陳強，安娜，梁麗娜，莊曾淵

補腎養(yǎng)血明目方對ARPE-19細胞氧化損傷的保護機制研究

陳強，安娜，梁麗娜，莊曾淵

目的 探討補腎養(yǎng)血明目方對氫醌（hydroquinone,HQ）誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜色素上皮細胞（ARPE-19）氧化損傷的保護機制。方法 采用HQ制作ARPE-19細胞氧化應(yīng)激損傷模型，分為正常對照組，模型組，空白腸吸收液組，預(yù)防給藥組和治療給藥組。分別采用TUNEL技術(shù)觀察細胞凋亡情況，免疫組化技術(shù)檢測8-羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）的表達情況，化學(xué)發(fā)光法測定細胞內(nèi)ATP含量，熒光法測定活性氧（ROS）水平，化學(xué)比色法檢測細胞中超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）含量。結(jié)果 與氧化損傷模型組相比，補腎養(yǎng)血明目方可減少ARPE-19細胞凋亡，抑制細胞內(nèi)ATP的水平下降，減少ROS的生成，減少RPE細胞8-OHdG陽性表達率，提高抗氧化酶（SOD和GSH-Px）的含量。結(jié)論 線粒體保護是補腎養(yǎng)血明目方發(fā)揮抗HQ誘導(dǎo)的ARPE-19細胞氧化損傷的重要途徑。

補腎養(yǎng)血明目方；ARPE-19；氧化損傷

目前多項研究已證實視網(wǎng)膜色素上皮視網(wǎng)膜色素上皮（retinal pigment epithelium,RPE）細胞的損傷或增殖在年齡相關(guān)性黃斑變性 （age-related macular degeneration,AMD）、視網(wǎng)膜色素變性（retinitis pigmentosa,RP）、增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變（prolifera-tive vitreoretinopathy,PVR）等多種視網(wǎng)膜疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用[1-3]。因此，保護RPE細胞正常生理性結(jié)構(gòu)、功能和數(shù)量、抑制RPE細胞的損傷變性，已成為治療AMD、RP等疾病的新方向。補腎養(yǎng)血明目方是我院臨床上治療AMD和RP的臨床經(jīng)驗方，前期體內(nèi)實驗及體外實驗均顯示對RPE細胞有較好的保護作用，并提示作用機制與線粒體保護有關(guān)[4-5]。在前期基礎(chǔ)上，我們以氫醌（hydroquinone,HQ）誘導(dǎo)建立人視網(wǎng)膜色素上皮細胞系A(chǔ)RPE-19氧化損傷模型，觀察該組方對RPE細胞的保護作用，進一步完善對藥物作用機制的認識，具體報告如下。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及主要儀器

ARPE-19細胞購自于廣州吉妮歐生物科技有限公司。氫醌、DCFH-DA熒光探針（Sigma-Aldrich）；DMEM高糖培養(yǎng)基（HyClone）；0.25%胰蛋白酶EDTA 消化液（Solarbio）；胎牛血清（Gibco）；TUNEL 試劑盒（Roche）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）檢測試劑盒（南京建成）；谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase,GSH-Px）檢測試劑盒（南京建成）；CellTiter-GloRLuminescent Cell Viability Assay試劑盒（Promega）。 CO2培養(yǎng)箱（德國 heraeus公司）；組織-器官水浴系統(tǒng)（上海奧爾科特生物科技有限公司）；紫外-可見分光光度計（英國熱電）；熒光分光光度計（美國柏金埃爾默公司）；熒光顯微鏡（Olympus）；多功能酶標儀（美國博騰儀器有限公司，BioTek Synergy H1）。

1.2 方法

1.2.1 RPE細胞培養(yǎng) 將RPE細胞接種于含體積分數(shù)15%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液中，置于37℃、體積分數(shù)為5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，細胞貼壁后，每2 d更換一次培養(yǎng)液，接近融合狀態(tài)時消化傳代，第4～6代細胞用于實驗。

