王君虹，王 偉，張 玉，朱作藝，李 雪，葉興乾

(1.浙江大學(xué) 生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310023； 2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，浙江 杭州 310021)

響應(yīng)面法優(yōu)化鴨蛋清肽酶解條件及蛋清肽功能活性研究

王君虹1,2，王 偉2，張 玉2，朱作藝2，李 雪2，葉興乾1*

(1.浙江大學(xué) 生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310023； 2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，浙江 杭州 310021)

用響應(yīng)面分析法對(duì)鴨蛋清肽酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇酶解溫度、加酶量、酶解時(shí)間為自變量，鴨蛋清抗超氧陰離子能力為響應(yīng)值。利用中心組合3因素3水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，作響應(yīng)面分析。試驗(yàn)結(jié)果表明，曲面回歸方程擬合性好，制備鴨蛋清肽的最佳酶解條件為酶解溫度48.5 ℃，加酶量2.85%，酶解時(shí)間4.33 h。所得鴨蛋清肽的總抗氧化能力3.24 U·mL-1，抑制羥自由基能力51.76 U·mL-1，抗超氧陰離子能力110.3 U·L-1，DPPH自由基清除率17.49%，a-葡萄糖苷酶抑制活性52.73%。

鴨蛋清； 抗超氧陰離子； 響應(yīng)面分析法； 酶解工藝

蛋清蛋白有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，含有人體所需的全部8種必需氨基酸。蛋清蛋白同時(shí)具有重要的功能性質(zhì)，如凝膠性、乳化性、起泡性等[1]。蛋清的功能性質(zhì)與食品體系中的蛋白質(zhì)濃度、pH、離子強(qiáng)度、加熱時(shí)間與溫度、與其他原料成分相互作用等因素密切相關(guān)[2]。蛋清蛋白被蛋白酶水解后，蛋清蛋白分子量會(huì)降低，功能性質(zhì)也會(huì)得到改善，更易于消化，蛋白質(zhì)的致敏性降低，并且水解物還具有抗膽固醇、抗高血壓等生物活性，這些優(yōu)點(diǎn)使得蛋清水解物研究得到人們的重視[1-2]。金嫘等[3]研究了雞蛋清酶解的工藝條件，張英君[4]研究了酶解產(chǎn)物的功能性質(zhì)，劉靜波等[5]研究了寡肽酶解產(chǎn)物的制備方法。

雞蛋的蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)品有降低血壓、抗氧化、抗菌、促進(jìn)礦物質(zhì)吸收和免疫調(diào)節(jié)等功能[6-10]。雞蛋蛋白制備活性肽的研究報(bào)道比較多，相關(guān)活性肽的功能及應(yīng)用也有廣泛研究。但是作為禽蛋的重要組成部分之一，鴨蛋在我國(guó)禽蛋產(chǎn)量占比非常重要，我國(guó)年產(chǎn)鴨蛋300萬(wàn)t左右，人均約25 kg。鴨蛋價(jià)格高出雞蛋20%左右。鴨蛋年出口量為5萬(wàn)t左右，年產(chǎn)量和出口量都居世界首位。在鴨蛋綜合利用研究中，主要以咸鴨蛋、松花蛋、皮蛋、糟蛋等為主，對(duì)于鴨蛋清的高附加值應(yīng)用研究報(bào)道較少見(jiàn)。本研究以優(yōu)化鴨蛋清制備鴨蛋清肽的酶解條件為目標(biāo)，分析所得鴨蛋清肽的多種生物活性，為鴨蛋清高效應(yīng)用提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1供試材料

鴨蛋由浙江田歌實(shí)業(yè)股份有限公司提供；木瓜蛋白酶(≥800 U·mg-1)，上海源葉生物科技有限公司；α-葡萄糖苷酶(小鼠腸粉)、對(duì)硝基苯基α-D-葡萄糖苷(PNPG)，美國(guó)Sigma公司；總抗氧化能力(T-AOC)測(cè)定、羥自由基測(cè)定和抗超氧陰離子自由基測(cè)定試劑盒，購(gòu)自南京建成生物科技公司。其他試劑均為分析純。

BS110S型分析天平，北京賽多利斯儀器有限公司；H-1650型高速離心機(jī)，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)有限公司；210 Plus型紫外分光光度計(jì)，德國(guó)耶拿(Analytik Jena)公司；EZ-2溶劑蒸發(fā)工作站，英國(guó)GeneVac公司；MTYK-MI805 pH計(jì)，北京中慧天誠(chéng)科技有限公司；HZQ-B恒溫培養(yǎng)搖床、HH-4單數(shù)顯單列四孔水浴鍋，金壇市盛藍(lán)儀器制造有限公司。

