楊繼紅 ，李凱 ，王育良 ，黃愛靈 ，錢婷

鬼針草水提物對雄激素缺乏性干眼大鼠淚液分泌和淚腺炎癥的影響

楊繼紅1，李凱2，王育良2，黃愛靈1，錢婷1

目的 研究鬼針草水提物對雄激素缺乏性干眼大鼠淚液分泌和淚腺炎癥的影響，并探討其作用機制。方法 24只雌性Wistar大鼠隨機分為4組，每組6只。正常對照組無任何處理；生理鹽水組予生理鹽水灌胃，非那雄胺組予非那雄胺灌胃，鬼針草治療組予非那雄胺和鬼針草提取物灌胃，均連續(xù)4周。實驗前、實驗后7 d、14 d、21 d及28 d進行淚液分泌量、淚膜破裂時間和角膜熒光素染色檢測。實驗后28 d后處死實驗動物，采用細胞因子抗體芯片技術及Western blot分析淚腺和角膜炎癥因子變化，并對淚腺進行組織病理觀察。結果 非那雄胺給藥14 d后可有效誘導大鼠干眼，與正常對照組比較，非那雄胺組大鼠的淚液分泌量明顯減少，淚膜破裂時間明顯縮短，角膜熒光素染色評分明顯增加，淚腺組織可見大量的炎癥細胞浸潤。鬼針草治療組大鼠的淚液分泌量、淚膜破裂時間及角膜熒光素染色情況均明顯好于非那雄胺組，其淚腺結構較完整，未見明顯的炎癥細胞浸潤。細胞因子抗體芯片和Western blot結果顯示，非那雄胺組的促炎癥因子白細胞介素-1β（IL-1β）、IL-6和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）以及抗炎細胞因子 IL-4、IL-10的表達水平均高于正常對照組。與非那雄胺組相比，鬼針草治療組的IL-1β，Fas配體（FasL）及TNF-α表達水平明顯降低。結論 鬼針草水提物能有效改善雄激素缺乏性干眼大鼠的淚液分泌，穩(wěn)定淚膜，并能抑制淚腺組織炎癥反應。

干眼；雄激素；鬼針草；炎癥；治療

干眼是指各種原因引起的淚液質和量及動力學的異常，導致淚膜不穩(wěn)定和眼表組織病變，并伴有眼部不適癥狀為特征的一類疾病的總稱[1]。干眼根據主要病因可分為兩類：水樣液缺乏型和蒸發(fā)過強型[2]，水樣液缺乏型或蒸發(fā)過強型均造成淚液的高滲透性，這些改變可激活絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）和核轉錄因子κB（nuclear transcription factor kappaB,NF-κB）信號通路，導致炎性介質和炎癥因子的表達[3]。文獻報道，干眼的發(fā)病率在5%到35%，其中女性較男性發(fā)病率高，且隨著年齡增長逐漸越高[4]。美國的流行病學調查顯示在50歲以上人群中，大約有7%的女性和4%的男性患有干眼[5]。雄激素水平降低被證實是干眼的主要原因，其在淚腺分泌功能調節(jié)上起重要作用[6-7]。因此，目前認為雄激素替代療法是治療性激素紊亂導致的干眼的唯一有效方法。然而，長期的雄激素替代治療會不可避免地造成一些副作用，因而有必要尋求安全有效的新藥物來治療雄激素缺乏性干眼。

鬼針草廣泛分布于世界各地，研究表明鬼針草具有多種藥理學效應，如抗過敏[8]、抗?jié)僛9]、抗炎[10]及免疫調節(jié)功能[11]。尤其經藥理學研究證實的通過抑制炎性細胞因子的抗炎作用使之成為研究熱點。我們的既往研究表明鬼針草可用于治療干眼[12-13]，但鬼針草治療干眼的作用機制以及是否能夠抑制炎癥尚不清楚。本次研究通過建立雄激素缺乏性干眼模型來評估鬼針草對此類型干眼的療效，并探討其潛在的作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料

實驗動物：健康雌性Wistar大鼠24只（南京醫(yī)科大學實驗動物中心提供），鼠齡7個月，體質量180～250 g。普通飼料喂養(yǎng)，實驗過程遵循國家科學技術委員會頒布的《實驗動物管理條例》。