1.2.2 補腎養(yǎng)血明目方含藥腸吸收液的制備 補腎養(yǎng)血明目方方藥組成包括當(dāng)歸、遠志、黃芪等，其濃縮干浸膏由中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所提供 （2.3 g生藥/g)，稱取適量浸膏加純凈水配成含藥水溶液（0.144 g生藥/ml）。SD大鼠隨機分為含藥腸吸收液組和空白腸吸收液組，通過ALC-M型組織-器官水浴系統(tǒng)采用外翻腸囊法制備腸吸收液[6]，向每個浴管中預(yù)先加入25 ml補腎養(yǎng)血明目方供試液 （腸吸收液組）或不含藥物的臺氏緩沖液（空白腸吸收液組），通入 95%O2和 5%CO2的混合氣體，37℃恒溫。0.22 μm微孔濾膜過濾除菌后，分裝至無菌EP管中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 實驗分組 細胞分為5組：（1）正常對照組（正常組）：以正常培養(yǎng)液培養(yǎng)；（2）氧化損傷模型組（模型組）：90 μmol/L 氫醌作用 24 h；（3）空白腸吸收液組：空白腸吸收液作用24 h后，加入90 μmol/L氫醌作用24 h；（4）預(yù)防給藥組（預(yù)防組）：補腎養(yǎng)血明目方腸吸收液作用24 h后，加入90 μmol/L氫醌作用 24h；（5）治療給藥組（治療組）：90μmol/L 氫醌作用24 h后，加入補腎養(yǎng)血明目方腸吸收液作用24 h。

1.2.4 TUNEL染色鑒定凋亡細胞 對數(shù)生長期ARPE-19細胞以1×106/ml的濃度接種于35 mm培養(yǎng)皿內(nèi)，細胞分組同上，根據(jù)細胞活力預(yù)防組及治療組均采用2%的補腎養(yǎng)血明目方腸吸收液。各組經(jīng)相應(yīng)處理后吸出細胞培養(yǎng)液，嚴格按照TUNEL檢測試劑盒說明書操作，熒光顯微鏡觀察，計數(shù)RPE凋亡細胞及RPE細胞總數(shù)，計算凋亡率。凋亡率（%）=凋亡細胞數(shù)/同視野RPE細胞總數(shù)×100%。

1.2.5 RPE細胞DNA損傷測定 以免疫組織化學(xué)的方法檢測DNA氧化損傷產(chǎn)物8-羥基脫氧鳥苷（8-hydroxy-2’-deoxyguanosine,8-OHdG）。 實驗分組及相應(yīng)處理同1.2.3項，吸出細胞培養(yǎng)液，按如下操作進行：4%多聚甲醛固定；PBS漂洗；0.25%TritonX-100溶液作用30 min；10%山羊血清封閉；加入一抗 mouse anti 8-OHdG（1:500）孵育 2 h；PBS 漂洗；加入二抗goat anti mouse AF555 （1:400）孵育2 h。PBST浸洗；加500 μl DAPI溶液在標本上，室溫下孵育5 min；PBS浸洗5 min；稍干后用抗熒光衰減封片劑封片；熒光倒置顯微鏡觀察。每張片子隨機選取5個視野，計數(shù)RPE細胞DNA損傷標記數(shù)及RPE細胞總數(shù)，計算DNA損傷率。損傷率（%）=8-OHdG陽性染色細胞數(shù)/同視野RPE細胞總數(shù)×100%。

1.2.6 RPE細胞內(nèi)腺苷三磷酸 （adenosine triphosphate,ATP）的測定 細胞接種于白璧透明底96孔細胞培養(yǎng)板，實驗分組及處理同1.2.3項。采用CellTiter-GloRLuminescent Cell Viability Assay試劑盒檢測各組RPE細胞內(nèi)ATP含量。培養(yǎng)板每孔加入 CellTiter-GloRReagent 100 μl，震板 2 min，室溫孵育10 min，穩(wěn)定化學(xué)發(fā)光信號，酶標儀讀數(shù)。

1.2.7 RPE細胞內(nèi)活性氧 （reactive oxygen species,ROS）的測定 DCFH-DA本身沒有熒光，進入細胞內(nèi)后，被水解生成DCFH，DCFH不能通透細胞膜，并且可被細胞內(nèi)的活性氧化成發(fā)出綠色熒光的DCF。因此，檢測綠色熒光的強弱可以間接反映細胞內(nèi)ROS的水平。RPE細胞接種于96孔培養(yǎng)板，48 h后，以含10 μmol/L DCFH-DA的無血清培養(yǎng)液，37℃孵育30 min，預(yù)先原位裝載DCFH探針，實驗分組及相應(yīng)處理同1.2.3項。采用酶標儀于488 nm激發(fā)波長，525 nm發(fā)射波長，檢測各孔熒光值。

