醫(yī)學(xué)院科研實驗中心提取揮發(fā)油，采用CO2超臨界萃取法，阿托伐他汀鈣片(國藥準(zhǔn)字H19990258)，TRIB1，TLR3引物(生工生物工程上海有限公司)，QT-PCR儀(7900，Applied Biosystems company)，酶標(biāo)儀(Thermo company),TRIzol，氯仿，異丙醇，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)，QT-PCR試劑盒(TaKaRa)，Power Lab ML125/R無創(chuàng)尾動脈血壓器(日本)，低溫?fù)u床，低溫離心機(Dynamica company)，紫外分光光度計(Quawell company)。

1.3方法

1.3.1給藥方法和分組 將SHR和Wistar大鼠在SPF級實驗室適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后，于給藥前測定各組大鼠的血壓，采用Power Lab ML125/R無創(chuàng)血壓測定分析系統(tǒng)測定清醒狀態(tài)下鼠尾動脈收縮壓，連續(xù)測定1 w，待各組大鼠適應(yīng)環(huán)境后，模型組和正常對照組灌胃生理鹽水，不給任何藥物。當(dāng)歸治療組、阿托伐他汀鈣組根據(jù)實驗鼠體表面積最終確定給藥劑量，當(dāng)歸低、高劑量組分別灌胃37 mg·kg-1·d-1(含5%的揮發(fā)油)，100 mg·kg-1·d-1(含10%的揮發(fā)油)，阿托伐他汀鈣組為60 mg·kg-1·d-1。每周給藥7 d，每天定時給藥，連續(xù)4 w，并隨體重變化每周按時調(diào)整給藥劑量。每周的第7天測定血壓，每周于同一時間測定，每只每次測定5次，取平均值。試驗期間，各組大鼠標(biāo)準(zhǔn)飲食，自由飲水。

1.3.2肝臟標(biāo)本的制備 給藥4 w后，將動物禁食不禁水12 h，按照體重的不同，分別進(jìn)行3%水合氯醛(避光)腹腔注射，麻醉后將大鼠頸椎脫臼處死，開腹取出肝臟組織100 mg，將肝臟分為上中下三部分，中部標(biāo)本經(jīng)10%甲醛溶液固定，石蠟組織包埋對肝臟組織進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色，觀察肝臟組織病理學(xué)切片變化。

1.3.3肝臟總RNA的提取與檢測 各組大鼠處死后，焦碳酸二乙酯(DEPC)水沖洗后，取肝臟組織50 mg，按TRIzol一步法提取總RNA，紫外分光光度計測其純度與濃度，各組大鼠260/280的比值在1.8～2.0，說明其純度相對較好。1%瓊脂糖變性凝膠電泳測其完整性?？俁NA提取后，按照TaKaRa公司逆轉(zhuǎn)錄說明書PrimeSciptTMRT Waster MIX 操作進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，各引物序列如下：TRIB1前向：5′CCTTGGGGTGATGCTCTACA3′,反向：5′TGGCTTTGGGGGAAACAT3′；TLR3前向：5′TTAGCAACCAGCAACAGCAC3′，反向：5′GCCAAGAGAAGGCATCGTTA3′；GAPDH前向：5′AGGCCGGTGCTGAGTATGTC3′，反向：5′TGCCTGCTTCACCACCTTCT3′。逆轉(zhuǎn)錄條件：37℃ 15 min(反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)) 85℃ 5 s(反轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng))4℃ 30 min，-20℃保存。逆轉(zhuǎn)錄結(jié)束后，應(yīng)用SYBR?Premix Ex TaqTMII說明書進(jìn)行QT-PCR檢測，QT-PCR檢測反應(yīng)體系25 μl，反應(yīng)條件：預(yù)孵育95℃ 30 s；擴增95℃ 5 s，60℃ 30 s，75℃ 30 s，45個循環(huán)；最后延伸階段結(jié)束。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS20.0軟件，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用ANOVA方差分析，并行兩兩比較。