主要藥品、試劑及儀器：鬼針草（天江藥業(yè)）；非那雄胺（默沙東公司）；酚紅棉線檢測試紙、熒光素染色濾紙條（天津晶明新技術開發(fā)有限公司）；細胞因子抗體芯片檢測（美國RayBiotech公司）；蛋白質提取試劑（上海康成生物公司）；Western blot檢測用聚丙烯酰胺凝膠電泳 （polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE）凝膠（美國Bio-Rad公司）；化學發(fā)光試劑盒（美國 PerkinElmer Life Sciences公司）；TP1020 自動脫水機和RM2235型石蠟切片機（德國LEICA公司）；Tissue-Tek TEL組織包埋機 （日本SAKURA公司）；LEICA DM-1000光學顯微鏡（德國LEICA公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組與造模 實驗開始前，所有動物行眼前節(jié)檢查，只納入檢查正常的大鼠。最終24只大鼠隨機分為4組，每組6只。正常對照組（A組），無任何處理；生理鹽水組（B組），予生理鹽水灌胃，劑量0.5 ml/100 g；非那雄胺組（C組），予非那雄胺灌胃，劑量 1.16 mg/(kg·d)；鬼針草治療組（D 組），同時予非那雄胺和鬼針草提取物灌胃，非那雄胺劑量同C組，鬼針草水提取物濃度0.1 g/ml，劑量0.5 ml/100 g。各處理組動物灌胃均為每日1次，連續(xù)4周。

1.2.2 淚液分泌及淚膜穩(wěn)定性檢查 檢查均由同一人完成，每次檢查時間、地點、照明亮度、濕度及溫度相同。于實驗前、實驗后7 d、14 d、21 d和28 d行酚紅棉線試驗，淚膜破裂時間 （tear break-up time,BUT）和角膜熒光素染色（fluorescein,FL）測定。酚紅棉線試驗：棉線用顯微鑷夾持放置于大鼠雙眼下瞼近外眥處60 s，測量棉線濕潤長度。BUT：用市售熒光素鈉眼科檢測試紙，一滴生理鹽水稀釋后，將染色試紙條輕擦拭下眼瞼穹窿部，輕揉上下瞼，使其彌散分布，觀察淚膜破裂時間，記錄3次，結果取3次記錄的平均值。角膜熒光素染色：用裂隙燈鈷藍光觀察角膜熒光素染色，角膜染色視為角膜上皮有損害。染色等級評分標準如下：0級，無染色，記0分；1級，1/8角膜染色，記1分；2級，1/4角膜染色，記2分；3級，1/2角膜染色，記3分；4級，染色大于1/2角膜，記4分。

1.2.3 細胞因子抗體芯片檢測 大鼠細胞因子抗體芯片技術用于檢測四組大鼠淚腺和角膜的34種細胞因子表達（表1）。使用組織蛋白提取劑從淚腺和角膜提取總蛋白。用BCA法測定每個樣本的蛋白質濃度，來自膜的信號用化學發(fā)光成像系統(tǒng)檢測。通過比較信號強度，計算細胞因子的相對表達水平。與對照組相比，相應的細胞因子表達增加或減少，比值大于1.3為高表達，比值低于0.77為低表達。

1.2.4 Western blot檢測 基于細胞因子抗體芯片檢測結果，僅選擇高表達的細胞因子用Western blot進一步驗證。從四組大鼠中取出淚腺，將組織均勻分布于勻漿緩沖液中并存于-80℃，用于蛋白印跡分析。將組織樣品在SDS-PAGE凝膠電泳樣品緩沖液中稀釋。將所有樣品和標準品煮沸5 min，然后裝載到4%至15%PAGE凝膠上。凝膠在80 V下運行30 min，在120 V下運行90 min，在轉移緩沖液中洗滌，并在100 mA下硝酸纖維素膜上電印跡2 h。4℃下印跡用3%牛奶在三乙醇胺緩沖鹽溶液（TBS）中封閉過夜，并在室溫下與相應的抗體溫育2 h。漂洗3次，將印跡用辣根過氧化物酶（HRP）綴合的兔山羊抗免疫球蛋白 G（1∶2000）溫育 1 h，然后用增強的化學發(fā)光試劑盒檢測雜交帶。