1.2.8 RPE細胞內(nèi)SOD、GSH-Px含量的測定 按照試劑盒說明書，采用比色法測定細胞內(nèi)SOD、GSH-Px的含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，多組均數(shù)間比較采用完全隨機設(shè)計的方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 補腎養(yǎng)血明目方對RPE細胞凋亡的影響

正常組、模型組、空白腸吸收液組、預(yù)防組和治療組的凋亡率分別為 （0.221±0.47）%、（13.333±5.16）%、（15.452±7.03）%、（7.927±2.09）%和（8.974±3.45）%（F=17.130，P<0.001）。 模型組及空白腸吸收組凋亡率較正常組明顯升高（P＜0.05），預(yù)防組和治療組的凋亡率高于正常組（P＜0.05）并低于模型組及空白腸吸收組（P＜0.05）。模型組與空白腸吸收液組間以及預(yù)防組和治療組間的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（圖 1）。

2.2 補腎養(yǎng)血明目方對線粒體DNA損傷的影響

圖1 各組ARPE-19細胞凋亡率的比較。F=17.130，P<0.001。與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與空白腸吸收液組比較，cP＜0.05（單因素方差分析，LSD-t檢驗）

陽性細胞成紫紅色著染，形態(tài)呈C型，均勻固縮狀。由圖2可見，正常組RPE細胞DNA損傷較輕，陽性細胞數(shù)少，表達較弱，模型組和空白腸吸收液組細胞有較多損傷，陽性表達較強，治療組和預(yù)防組RPE細胞DNA損傷較模型組減少，其中預(yù)防組細胞損傷最輕（圖2）。

圖2 熒光顯微鏡下各組ARPE-19細胞8-OHdG 的表達 （200×）2A.正常組；2B.模型組；2C.空白腸吸收液組；2D.預(yù)防組；2E.治療組。藍色為DAPI著染的細胞核，紫紅色為8-OhdG陽性細胞 8-OHdG：8-羥基脫氧鳥苷

正常組、模型組、空白腸吸收液組、預(yù)防組和治療組的 DNA損傷率分別為 （1.444±2.09）%、（16.631±3.79）%、（13.631±5.22）%、（7.913±2.07）%和 （9.776±3.96）%（F=24.368，P＜0.001）。 正常組的DNA損傷率最低 （P＜0.05），其次是預(yù)防組和治療組，模型組和空白腸吸收液組的DNA損傷率最高，明顯高于預(yù)防組和治療組（P＜0.05）。模型組與空白腸吸收液組間以及預(yù)防組和治療組間的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 補腎養(yǎng)血明目方對ARPE-19細胞內(nèi)ATP水平的影響

正常組的ATP含量最高，模型組數(shù)值最低（P＜0.05）?？瞻啄c吸收液組明顯高于模型組（P＜0.05），但低于正常組（P＜0.05）；預(yù)防組的ATP含量較空白腸吸收液組增加（P＜0.05），與正常組較為接近（P＞0.05）；治療組ATP含量高于空白腸吸收液組 （P＞0.05）并略低于干預(yù)組（P＞0.05）（圖 3）。

2.4 補腎養(yǎng)血明目方對ARPE-19細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的影響

圖3 各組ARPE-19細胞內(nèi)ATP含量的比較（多功能酶標儀化學(xué)發(fā)光檢測）。F=39.022，P<0.001。與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與空白腸吸收液組比較，cP＜0.05（單因素方差分析，LSD-t檢驗）ATP：腺苷三磷酸

模型組和空白腸吸收液組細胞內(nèi)的ROS均較正常組顯著增加（P＜0.05），預(yù)防組和治療組RPE細胞內(nèi)ROS含量低于模型組（P＜0.05）和空白腸吸收液組，與正常組接近（P＞0.05），預(yù)防組的ROS含量相對更低一些，與空白腸吸收液組空白組的數(shù)值差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。模型組與空白腸吸收液組間以及預(yù)防組和治療組間的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（圖 4）。