2 結(jié) 果

2.1各組用藥前后血壓的變化 模型組收縮壓顯著高于正常對照組(P<0.05)；阿托伐他汀鈣組血壓與模型組對比無明顯改變(P>0.05)；連續(xù)灌服當(dāng)歸揮發(fā)油，當(dāng)歸揮發(fā)油組(高、低)血壓明顯低于模型組(P<0.05)，當(dāng)歸揮發(fā)油各組(高、低)差異明顯(P<0.05)。見表1。

2.2當(dāng)歸揮發(fā)油對各組大鼠肝臟組織形態(tài)學(xué)的影響 正常對照組肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞正常。模型組可見脂肪變性，肝細(xì)胞內(nèi)有小泡。與模型組相比，當(dāng)歸組可見肝竇擴張。當(dāng)歸揮發(fā)油高劑量組可見糖原分解，脂肪變性消失。阿托伐他汀鈣組未見明顯異常。見圖1。

2.3當(dāng)歸揮發(fā)油對各組大鼠肝臟TRIB1、TLR3 mRNA水平表達(dá)的影響 與正常對照組(1.00±0.04，1.00±0.14)比較，TLR3、TRIB1在模型組(0.85±0.13，1.35±0.11)均未見明顯異常，TRIB1在當(dāng)歸組(低、高)、阿托伐他汀鈣組表達(dá)上調(diào)(2.89±0.35，4.56±0.59，3.53±0.37)，且均差異性表達(dá)上調(diào)(P<0.05)，TRIB1在當(dāng)歸揮發(fā)油組間亦為差異性表達(dá)上調(diào)(P<0.05)。TLR3在當(dāng)歸組(低、高)及阿托伐他汀各組間表達(dá)上調(diào)(2.89±0.33，3.56±0.57，2.53±0.33)，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 當(dāng)歸對SHR尾動脈收縮壓的影響

與正常對照組比較:1)P<0.01;與模型組比較:2)P<0.01

圖1 當(dāng)歸揮發(fā)油對各組大鼠肝臟組織形態(tài)學(xué)的影響(HE,×400)

3 討 論

脂質(zhì)代謝紊亂可以作為高血壓發(fā)病的危險因素，兩者常互為因果〔3〕，特別是在肥胖和老年人中表現(xiàn)明顯。當(dāng)歸具有的降壓作用已經(jīng)被證實〔3〕。近期在國內(nèi)的文獻(xiàn)報道中也證實了當(dāng)歸對高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠模型脂代謝的作用〔4〕。在本課題小組以往的研究中，發(fā)現(xiàn)TLR3及TRIB1基因表達(dá)上調(diào)，并且是差異性的表達(dá)上調(diào)〔5〕，故推測當(dāng)歸揮發(fā)油可能通過影響脂代謝進(jìn)而抑制動脈硬化來達(dá)到降壓的目的。本次實驗繼續(xù)選用SHR為模型，阿托伐他汀鈣作為陽性對照藥物，既保證了與前期試驗的一致性，同時又有創(chuàng)新性。TLR3可以作為抑制動脈硬化的因子，TRIB1與血脂水平密切相關(guān)。TLR3作為介導(dǎo)天然免疫反應(yīng)的一類模式識別受體，在動脈粥樣硬化中發(fā)揮著重要的作用。TLR3基因缺失后可以加快載脂蛋白(Apo)E缺陷的小鼠動脈粥樣硬化的進(jìn)程，提示TLR3信號通路對血管壁可能存在保護作用〔6〕。TRIB1基因是近年來發(fā)現(xiàn)的一個新的基因，TRIB1基因多態(tài)性與血脂水平有關(guān)〔7〕。 Bauer等〔8〕發(fā)現(xiàn)在敲除小鼠的TRIB1基因后，小鼠體內(nèi)甘油三酯含量增加，脂肪基因的轉(zhuǎn)錄生成加快和新生脂肪增多，TRIB1調(diào)節(jié)肝脂肪生成C/EBPa，通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，進(jìn)而轉(zhuǎn)錄上調(diào)TRIB1，提示TRIB1對肝臟的保護性作用。根據(jù)本研究結(jié)果推測，SHR在經(jīng)過當(dāng)歸揮發(fā)油的治療后，TLR3，TRIB1發(fā)生的上調(diào)變化可能通過某些信號通路或者轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)生作用。

1孫雅遜，胡申江，張志杰，等.阿托伐他汀改善自發(fā)性高血壓大鼠的心肌脂質(zhì)代謝和抑制心肌肥厚〔J〕.中華高血壓雜志，2006；14(8)：632-5.