1.2.5 淚腺光學顯微鏡觀察 取淚腺組織，在10%的甲醛中固定。脫水后，將樣品用石蠟包埋、切片，并用蘇木精-伊紅染色（HE染色）。在光學顯微鏡下用400倍的放大倍數觀察淚腺組織形態(tài)。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 15.0軟件，計量資料符合正態(tài)分布者以xˉ±s表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；計量資料不符合正態(tài)分布者以中位數及四分位數[M（Q1,Q3）]表示，組間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 酚紅棉線測試

正常對照組與生理鹽水組各時間點的酚紅棉線試驗結果數值接近（P＞0.05）。非那雄胺組造模后淚液分泌明顯減少，造模后14 d，21 d及28 d時較正常對照組有統(tǒng)計學意義的降低（P＜0.05）。鬼針草組淚液分泌量較正常對照組略有下降，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），造模后 21d和 28d 時，其淚液分泌量明顯高于同期非那雄胺組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（表2）。

2.2 淚膜破裂時間

正常對照組與生理鹽水組各時間點的BUT差異均無統(tǒng)計學意義 （P＞0.05）。非那雄胺組造模前BUT 值與正常對照組接近（P＞0.05），造模后 7、14、21及28 d時BUT值明顯小于正常對照組（P＜0.05）。鬼針草組造模后各時間的BUT值低于同期正常對照組（造模后 28 d時，P＜0.05），但高于非那雄胺組（造模后 14、28 d 時，P＜0.05）（表 3）。

表1 34種炎癥因子在抗體芯片中的定位

表2 酚紅棉線試驗檢測各組大鼠不同時間淚液分泌量（xˉ±s,mm）

表3 各組大鼠不同時間BUT比較（xˉ±s,s）

2.3 角膜熒光素染色

實驗前四組大鼠角膜均無熒光素染色。實驗開始后正常對照組與生理鹽水組的FL評分值均較低，各時點差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。非那雄胺組造模后的FL評分逐漸升高，造模后21、28 d時明顯高于正常對照組（造模后28 d時，P＜0.05）。鬼針草組FL評分隨實驗時間延長略有升高，造模后7、21、28 d時低于同期非那雄胺組 （造模后28 d時，P＜0.05）（表 4）。

2.4 細胞因子抗體芯片檢測

采用細胞因子抗體芯片技術分析各組淚腺和角膜組織的炎癥因子，并篩選出高表達炎癥因子進一步研究（表5）。與正常對照組相比，非那雄胺組淚腺中22種細胞因子的表達水平顯著改變，其中大多數細胞因子是炎癥因子和趨化因子。14種細胞因子（IL-1β，I FN-γ，Fas Ligand，GM-CSF，TNF-α，IL-4，IL-10，CNTF，B7-2/Cd86，Leptin，MMP-8，TIMP-1，L-Selection及 ICAM-1）的表達明顯增加（比值＞1.50）。在高表達的細胞因子中，IL-1β，IL-6，GM-CSF 及TNF-α為促炎因子，IL-4和IL-10為抗炎因子。上述細胞因子在鬼針草治療組表達明顯低于非那雄胺組。上述細胞因子除TNF-α和MMP-8在鬼針草組的表達低于正常對照組，其它細胞因子二組表達無顯著差異。

非那雄胺組大鼠角膜中6種細胞因子的表達水平顯著高于正常對照組，包括Fas Ligand，IL-13，PDGF-AA，B7-2/Cd86，TIMP-1 和 Prolactin R。除了TIMP-1，上述細胞因子在鬼針草治療組角膜中的表達與正常對照組相比均無顯著差異。

表4 各組大鼠不同時間角膜熒光素染色評分比較[M（Q1,Q3）]

表5 各組大鼠淚腺及角膜細胞因子芯片檢測的相對表達結果（xˉ）

續(xù)表

2.5 Western blot檢測

淚腺中的高表達炎癥因子（B7-2/Cd86，IL-1β，IL-4，IL-6，IL-10，MMP-8，FasL，TNF-α 和 TIMP-1）進一步應用Western blot驗證，表達水平見表6及圖1。 非那雄胺組中 IL-1β，IL-4，IL-6，IL-10，MMP-8 及TNF-α的表達水平均明顯高于正常對照組（P＜0.05），B7-2/CD86、TIMP-1和FasL與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與非那雄胺組對比，鬼針草組中IL-1β,FasL 及TNF-α 的表達顯著降低（P＜0.05）。 其它細胞因子也呈現降低趨勢，但無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表6 Western blot法檢測各組大鼠淚腺組織中不同細胞因子表達的光密度值（xˉ±s）