圖4 各組ARPE-19細胞內(nèi)ROS含量的比較（多功能酶標儀熒光檢測）。 F=4.264，P<0.05。 與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與空白腸吸收液組比較，cP＜0.05（單因素方差分析，LSD-t檢驗）ROS：活性氧

2.5 補腎養(yǎng)血明目方對RPE細胞內(nèi)SOD、GSH-Px含量變化的影響

SOD含量：模型組和空白腸吸收液組RPE細胞中的SOD含量較正常組明顯下降（P＜0.05），預(yù)防組和治療組細胞內(nèi)的SOD較模型組（P＜0.05）和空白腸吸收液組增加，預(yù)防組的數(shù)值變化更為明顯，高于空白腸吸收液組（P＜0.05），接近正常組（P＞0.05）。 模型組與空白腸吸收液組間以及預(yù)防組和治療組間的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（圖 5A）。

GSH-Px含量：各組細胞內(nèi)GSH-Px情況與SOD類似，模型組和空白腸吸收液組的GSH-Px含量較正常組下降（P＜0.05），預(yù)防組和治療組的GSH-Px則較模型組和空白腸吸收液組增加，并與正常組數(shù)值接近（P＞0.05）（圖 5B）。

圖5 ARPE-19細胞內(nèi)SOD和GSH-Px含量的比較 （多功能酶標儀比色法）。 5A.SOD（F=9.072，P＜0.05）;5B.GSH-Px（F=5.420，P＜0.05）。與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與空白腸吸收液組比較，cP＜0.05（單因素方差分析，LSD-t檢驗）SOD：超氧化物歧化酶GSH-Px：谷胱甘肽過氧化物酶

3 討論

氧化應(yīng)激損傷是指機體在遭受各種有害刺激如環(huán)境因素、營養(yǎng)障礙和遺傳因素時，體內(nèi)活性氧（ROS）和活性氮（reactive nitrogen species,RNS）等高活性分子產(chǎn)生過多，氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，從而導(dǎo)致組織細胞損傷[7]。多個流行病學(xué)調(diào)查、動物及細胞實驗都證明氧化應(yīng)激在AMD發(fā)病過程中起重要作用，RPE細胞的氧化應(yīng)激損傷是關(guān)鍵的發(fā)病機制，而吸煙是誘發(fā)AMD主要的氧化應(yīng)激因素[8-10]。香煙中的焦油含有高濃度的氧化劑前體，其中氫醌的含量最高，我們前期實驗采用氫醌成功誘導(dǎo)出小鼠早期AMD模型[11]，此次實驗我們采用90μmol/L氫醌建立體外ARPE-19細胞氧化損傷模型。

補腎養(yǎng)血明目方是名老中醫(yī)莊曾淵多年的臨床經(jīng)驗方，方藥組成包括枸杞子、淫羊藿、當(dāng)歸、石斛等，其中枸杞子、淫羊藿補益腎精，當(dāng)歸、石斛養(yǎng)血明目，諸藥合用，共奏補腎養(yǎng)血明目功效。我們前期動物實驗發(fā)現(xiàn)補腎養(yǎng)血明目方對碘酸鈉誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜變性損傷有保護作用，可以減輕視網(wǎng)膜病變程度，減少RPE細胞的凋亡[5]；體外細胞培養(yǎng)實驗亦發(fā)現(xiàn)補腎養(yǎng)血明目方含藥血清可以保護丙烯醛誘導(dǎo)的ARPE-19細胞氧化應(yīng)激損傷[4]。本次試驗結(jié)果顯示補腎養(yǎng)血明目方含藥腸吸收液組細胞凋亡率小于模型組及空白腸吸收液 （P＜0.05），預(yù)防給藥組效果更為明顯（P＜0.01），提示補腎養(yǎng)血明目方對氫醌誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷有保護作用，這與我們以前的研究結(jié)果相一致。