1.2測(cè)試方法

1.2.1 抗氧化活性測(cè)定

包括總抗氧化能力(T-AOC)測(cè)定、羥自由基測(cè)定和抗超氧陰離子自由基測(cè)定試劑盒(僅用于實(shí)驗(yàn)室、科研)，購(gòu)自南京建成生物科技公司。測(cè)試方法參考試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.2.2 α-葡萄糖苷酶抑制活性測(cè)定

測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[11]。

1.2.3 鴨蛋清酶解單因素影響研究

分別考察酶解溫度(35、45、55和65 ℃)、加酶量(1%、2%、3%和4%)和酶解時(shí)間(3、4、5和6 h)對(duì)所得鴨蛋清肽的抗超氧陰離子能力的影響。

1.2.4 響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用DESIGN EXPERT 8.0軟件進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化鴨蛋清的酶解條件。以鴨蛋清抗超氧陰離子能力作為響應(yīng)值，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇酶解溫度(A)、加酶量(B)、酶解時(shí)間(C)作響應(yīng)面優(yōu)化的待優(yōu)化因子，試驗(yàn)因子水平分別以-1.68、-1、0、1、1.68進(jìn)行編碼，對(duì)應(yīng)的各因素水平分別為：A，28.2、35、45、55、61.8 ℃；B，1.32%、2.00%、3.00%、4.00%、4.68%；C，2.32、3.00、4.00、5.00、5.68 h。

2 結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)

2.1.1 酶解溫度的影響

精確稱量50 g鴨蛋清，加入2%木瓜蛋白酶，酶解時(shí)間5 h，酶解產(chǎn)物經(jīng)超濾膜截留(MW≤3 000 U)的條件下，考察酶解溫度對(duì)鴨蛋清肽抗超氧陰離子能力的影響，結(jié)果如圖1所示。隨著酶解溫度的增加，鴨蛋清肽的抗超氧陰離子能力呈先上升后下降的趨勢(shì)，酶解溫度為45 ℃時(shí)，鴨蛋清肽抗超氧陰離子能力最高為96.07 U·L-1。由于酶解鴨蛋清蛋白的木瓜蛋白酶活性與溫度密切相關(guān)，溫度過(guò)高或者過(guò)低都會(huì)抑制木瓜蛋白酶的活性。所以選擇45 ℃作為響應(yīng)面中心試驗(yàn)點(diǎn)的酶解溫度。

圖1 酶解溫度對(duì)鴨蛋清肽抗超氧陰離子能力的影響

2.1.2 加酶量的影響

精確稱量50 g鴨蛋清，在酶解溫度為45 ℃，酶解時(shí)間5 h，酶解產(chǎn)物經(jīng)超濾膜截留(MW≤3 000 U)的條件下，考察加木瓜蛋白酶量對(duì)鴨蛋清肽抗超氧陰離子能力的影響，結(jié)果如圖2所示。隨著酶量的增加，鴨蛋清肽的抗超氧陰離子能力先是大幅度上升隨后趨于平緩，當(dāng)加酶量為2%時(shí)，鴨蛋清肽的抗超氧陰離子能力達(dá)到最大值為98.35 U·L-1。由于酶解鴨蛋清是酶促反應(yīng)，酶濃度對(duì)酶促反應(yīng)的影響從米門公式和酶濃度與酶促反應(yīng)速度的關(guān)系可以說(shuō)明，酶促反應(yīng)速度與酶分子的濃度成正比，當(dāng)?shù)孜餄舛茸銐驎r(shí)，酶分子越多，底物轉(zhuǎn)化的速度也越快。但本試驗(yàn)中，底物濃度是固定的，所以隨著加酶量的增加鴨蛋清蛋白的水解度趨于固定，所得活性肽的量不會(huì)因?yàn)榧用噶康脑黾佣黾?，所以其抗超氧陰離子能力會(huì)趨于平緩。因此，選擇2%作為響應(yīng)面中心試驗(yàn)點(diǎn)的加酶量。

圖2 加酶量對(duì)鴨蛋清肽抗超氧陰離子能力的影響

2.1.3 酶解時(shí)間的影響

精確稱量50 g鴨蛋清，在酶解溫度為45 ℃，加酶量2%，酶解產(chǎn)物經(jīng)超濾膜截留(MW≤3 000 u)的條件下，考察酶解時(shí)間對(duì)鴨蛋清肽抗超氧陰離子能力的影響，結(jié)果如圖3所示。隨著酶解時(shí)間的增加，鴨蛋清肽的抗超氧陰離子能力先上升后下降，酶解4 h時(shí)，鴨蛋清的抗超氧陰離子能力達(dá)到最大值為88.35 U·L-1。因此，選擇4 h作為響應(yīng)面中心試驗(yàn)點(diǎn)的酶解時(shí)間。

