張立娟，游奕菲

小鼠白細胞介素－10表達載體的構(gòu)建及其在N9細胞中的表達

張立娟1，游奕菲2

(1.電子科技大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610054； 2.成都七中，四川 成都 610041)

白細胞介素10(interleukin 10，IL-10)是免疫系統(tǒng)最重要的抗炎癥細胞因子之一，具有神經(jīng)保護作用。為了探究IL-10發(fā)揮神經(jīng)免疫的抗炎作用，該文首先采用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)技術(shù)從小鼠脾臟組織總RNA中擴增出該基因的全序列cDNA；再以腺相關(guān)病毒(AAV)為載體，構(gòu)建了帶有高亮度增強型綠色熒光蛋白(EGFP)報告基因的真核表達載體AAV-IL10-EGFP，觀察了其在小膠質(zhì)細胞系N9細胞中的表達狀況；最后采用實時熒光定量(QT-PCR)的方法，檢測AAV-IL10-EGFP在N9細胞中的抗炎作用。

神經(jīng)免疫；白細胞介素-10；基因重組；AAV-IL10-EGFP；N9細胞；抗炎作用

神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)是生物體適應(yīng)自然，保持機體穩(wěn)態(tài)的一種重要的進化機制，近年來越來越受到人們的關(guān)注。細胞因子是神經(jīng)免疫的主要執(zhí)行者，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)的作用。研究發(fā)現(xiàn)，生理狀態(tài)下中樞神經(jīng)系統(tǒng)低水平的表達細胞因子，對大腦的發(fā)育、神經(jīng)發(fā)生、神經(jīng)可塑性的形成產(chǎn)生影響。根據(jù)細胞因子在免疫反應(yīng)中的作用分為促炎癥細胞因子和抗炎癥細胞因子，一般而言，促炎癥因子(IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α等)趨向于神經(jīng)損害，而抗炎癥因子(IL-4、IL-10、IL-13等)具有神經(jīng)保護性質(zhì)[1]。

白細胞介素10(interleukin 10，IL-10)，最初于1889年由Fiorentino分離鑒定[2]，是具有多種生物學(xué)活性的免疫調(diào)節(jié)分子，也是至今研究最多的免疫系統(tǒng)的抑制分子之一。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，IL-10抑制大腦促炎癥因子及其受體表達從而抑制炎癥反應(yīng)，釋放神經(jīng)元和膠質(zhì)細營養(yǎng)因子促進神經(jīng)細胞的存活，發(fā)揮中樞保護作用，但是其具體的作用機制仍有待探索。為了分析IL-10的神經(jīng)保護效應(yīng)的分子機制，并為后續(xù)基因治療應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，本研究以腺相關(guān)病(adeno-associated virus，AAV)為載體，構(gòu)建可在哺乳動物細胞長期穩(wěn)定表達的表達體系并進一步檢測IL-10的抗炎癥作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1)質(zhì)粒、菌株與細胞系:克隆載體AAV-IRESEGFP(Agilent Technologies公司)，大腸桿菌DH5α與小鼠小膠質(zhì)細胞N9系(microglia N9 cell)由四川大學(xué)華西醫(yī)院實驗室提供。實驗動物:健康、清潔級雄性6周齡C57/6J小鼠，進食飲水不限。

2)試劑:Trizol試劑、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)；dNTP、 Xho I、 BamH I、 Taq聚合酶、 DNA Marker DL 2000、BM004(上海申能博彩生物科技有限公司)；溴化乙錠、DMSO(Sigma公司)；T4 DNA Ligase及Buffer(上海拜力生物公司)；小牛血清，penicillin-streptomycin、DMEM培養(yǎng)基(Gibico公司)；Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)。

3)實驗儀器:-80℃超低溫冰箱(Sigma)，可調(diào)式微量移液器(Eppendorf)，高速低溫冷凍離心機(Sigma)，PCR(Thermo)，電泳儀電源、電泳糟及凝膠成像儀(Bio-Rad)，IX71型倒置熒光相差顯微鏡(OLYMPUS)。

1.2 總RNA提取

取新鮮脾臟組織100 mg，剪碎后裝入1.5 mL離心管中，加1 mL Trizol溶液，用注射器反復(fù)吹打破碎，室溫靜置5 min。加入0.2 mL氯仿，混勻，室溫 靜 置 5 min， 低 溫(4℃)離 心 15 min(12 000 r/min)。取上層水相，加入等體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置10 min，低溫離心10 min(12 000 r/min)，去上清，加入0.5 mL的75乙醇，充分混勻，低溫離心5 min(7 500 r/min)。打開瓶蓋，4℃冰箱內(nèi)5 min，加入 30μL DEPC-treated water溶解，貯存于-80℃。

1.3 DNA的制備

按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書要求操作如表1和表2所示。

表1 cDNA的合成

表2 DNA的合成

表2 (續(xù))

