陳晨，陸璨，陸前進

（1.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院 胸外科，湖南 長沙 410011；2.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院 口腔醫(yī)學(xué)中心，湖南 長沙 410008；3.醫(yī)學(xué)表觀基因組學(xué)湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410011）

.論 著.

肺腺癌組織與血清中半胱氨酸雙加氧酶1基因啟動子區(qū)甲基化在早期肺癌診斷中的意義

陳晨1，陸璨2，陸前進3

（1.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院 胸外科，湖南 長沙 410011；2.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院 口腔醫(yī)學(xué)中心，湖南 長沙 410008；3.醫(yī)學(xué)表觀基因組學(xué)湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410011）

目的 觀察肺腺癌患者腫瘤組織和血清中半胱氨酸雙加氧酶1（CDO1）啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)，探索其與肺腺癌發(fā)生進展的關(guān)聯(lián)，及CDO1基因甲基化作為肺腺癌血清學(xué)標記物的可能性。方法 收集早期肺腺癌患者和肺部良性腫瘤組織及血清樣本，采用基于磁珠的DNA提取和亞硫酸氫鈉修飾技術(shù)，結(jié)合實時熒光定量PCR技術(shù)檢測CDO1基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)。結(jié)果 肺腺癌組織中CDO1基因甲基化檢測率為71.4%（25/35），對應(yīng)的血清檢出率為51.4%（18/35）。對照組中CDO1基因甲基化率為10.0%（2/20），對應(yīng)的血清檢出率為5.0%（1/20），腫瘤組與對照組之間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。從肺腺癌患者血清檢測CDO1啟動子區(qū)甲基化與從腫瘤組織中直接檢測其結(jié)果具有很高的一致性（r =0.732，P ＜0.05）。結(jié)論 肺腺癌組織和血清DNA中存在CDO1基因啟動子區(qū)的異常甲基化狀態(tài)，且具有極高的特異性。血清游離DNA 的甲基化檢測可能為肺腺癌的早期診斷、復(fù)發(fā)監(jiān)測和預(yù)后判斷提供全新的臨床思路。

肺癌；甲基化；DNA；血清

肺癌是目前世界上最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率在男性腫瘤患者中居于第1位，在女性腫瘤患者中占第2位[1]。按照組織病理學(xué)分型肺癌可分為非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）和小細胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC），其中NSCLC約占肺癌總發(fā)病率的90%。然而近年來隨著生活方式、空氣污染等因素的改變，肺腺癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，并逐漸成為中國最主要的肺癌類型[2]。肺腺癌的發(fā)病通常以周圍型肺癌為主，早期無明顯癥狀，轉(zhuǎn)移率極高，預(yù)后很差。因此早期診斷對肺腺癌的治療和預(yù)后至關(guān)重要。

半胱氨酸雙加氧酶1（cysteine dioxygenase 1,CDO1）是一種金屬蛋白酶，其主要功能是參與半胱氨酸的調(diào)節(jié)和?；撬岷铣?。CDO1通常分布于細胞質(zhì)中，由位于5q23.2的CDO1基因轉(zhuǎn)錄表達[3]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌、乳腺癌及腦膠質(zhì)瘤中的發(fā)生過程中CDO1存在著表達失活，其啟動子區(qū)高甲基化是導(dǎo)致基因功能異常的重要因素[4-6]。抑制CDO1基因啟動子區(qū)高甲基化可以恢復(fù)CDO1的表達，抑制腫瘤細胞生長。由此認為CDO1具有腫瘤抑癌基因的功能。在對肺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，NSCLC中存在著普遍的CDO1啟動子區(qū)高甲基化現(xiàn)象，認為CDO1的甲基化對于NSCLC具有一定的特異性[7]。本研究通過觀察肺腺癌患者腫瘤組織和血清中CDO1啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)，探索其與肺腺癌發(fā)生進展的關(guān)聯(lián)，及血清游離DNA中CDO1基因甲基化作為肺腺癌血清學(xué)標記物的可能性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