圖1 Western blot法檢測各組大鼠淚腺組織中不同細胞因子表達的電泳圖。A.正常對照組，B.非那雄胺組，C.鬼針草治療組

2.6 淚腺的組織病理

各組淚腺在實驗第28天的病理學改變見圖2。正常對照組的淚腺含有保存良好的腺泡結構，并且沒有顯著的淋巴細胞浸潤（圖2A）。非那雄胺組可見大量的淋巴細胞浸潤，伴有炎細胞侵入小葉間隙并包圍腺泡和導管細胞（圖2B）。鬼針草治療組可見少量的淋巴細胞浸潤，炎癥反應較輕（圖2C）。

3 討論

干眼的發(fā)病機制學說目前多建立在淚腺功能單位的基礎上，認為其特征性病理改變?yōu)闇I腺組織灶性細胞凋亡、炎性細胞浸潤增殖、腺體組織進行性破壞，致使腺體分泌功能下降甚至喪失[14]。目前，干眼的主要治療方法是應用人工淚液的對癥治療，而不是針對發(fā)病機制的病因治療。雖然環(huán)孢素和類固醇激素可通過抑制免疫反應用于干眼的治療，但長期使用也產生了一些不可避免的副作用，如眼表屏障的損害和繼發(fā)感染[15]。目前，關于傳統(tǒng)中藥干預干眼的研究較少，我們在以往的研究[12-13]中已證實，鬼針草提取物通過抑制促炎因子的產生起到抗炎作用，且長期口服鬼針草后觀察無明顯副作用，因此鬼針草治療干眼具有可行性。

雄激素缺乏大鼠干眼模型的特征為淚液分泌減少、眼表損害、淚腺炎癥反應[16]。Singh研究發(fā)現，非那雄胺給藥在雌鼠和雄鼠均可形成性激素缺乏干眼大鼠的理想模型，可以使雌性大鼠淚液分泌量減少49%，雄性大鼠減少40%；還可以下調大鼠淚腺中雄激素受體的數量，但對雌性大鼠的作用是雄性大鼠的8倍。在本研究中，我們以雌性大鼠為造模對象，非那雄胺給藥后出現淚液分泌減少和淚腺炎癥反應，在給藥后的14 d、21 d及28 d，非那雄胺組的淚液分泌明顯低于正常對照組，BUT在給藥后7d、14d、21 d及28 d時也短于正常對照組，說明應用非那雄胺所建立的雄激素缺乏性干眼模型是成功的。

目前發(fā)現鬼針草中含有大約200種不同的化合物，最主要的物質為類黃酮和聚乙炔類，它們是鬼針草中的主要抗炎物質[17]。此外，雄激素和類黃酮都是多酚類化合物。據報道，類黃酮物質具有擬雄激素作用[18]，可用于治療雄激素水平降低的一些疾病，如骨質疏松。雄激素受體廣泛分布于淚腺、角膜及其他眼部組織[19]，理論上鬼針草可應用于治療雄激素缺乏性干眼。在本研究中，我們觀察了鬼針草治療28 d對雄激素缺乏大鼠淚液分泌和淚膜的影響。結果顯示，鬼針草治療后淚液分泌、淚膜膜穩(wěn)定性和角膜上皮損傷都有著顯著改善，且鬼針草亦減輕了淚腺的炎細胞浸潤。