2尹 輝.當(dāng)歸化學(xué)成分及藥理活性研究進(jìn)展〔J〕.重慶科技學(xué)院學(xué)報(自然科學(xué)版)，2015；17(1)：100-1，112.

3Stevens W，Penevat D，Li JZ，etal.Estimating the future burden of cardiovascular disease and the value of lipid and blood pressure control therapies in China〔J〕.BMC Health Serv Res，2016；16：175.

4Zhong T，Zhang H，Duan X，etal.Anti-obesity effect of radix Angelica sinensis and candidate causative genes in transcriptome analyses of adipose tissues in high-fat diet-induced mice〔J〕.Gene，2017；599(1)：92-8.

5伊 琳，趙 昕，李 屹.當(dāng)歸對自發(fā)性高血壓大鼠腦組織Tnfaip8l2、Ahsg及Tlr3基因表達(dá)的影響〔J〕.中國動脈硬化雜志，2013；21(10)：891-3.

6Baiersdrfer M，Schwarz M,Seehafer K,etal.Toll-like receptor 3 me-diates expression of clusterin/apolipoprotein J in vascular smooth muscle cells stimulated with RNA released from necrotic cells〔J〕.Exp Cell Res，2010；316(11):3489-500.

7Varbo A，Benn M，Tybjrg-Hansen A，etal.TRIB1 and GCKR polymorphisms，lipid levels，and risk of ischemic heart disease in the general population 〔J〕.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2011；31(2)：451-7.

8Bauer RC，Sasaki M，Cohen DM，etal. Tribbles-1 regulates hepatic lipogenesis through posttranscriptional regulation of C/EBPα〔J〕.J Clin Invest，2015；125(10)：3809-18.

Angelicanaphthaup-regulatingthegeneexpressionsofTLR3,TRIB1inspontaneouslyhypertensiverats

QUQiang,JILu-Feng,SHIXiang-Hui,etal.

CollegeofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine,GansuUniversityofTraditionalChineseMedicine,Lanzhou730000,Gansu,China

ObjectiveTo observe the Chinese angelica naphtha on liver tissue TRIB1, TLR3 mNRA expression in spontaneously hypertensive rats (SHRs) and explore the effect of angelica naphtha on lipid metabolism and its mechanism.Methodsthe 8-week-old male SHR were randomly divided into model, low(5% angelica naphtha), high dose of angelica naphtha(10% angelica naphtha) and atorvastatin groups, and the Wistar rats with the same age were selected as normal control group. Changes of blood pressure were measured before and after 4 weeks of intragastric administration administration. Liver tissue was taken and HE staining was used to observe the structural changes.ResultsAngelica naphtha could reduce the blood pressure of SHRs. TRIB1, TLR3 expressions were up-regulated in treatment groups, and there were significant differences between different dose groups.ConclusionsAngelica naphtha plays a regulatory role in SHR lipid metabolism by raising the TRIB1, TLR3 mRNA expressions and thus inhibits atherosclerosis and affects lipid metabolism.

Angelica naphtha;Lipid metabolism;TRIB1;TLR3

國家自然科學(xué)基金(No.81460669)；甘肅省中醫(yī)藥管理局項目(GZK-2016-40)

伊 琳(1971-)，女，博士，副教授，主要從事中西醫(yī)結(jié)合心腦血管疾病的防治研究。

曲 強(1971-)，女，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合心腦血管疾病的防治研究。

R394.3

A

1005-9202(2017)20-4957-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.20.001

〔2017-03-17修回〕

(編輯 袁左鳴)