1.4 PCR擴增

通過在GenBank上查找得到表達小鼠的IL-10的基因序列，根據(jù)全長mRNA及premier與Oligo軟件設(shè)計上、下游引物，由華大基因公司合成。

根據(jù)小鼠IL-10基因序列和BamH I、Xho I雙酶切克隆位點，設(shè)計 mIL-10引物序列包括Forward primer 5'-CGC GGA TCC ATG CCT GGC TCA GCA CTGCA-3'及Reverse primer 5'-CCGCTC GAG TTA GCT TTT CAT TTT GAT CA-3'(分別引入Xho I和BamH I酶切序列)。

PCR反應(yīng)體系:cDNA，2μL；Forward primer和 Reverse primer， 各 1 μL； Pfu DNA Polymerase，2μL； ddH2O， 12μL。

PCR循環(huán)條件:1)94℃，5 min；2)94℃，30 s；3)55℃， 30 s； 4)72℃ 1 min； 5)72℃， 5 min。 重復(fù)2)～4)步驟，進行34個循環(huán)；4℃，保存。

1.5 酶切

分別對AAV-IRES-EGFP質(zhì)粒和目的基因IL-10進行雙酶切，所需試劑及操作步驟如表3所示。

表3 載體質(zhì)粒和IL-10基因的酶切

1.6 連接

連接體系:酶切得到的IL-10，6.5μL；酶切得到的 AAV-IRES-EGFP，1.5μL；T4 DNA ligase， 1 μL； 10×ligation buffer， 1 μL。 輕輕混合，室溫20～37℃反應(yīng)5 min。反應(yīng)結(jié)束后，將離心管放在冰上。

1.7 感受態(tài)細胞制備

將菌液加入3～4 mL的LB培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)3 h，將菌體轉(zhuǎn)入1.5 mL EP管，冰上冷卻10 min，4 000 r/min離心10 min，棄去上清，用1 mL CaCl2懸浮沉淀，冰上放置 30 min，再經(jīng)3 000 g離心 5 min，棄去上清，100μL CaCl2懸浮沉淀，-80℃保存。

1.8 轉(zhuǎn)化

取感受態(tài)細胞50μL，輕彈混勻，將連接產(chǎn)物全部加入細胞中。置于冰上30 min；42℃ 水浴熱激30 s；冰上放置2 min。將上述溶液加入250μL的LB培養(yǎng)液中，200 r/min、37℃搖床培養(yǎng)1 h；取20μL涂板 (帶有氨芐抗性的培養(yǎng)板)，放37℃培養(yǎng)過夜。將培養(yǎng)后的菌液用試劑盒提取質(zhì)粒，電泳鑒定；并進行PCR擴增，測序驗證。

1.9 細胞轉(zhuǎn)染

向培養(yǎng)板每孔中加入2 mL細胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)至細胞濃度為40～60時，制備以下兩種液體。A液，用不含血清與抗生素的培養(yǎng)液稀釋120μL AAV-IL10-EGFP質(zhì)粒DNA，終量600μL；B液，用不含血清與抗生素的培養(yǎng)液稀釋24μL Lipofectamine 2000，終量600μL。輕輕混合A、B液，置于室溫中15～20 min。然后用2 mL不含血清培養(yǎng)液漂洗細胞兩次，再加入1 mL不含血清培養(yǎng)液。把A、B復(fù)合物緩緩加入培養(yǎng)液中，搖勻，置于37℃溫箱24 h，吸除之前加入的不含血清與抗生素的培養(yǎng)液，換入正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

1.10 Quantitative Real-Time PCR(QT-PCR)檢測細胞因子的表達

定量檢測目標(biāo)基因的表達量，以反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA作為反應(yīng)的模板，反應(yīng)的體系如表4所示，細胞因子基因序列如圖5所示。

表4 QT-PCR細胞因子的檢測

2 實驗結(jié)果

2.1 PCR擴增產(chǎn)物凝膠電泳檢測

圖1 引物PCR擴增IL-10凝膠電泳檢測M:Marker DNA(DL2000)

2.2 小鼠IL-10測序檢測

將PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳回收，委托華大基因進行序列測定。使用DNAMAN軟件進行序列比對，如圖2所示，PCR擴增產(chǎn)物DNA序列與GenBank小鼠 IL-10基因序列完全一致，符合要求。

圖2 小鼠IL-10序列對比圖譜

2.3 重組AAV-IL10-EGFP示意圖

將小鼠IL-10基因片段與載體AAV-IRESEGFP分別以Xho I和BamH I雙酶切，然后進行連接以構(gòu)建重組表達載體AAV-IL10-EGFP，如圖3所示。其中AAV-IRES-EGFP總長6 100 bp，減去切掉的Xho I、BamH I酶切位點之間12 bp，加上IL-10除終止密碼子TAA后534 bp，共6 622 bp。