實驗組臨床標本取自2016年7月‐12月在本院胸外科首次接受手術(shù)治療并確診為早期肺腺癌的35例患者的腫瘤組織及血清樣本。記錄病例一般臨床資料、病理分期，組織學(xué)分型等信息。所有患者術(shù)前均未接受任何放、化療等其他治療。對照組組織標本取自20例同時期接受手術(shù)治療的肺良性腫瘤患者的組織和血清（錯構(gòu)瘤4 例，結(jié)核球10例，血管瘤2例，炎性假瘤4例）。實驗組及對照組組織標本離體后立即置于液氮內(nèi)保存?zhèn)溆?。標本則在患者空腹12 h后于次日晨間抽取，高速離心機中3 000 r/min離心10 min，吸取上層血清，封裝于2 ml凍存管中液氮內(nèi)保存。本研究經(jīng)過本院倫理委員會批準后實施，研究開始前受試者或其委托人已簽署相關(guān)知情同意書。

1.2 檢測方法

1.2.1 DNA樣本提取和亞硫酸氫鈉修飾 為最大程度檢測血清游離DNA中CDO1甲基化情況，課題組采用基于磁珠的DNA提取和亞硫酸氫鈉修飾技術(shù)[7-8]，簡述如下：取血清樣本1 ml，加入組織裂解液及蛋白酶K于55℃消化3 h后，加入磁珠（Promega公司），充分混勻后，直接采用磁珠抽提DNA；并采用Zymo公司EZ DNA Methylation kit直接在磁珠上對DNA進行亞硫酸氫鈉修飾，最終獲得可直接用于后續(xù)PCR擴增的DNA樣本。

取腫瘤標本中心部位組織10 mg，加入適量液氮快速充分研磨至勻漿。加入組織裂解液及蛋白酶K過夜消化后，處理步驟同上。

1.2.2 甲基化特異性實時定量聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction, PCR） 擴 增 CDO1基因和內(nèi)參基因β-actin，擴增引物由上海Invitrogen公司合成，具體引物序列如下：CDO1：上游引物5'-AGGCGGGGAGATTTTGCG-3'，下游 引 物：5'-CCTAAAACGCCGAAAACAACG-3'，探 針：CGGTTTACGCGTATATTTTCGGTTTT；β-actin： 上 游 引 物 5'-TAGGGAGTATAT AGGTTGGGGAAGTT-3'， 下 游 引 物：5'-AACACACAATAACAAACACAAATTCAC-3'，探 針：CGACTGCGTGTGGGGTGGTGATGG AGGAGGTTTAGGCAGTCG。PCR反 應(yīng) 體 系：10×PCR 緩 沖 液 2.5 μl；10 mmol/L dNTP混 合液 0.5 μl；50 mmol/L MgCl20.8 μl；Platinum Taq DNA 聚合酶 0.2 μl；上游及下游引物各 1 μl；2 μl修飾后的 DNA 模板；雙蒸水 17 μl；總體積共25 μl。反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性5 min；94℃變 性 30 s，60℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，共循環(huán)45個周期；72℃終末延伸5 min。采用2-ΔCT法判斷實時定量PCR陽性結(jié)果[7]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。兩組間均數(shù)的比較用獨立樣本t檢驗，組間比較采用χ2檢驗或Fisher's精確檢驗，采用Pearson法進行相關(guān)性分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

表1示術(shù)前腫瘤組與對照組在年齡、性別上差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

肺腺癌組織中CDO1基因甲基化檢測率為71.4%（25/35），對應(yīng)的血清檢出率為51.4%（18/35）。對照組肺良性腫瘤中CDO1基因甲基化率為10.0%（2/20），對應(yīng)的血清檢出率為5.0%（1/20），腫瘤組與對照組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。提示CDO1啟動子區(qū)甲基化對肺腺癌具有極高的特異性。此外，在肺腺癌組織中CDO1基因甲基化為陽性的25例患者中，對應(yīng)的血清檢出17例為甲基化陽性；而肺腺癌組織CDO1基因檢測為陰性的10例患者中，只有1例在血清中檢測出CDO1甲基化陽性。血清檢測CDO1啟動子區(qū)甲基化與從腫瘤組織中直接檢測具有很高的一致性（r =0.732，P＜0.05）。

表1 CDO1基因甲基化與肺腺癌臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

已有研究證實CDO1作為一種具有抑癌基因功能特征的基因，其基因啟動子區(qū)高甲基化與食管鱗癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、直腸癌等腫瘤的預(yù)后密切相關(guān)。研究認為半胱氨酸代謝途徑在腫瘤細胞的侵襲過程中發(fā)揮著重要作用。CDO家族主要包括CDO1和CDO2兩個成員[4-6]。CDO2是一種膜結(jié)合蛋白；CDO1是半胱氨酸分解代謝過程的關(guān)鍵酶，主要分布于細胞質(zhì)中，其基因啟動子區(qū)異常高甲基化引起基因表達下調(diào)，從而影響半胱氨酸代謝，細胞代謝異常，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