圖2 各組大鼠淚腺組織切片的光學顯微鏡像（HE染色，×400）。2A.正常對照組，2B.非那雄胺組，2C.鬼針草治療組。黑色箭頭為浸潤的淋巴細胞

蛋白芯片是繼基因芯片之后發(fā)展起來的，具有高特異性、高通量、高敏感性、變異小等優(yōu)點[20]，為蛋白質組學的研究提供了新的有力工具。廣義上的蛋白芯片包括表達譜蛋白芯片、多肽芯片和抗體芯片等，細胞因子抗體芯片作為一種定性分析的工具，可以一次同時檢測樣品中大量細胞因子的表達水平，本研究選擇的細胞因子抗體芯片技術平臺可以同時檢測35種細胞因子。從實驗大鼠的淚腺和角膜中篩選出高表達細胞因子，以確定細胞因子的蛋白水平在淚腺或角膜的增加或減少是否與組織病理學和臨床表現有關。研究結果表明，睪酮缺乏會影響細胞因子在淚腺的表達。細胞因子抗體芯片結果顯示，與正常對照組相比，有22種細胞因子在非那雄胺組的改變明顯，其中有15種細胞因子的表達水平顯著增加。而經鬼針草治療后這些細胞因子的表達水平明顯降低。我們對這些高表達的炎癥因子進行了Western blot驗證，結果顯示，與正常對照組相比，非那雄 胺 組 MMP-8，IL-1β，IL-4，IL-6，IL-10，FasL 和TNF-α的表達水平顯著增加。同時，鬼針草給藥后IL-1β，FasL 和 TNF-α 顯著降低。 其中 IL-1β，IL-6和TNF-α為促炎細胞因子，IL-4和IL-10為抗炎因子。上述數據提示，雄激素缺乏性干眼的淚腺炎癥是由炎癥反應和抗炎反應之間的不平衡引起的。

綜上所述，研究結果顯示雄激素缺乏性干眼的淚腺炎癥反應嚴重，相關炎癥因子表達增高，提示性激素與淚腺炎癥反應之間存在相關性。通過鬼針草給藥能夠有效緩解雄激素缺乏性干眼，包括減輕淚腺炎癥，改善淚液分泌和淚膜穩(wěn)定性。我們的研究結果提示鬼針草在治療雄激素缺乏性干眼上具有很好的應用前景。

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Effects of aqueous extract of Bidens pilosa L.on tear secretion and lacrimal gland inflammation of dry eye due to androgen deficiency in rats

YANG Jihong,LI Kai,WANG Yuliang,et al.Nanjing University of Chinese Medicine,Nanjing 210023,China

OBJECTIVE To investigate the effect of the aqueous extract of Bidens pilosa L.(Bp)on tear secretion and lacrimal gland inflammation of dry eye due to androgen deficiency,and further to discuss its possible mechanisms.METHODS Twenty-four Wistar rats were randomly divided into four groups:Group C(control),Group S(physiological saline),Group F(oral finasteride),and Group B(finasteride and Bp by oral).Tear volume was measured by phenol red-impregnated cotton threads with anesthesia.Tear film breakup time(BUT)and corneal epithelial damage were evaluated by fluorescein staining.Animals were sacrificed at the 28th day,gene microarray analysis for inflammatory cytokines of lacrimal gland and cornea,Western blot were also performed.Lacrimal gland was evaluated histopathologically by light microscopy.RESULTS Fourteen days of Finasteride administration effectively induced dry eye in rats.Rats in group F had significantly higher fluorescein staining scores and lower tear volume and BUT than counterparts in group C,and notable inflammatory cell infiltration were observed in the lacrimal gland of rats in group F.The fluorescein staining score,tear volume and BUT significantly improved with Bp treatment in the group B,and the structures of the lacrimal gland were well maintained without significant lymphocyte infiltration.Cytokine antibody array data and Western blot showed that,expression levels of pro-inflammatory cytokines including IL-1β,IL-6 and TNF-α as well as anti-inflammatory cytokines,such as IL-4 and IL-10 in group F were higher than result of group C.Levels of IL-1β,FasL and TNF-α in group B were lower than result in group F.CONCLUSIONS The extract of Bp appeared to be effective on dry eye owing to decreased androgen in that it promoted the tear secretion,stabled tear film and inhibited the inflammation of lacrimal gland.

dry eye;androgen deficiency;Bidens pilosa L.;inflammation;treatment

R285.5

A

1002-4379（2017）04-0211-07

10.13444/j.cnki.zgzyykzz.2017.04.001

江蘇省自然科學基金（BK20141504）；江蘇省六大人才高峰項目（WSW-048）

1南京中醫(yī)藥大學，南京210029

2南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，南京210029

李凱，E-mail：likai8922@163.com