圖3 AAV-IL10-EGFP結(jié)構(gòu)示意圖

2.4 重組AAV-IL10-EGFP的酶切驗證

通過Xho I和BamH I進行雙酶切驗證，酶切產(chǎn)生兩個片段，分別約為6.1 kb、0.5 kb大小，與載體AAV-IRES-EGFP和外源IL-10基因片段長度相符合。結(jié)果如圖 4所示，其中 1、2、5是AAV-IL10-EGFP雙酶切后的電泳結(jié)果，3、4是空載體對照組 (AAV-GEFP)，表明 IL-10連接成功。

圖4 AAV-IL10-EGFP經(jīng)Xho I、BamH I雙酶切后的凝膠電泳結(jié)果

2.5 重組AAV-IL10-EGFP測序結(jié)果

將重組質(zhì)粒切膠回收，委托華大基因測序，使用chromas軟件測序峰值，重組質(zhì)粒的序列測定結(jié)果表明外源基因正確連接到載體上，從182位堿基到718位堿基，沒有干擾峰的出現(xiàn)，表明IL-10(537 bp)沒有發(fā)生突變，載體構(gòu)建成功，重組質(zhì)粒命名為AAV-IL10-EGFP，如圖5所示。

通過NCBI(美國國立生物技術(shù)信息中心)網(wǎng)站提供的BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)進行相似性比對分析，進一步確證小鼠IL-10正確連接于AAV-IRES-EGFP載體上，序列比對結(jié)果如圖6所示。

圖5 AAV-IRES-EGFP測序峰值

圖6 AAV-IL10-EGFP序列比對

2.6 綠色熒光蛋白在N9細胞的表達

AAV-IL10-EGFP重組載體轉(zhuǎn)染N9細胞24 h后，在熒光相差顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白表達情況，如圖7所示，從圖中可以看出綠色熒光強度達到了82.5，AAV-IL10-EGFP轉(zhuǎn)染細胞效率較高達到了細胞總量的83.55，提示AAV-IL10-EGFP成功轉(zhuǎn)染入N9細胞，并能夠有效表達。

圖7 N9細胞中綠色熒光蛋白的表達

2.7 AAV-IL10-EGFP的抗炎癥效果

首先用脂多糖 (LPS)處理N9細胞4 h，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，然后使用AAV-IL10-EGFP重組載體轉(zhuǎn)染N9細胞20 h。采用QT-PCR檢測細胞因子的表達，如圖8所示，LPS處理N9細胞后，導(dǎo)致促炎癥因子IL-6、IL-Iβ、TNF-α明顯增加，與對照組相比，大約增加了4倍。經(jīng)AAV-IL10-EGFP轉(zhuǎn)染N9細胞，在IL-10過表達的前提下，明顯抑制了促炎癥因子的轉(zhuǎn)錄水平 (如圖9所示)，呈現(xiàn)出抗炎癥的作用。

圖8 LPS處理N9細胞促炎癥因子的表達

圖9 AAV-IL10-EGFP抑制促炎癥因子的表達效果

3 討論

3.1 IL-10在大腦表達具有重要的生理和病理意義

傳統(tǒng)認(rèn)為大腦是 “免疫豁免”器官，而近年研究揭示細胞因子及其受體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的表達，具有調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、吞噬凋亡細胞及突觸修飾等功能，與認(rèn)知、行為情感活動相關(guān)，也參與神經(jīng)退行性疾病如老年癡呆、多發(fā)性硬化癥、帕金森綜合癥等的發(fā)生發(fā)展[3]。促炎癥因子與抗炎癥因子相互制衡與拮抗對于維護生理穩(wěn)態(tài)及疾病的治療具有重要意義。

小鼠和人IL-10基因都定位于第1號染色體，其基因組包括5個外顯子和4個內(nèi)含子，編碼178個氨基酸的多肽。IL-10是具有多種生物學(xué)活性的免疫調(diào)節(jié)分子，主要由Th2和Treg細胞分泌[4]。神經(jīng)免疫學(xué)的研究成果表明在中樞神經(jīng)系統(tǒng)多種細胞如小膠質(zhì)細胞、星形膠質(zhì)細胞及神經(jīng)元均可表達IL-10及其受體，它可促進膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元存活，拮抗炎癥反應(yīng)對大腦發(fā)育的損傷作用，在神經(jīng)精神疾病的治療中具有潛在的應(yīng)用價值。在模型動物中IL-10表現(xiàn)出抗抑郁樣作用[5]。但IL-10在中樞的表達與分布及其作用所涉及的信號通路仍有待探索。