基于TCGA數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，NSCLC中存在著廣泛的CDO1啟動子區(qū)域高甲基化，而在正常肺組織中這一情況則很少見[7]。本研究顯示，實驗組中CDO1基因啟動子區(qū)甲基化發(fā)生率為71.4%（25/35），而對照組標本中僅為10.0%（2/20），這提示CDO1啟動子區(qū)甲基化可能是肺腺癌發(fā)生發(fā)展的重要事件。

研究顯示惡性腫瘤患者外周血中的游離DNA含量較高，這些小片段，半衰期短，極易降解的游離DNA多是由凋亡或壞死的腫瘤細胞釋放而來。某些腫瘤特異改變的DNA片段在腫瘤細胞凋亡后會釋放入循環(huán)血，如能夠檢測到這些特異性的基因異常，將極大地改善腫瘤的早期診斷和監(jiān)測。目前已經(jīng)可以從外周循環(huán)血中檢測到腫瘤相關(guān)的基因突變，如EGFR，Kras等，然而DNA甲基化的檢測則是一個難點。傳統(tǒng)的亞硫酸氫鈉修飾過程中會損失大量的DNA，這對于原本就很微量的循環(huán)血游離DNA檢測而言，在很長時間里都是難以逾越的障礙。本研究采用的基于磁珠的DNA提取和亞硫酸氫鈉修飾技術(shù)，在亞硫酸氫鈉修飾過程中最大程度減少了DNA的損失，并采用實時定量PCR技術(shù)檢測DNA甲基化信號，極大地增強了檢測的靈敏度和特異性[7-9]。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)血清檢測CDO1啟動子區(qū)甲基化與直接從腫瘤組織中檢測在結(jié)果上具有極高的一致性，這提示血清檢測DNA中CDO1甲基化對肺癌進行診斷和監(jiān)測是可行的。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)肺腺癌組織和血清DNA中存在CDO1基因啟動子區(qū)的異常甲基化狀態(tài)，且具有極高的特異性?；诖胖榈腄NA提取和亞硫酸氫鈉修飾技術(shù)在血清游離DNA甲基化的檢測中具有極高的靈敏度和實用性。血清游離DNA中CDO1的甲基化檢測可能為肺腺癌的早期診斷、復(fù)發(fā)監(jiān)測和預(yù)后判斷提供全新的臨床思路。

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（胥洪娟 編輯）

Detection of cysteine dioxygenase 1 promoter hypermethylation in lung adenocarcinoma using tissue and serum samples

CHEN Chen1, LU Can2, LU Qianjin3
(1. Department of Thoracic Surgery, the Second Xiangya Hospital of Central South University, Changsha,Hunan 410011, China; 2. Department of Stomatology, Xiangya Hospital of Central South University, Changsha,Hunan 410008, China; 3. Hunan Key Laboratory of Medical Epigenomics, Changsha, Hunan 410011, China)

【Objective】To investigate the promoter methylation of cysteine dioxygenase 1 (CDO1) in tissue and serum sample from patients with lung adenocarcinoma.【Methods】Tumor tissue samples and serum samples were collected from 35 pathological con fi rmed lung adenocarcinoma patients and 20 lung benign tumor patients. Followed by real-time polymerase chain reaction, DNA extraction and bisulfite conversion were performed directly on magnetic beads.【Results】CDO1 methylation was detected in 71.4% of the tissue samples and in 51.4% of the serum samples from cancer group, whereas in 10% of the tissue samples and 5%of the serum samples in control group (P＜0.05). CDO1 promoter methylation detected in serum was consistent with that in tissuesamples (r=0.732,P＜0.05).【Conclusion】CDO1 methylation was detected in tumor and serum more frequently in people with cancer compared to controls. The detection of promoter methylation of CDO1 from serum samples may provide a new clue for the early diagnosis, monitoring, and prognosis evaluation of lung adenocarcinoma.

lung cancer; methylation; DNA; serum

R563.3

A

10.19338/j.issn.1672-2019.2017.08.002

2017-06-10