線粒體是真核動物細胞進行生物氧化和能量轉(zhuǎn)換的主要場所，細胞生命活動所需能量的80%是由線粒體提供的，線粒體生物氧化和能量轉(zhuǎn)化的過程中會產(chǎn)生很多ROS，是細胞內(nèi)ROS的主要來源。線粒體的結(jié)構(gòu)暴露于高濃度的ROS下，當(dāng)氧化應(yīng)激發(fā)生的時候，線粒體成為ROS攻擊的首要靶細胞器。過量的活性氧攻擊線粒體DNA（mitochondrialDNA,mtDNA）及線粒體內(nèi)蛋白質(zhì)、脂類等生物大分子物質(zhì)，使其能量合成受到障礙，最終導(dǎo)致線粒體功能下降[12]。雖然目前對線粒體氧化應(yīng)激損傷后導(dǎo)致細胞功能下降、死亡的具體機制尚不完全清楚，但研究顯示mtDNA損傷可以引發(fā)細胞凋亡或者壞死。mtDNA位于線粒體腔內(nèi)接近內(nèi)膜的位置，對氧化應(yīng)激比細胞核DNA（nuclear DNA,nDNA）更為敏感。mtDNA的功能障礙，直接影響線粒體的氧化磷酸化功能，使呼吸鏈中斷，ATP產(chǎn)生減少，ROS生成增多，形成惡性循環(huán)，最終導(dǎo)致整個細胞功能瓦解。mtDNA的損傷程度可以反映細胞整體的氧化損傷情況[13]。He Y等發(fā)現(xiàn)當(dāng)線粒體功能下降時，RPE對氧化應(yīng)激的敏感性明顯增加[14]。Feher J和Karunadharma通過尸檢發(fā)現(xiàn)在AMD患者的視網(wǎng)膜中明確存在mtDNA的異常，異常程度與AMD病理改變呈高度相關(guān)性，提示mtDNA損傷在AMD的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用[15-16]。8-OHdG被認為是mtDNA在體內(nèi)氧化損傷的標志物[17]，我們以此來評價mtDNA的氧化損傷程度。本次實驗發(fā)現(xiàn)補腎養(yǎng)血明目方可以增加細胞內(nèi)ATP的水平，減少ROS的生成，減輕mtDNA損傷，提高抗氧化酶（SOD和GSH-Px）的含量。因此，我們推測補腎養(yǎng)血明目對線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑有阻斷作用。

綜上所述，我們認為補腎養(yǎng)血明目方對RPE細胞的氧化應(yīng)激損傷有保護作用，其作用機制可能是通過保護mtDNA，進而減少由于mtDNA損傷引發(fā)的級聯(lián)反應(yīng)。將來的研究重點一方面繼續(xù)深入探討作用機制，同時在基礎(chǔ)研究的支持下，擬開展多中心、隨機、盲法、對照的臨床試驗以充分證明補腎養(yǎng)血明目方的安全性和有效性，從而在臨床推廣應(yīng)用。

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Study on protective mechanisms of Bushen Yangxue Mingmu Formula on oxidative injury of ARPE-19 cells

CHEN Qiang,AN Na,LIANG Lina,et al.Eye Hospital,China Academy of Chinese Medical Sciences,Beijing 100040,China

OBJECTIVE To investigate the possible protective mechanism of Bushen Yangxue Mingmu(BSYXMM)Formula on ARPE-19 cells under oxidative stress induced by Hydroquinone(HQ).METHODS The oxidative stress models of ARPE-19 cells were induced by HQ and divided into normal control group,model group,blank group,preventive group and treatment group.The percentage of apoptotic cells was measured by TUNEL assay and the expression of 8-OHdG was detected by immunohistochemical analysis.Chemiluminescence detection was used to determine ATP(adenosinetriphosphate)and ROS(reactive oxygen species)content.The contents of superoxide dismutase(SOD)and glutathione peroxidase(GSH-Px)were detected by colorimetry.RESULTS Compared to the model group,BSYXMM Formula significantly reduced apotosis in ARPE-19 cells,inhibited the decline of ATP levels,decreased the production of ROS and alleviated mtDNA damage.Moreover,BSYXMM Formula increased the content of SOD and GSH-Px.CONCLUSIONS Mitochondrial protection was the important pathway for BSYXMM formula protecting against HQ-induced oxidative stress injury in ARPE-19 cells.

Bushen Yangxue Mingmu Formula;ARPE-19 cell;oxidative injury

R285.5

A

1002-4379（2017）04-0218-05

10.13444/j.cnki.zgzyykzz.2017.04.002

國家自然科學(xué)基金青年基金項目（81503621）；國家自然科學(xué)基金項目（81674033）；中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項資金（ZZ0908027）

中國中醫(yī)科學(xué)院眼科醫(yī)院，北京100040

梁麗娜，E-mail：lianglina163@163.com