3.2 AAV-EGFP表達體系對于中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有潛在應(yīng)用價值

綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)是從自體發(fā)光的水母中分離出來的蛋白質(zhì)，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，能夠在紫外線的激發(fā)下發(fā)出亮綠色熒光。自1992年GFP基因被克隆以來，它已成為生物學(xué)研究常用的報告基因[6]。EGFP(enhanced green fluorescent protein)是GFP的優(yōu)化突變系，發(fā)光效率更高，大大增強了其報告基因的敏感度[7]。

腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus，AAV)是依賴病毒屬細小病毒科的一種。細小病毒屬是一種非自主性病毒，需要與其他病毒共同感染以使其表達，并且無致病性，它的這些生物特性大大降低了AAV在體內(nèi)應(yīng)用的副作用，已成為傳遞和表達的一個重要工具[8]?；蛑委熗ㄟ^載體將正常基因或有治療作用的基因?qū)氚屑毎?，合成具有治療作用的蛋白，從而達到治療疾病的目的[9]。重組腺相關(guān)病毒(recombinant AAV，rAAV)，由于其安全性好、宿主細胞范圍廣、免疫源性低、在體內(nèi)表達外源基因時間長等特點，被視為最有前途的基因轉(zhuǎn)移載體之一[10]。

AAV-EGFP表達系統(tǒng)具有以下3方面特點:1)從結(jié)構(gòu)上看，該質(zhì)粒含有報告基因EGFP，可以顯示目的基因的表達水平及細胞定位，具有多克隆位點，便于目的基因的插入，該載體具有Amp基因，便于進行篩選[11]；2)從功能上看，AAV病毒載體具有廣泛的宿主細胞類型，如造血干細胞、神經(jīng)細胞、上皮細胞等，AAV有多種血清型，具有廣泛的細胞類型感染能力，可供多種選擇[12]；3)從應(yīng)用上看，AAV病毒載體安全可靠、免疫源性低、無神經(jīng)毒性，可以針對不同的疾病設(shè)計不同的載體類型，適用范圍廣。

3.3 AAV-IL10-EGFP抗炎癥作用對于中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療具有重要的意義

中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病與炎癥反應(yīng)有著密切的關(guān)系，研究發(fā)現(xiàn)抑郁中患者IL-1β、IL-6、TNF-α水平升高，而IL-10能夠抑制促炎癥因子發(fā)揮抗抑郁的作用[13]。本研究利用重組腺相關(guān)病毒載體與抗炎性因子結(jié)合，構(gòu)建出AAV-IL10-EGFP，并進一步驗證抗炎作用，發(fā)現(xiàn)它能夠明顯抑制促炎癥細胞因子如IL-6、TNF-α、IL-1β等的轉(zhuǎn)錄水平。這為今后開發(fā)治療抑郁癥藥物提供了新的選擇。

4 結(jié)束語

根據(jù)IL-10及AAV-IRES-EGFP二者基因結(jié)構(gòu)特點，構(gòu)建IL-10基因真核表達體系，將EGFP基因融合在IL-10基因的3'端，既保留了IL-10的活性，又便于檢測蛋白的表達。實驗獲得重組AAV-IL10-EGFP載體經(jīng)酶切鑒定和測序證實構(gòu)建成功，經(jīng)熒光檢測表明它可在小膠質(zhì)系N9細胞中表達?；贏AV載體系統(tǒng)的IL-10基因轉(zhuǎn)移體系，可為后續(xù)研究IL-10生物學(xué)效應(yīng)與機制提供技術(shù)平臺，為應(yīng)用于基礎(chǔ)及臨床醫(yī)學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

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Construction of Fluorescent Eukaryotic Expressing Vector of Mouse Interleukin－10 and its Expression in the N9 Cells

ZHANG Lijuan1，YOU Yifei2
(1.School of Life Science and Technology， University of Electronic Science and Technology of China， Chengdu 610054， China；2.High School No.7 Chengdu， Chengdu 610041， China)

Interleukin-10(IL-10)is an important anti-inflammatory cytokine in the immune system and has neuroprotective effects.To explore the anti-inflammatory effect of IL-10 on neuroimmunomodulatory mechanisms，the full-sequence cDNA of the gene was amplied from the total RNA of mouse spleen by reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PRC).AAV-IL10-EGFP was constructed with adeno-associated virus(AAV)as a vector and a high-intensity enhanced green fluorescent protein(EGFP)reporter gene.The expression of AAV-IL10-EGFP was successfully achieved in N9 microglial cells，which showed inhibitory effects on the production of pro-inflammatory cytokines.

neuroimmunity； interleukin 10(IL-10)； gene recombination； AAV-IL10-EGFP； N9 cell line； anti-inflammation

Q42

A

10.3969/j.issn.1672-4550.2017.05.008

2017-04-27；修改日期:2017-06-05

四川省科技支撐計劃(2013SZ0011)。

張立娟(1991-)，女，博士生，生物醫(yī)學(xué)工程專業(yè)。