圖3 酶解時(shí)間對(duì)鴨蛋清肽抗超氧陰離子能力的影響

2.2響應(yīng)面分析及試驗(yàn)

綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用酶解溫度，加酶量和酶解時(shí)間3因素3水平設(shè)計(jì)中心組合試驗(yàn)。以A、B、C為自變量，以鴨蛋清肽的抗超氧陰離子能力Y為響應(yīng)值，試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表1。應(yīng)用DESIGN EXPERT 8.0軟件對(duì)表1試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到以鴨蛋清肽抗超氧陰離子能力為響應(yīng)值的擬合方程：Y=108.59+1.46A+4.42B+1.67C+1.49A2-4.97B2-3.58C2+1.11AB+1.21AC-2.68BC，R2=0.932 4。

方差分析可知，加酶量(P=0.021 3*)、加酶量二次項(xiàng)(P=0.010 3*)和酶解時(shí)間二次項(xiàng)(P=0.047 0*)達(dá)到顯著水平。F值為3.04，說(shuō)明模型是適合的。P>F且低于0.050 0，表明模型擬合良好。各因素對(duì)鴨蛋清肽酶解影響的大小順序B>C(P=0.328 5)>A(P=0.387 9)。整體模型達(dá)到顯著水平(P=0.049 0*)。分析得最佳提取條件為：酶解溫度48.5 ℃，加酶量2.85%，酶解時(shí)間4.33 h。

表1 響應(yīng)面分析方案及試驗(yàn)結(jié)果

由因素交互作用分析結(jié)果(圖4) 可見(jiàn)，2個(gè)因素交互會(huì)影響鴨蛋清酶解肽的抗超氧陰離子能力。擬合所得響應(yīng)面能比較直觀地反應(yīng)各因素間的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響。該模型在各因子交互最佳條件下的預(yù)測(cè)活性最高值為114.04 U·L-1。

圖4 各因素交互影響蛋清肽抗氧化活性的響應(yīng)面

2.3驗(yàn)證與多功能活性分析

根據(jù)公式計(jì)算所得到的鴨蛋清最佳酶解條件為酶解溫度48.5 ℃，加酶量2.85%，酶解時(shí)間4.33 h?？紤]到實(shí)際可操作性，選用酶解溫度48.5 ℃，加酶量2.8%、酶解時(shí)間4.3 h，作為最佳工藝。在此條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，結(jié)果表明，抗超氧陰離子能力平均值為110.3 U·L-1，結(jié)果值是預(yù)測(cè)值的96.7%，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)結(jié)果與模型符合良好，并達(dá)到響應(yīng)值最大的目標(biāo)。此時(shí)鴨蛋清肽的總抗氧化能力為3.24 U·mL-1，抑制羥自由基能力為51.76 U·mL-1，DPPH自由基清除率為17.49%，a-葡萄糖苷酶抑制活性為52.73%。

3 小結(jié)

本研究通過(guò)響應(yīng)面分析法優(yōu)化鴨蛋清酶解工藝條件，得到的最佳條件為：酶解溫度48.5℃、加酶量2.8%、酶解時(shí)間4.3h。通過(guò)最優(yōu)酶解條件試驗(yàn)驗(yàn)證，所優(yōu)化的工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠、穩(wěn)定。所得鴨蛋清肽的抗總氧化能力3.24U·mL-1，抑制羥自由基能力51.76U·mL-1，抗超氧陰離子能力110.3U·L-1，DPPH自由基清除率17.49%，a-葡萄糖苷酶抑制活性52.73%?？芍喌扒咫木哂休^強(qiáng)的抗氧化活性和a-葡萄糖苷酶抑制活性，可以作為抗氧化調(diào)節(jié)亞健康食品和降血糖功能產(chǎn)品的優(yōu)選原料。

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收入日期：2017-07-29

浙江省自然科學(xué)基金(LY13C200015，LY15C200010，13C200005)；國(guó)家自然科學(xué)基金(31401495)

王君虹(1981—)，女，浙江玉環(huán)人，助理研究員，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量與安全，E-mail: wjh-06@163.com。

葉興乾，E-mail: psu@zju.edu.cn。

文獻(xiàn)著錄格式：王君虹，王偉，張玉，等. 響應(yīng)面法優(yōu)化鴨蛋清肽酶解條件及蛋清肽功能活性研究[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，58(10)：1742-1745.

10.16178/j.issn.0528-9017.20171022

TS253.4

A

0528-9017(2017)10-1742-04

(責(zé)任編輯侯春曉)