王新宇++胡青霞++馮夢(mèng)晨++劉真真++胡悅++陳延惠

摘 要：以‘突尼斯軟子石榴的1年生休眠期扦插苗為材料，置于-6 ℃低溫條件下，進(jìn)行不同時(shí)間（0，6，12，18，24，30，36，42，48，54 h）的低溫脅迫處理，測(cè)定其根頸部的相對(duì)電導(dǎo)率、過(guò)氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）等抗寒性相關(guān)指標(biāo)，分析‘突尼斯軟子石榴1年生休眠期扦插苗木對(duì)低溫的忍耐程度。結(jié)果表明，在0～30 h低溫脅迫時(shí)間內(nèi)，相對(duì)電導(dǎo)率和MDA含量緩慢升高，可溶性蛋白含量以及CAT，SOD，POD活性基本不變，成活率均高于40%；在-6 ℃下脅迫36 h時(shí)，其相對(duì)電導(dǎo)率、可溶性蛋白含量、MDA含量以及CAT，SOD，POD活性均顯著升高，且CAT，SOD和POD活性達(dá)到峰值，成活率僅為5%；過(guò)長(zhǎng)的脅迫時(shí)間（42，48，54 h）則使CAT，SOD，POD活性降低，成活率為0。因此，‘突尼斯軟子石榴1年生休眠期苗木由于其根系淺，置于-6 ℃低溫條件下只能忍受36 h的處理時(shí)間，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致死亡。

關(guān)鍵詞：石榴；突尼斯軟子；低溫脅迫

中圖分類號(hào)：S665.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2017.10.017

Study on Low Temperature Tolerance of 'Tunisian Soft-seeded' Pomegranate Varieties

WANG Xinyu， HU Qingxia， FENG Mengchen， LIU Zhenzhen， HU Yue， CHEN Yanhui

（College of Horticulture， Henan Agricultural University， Zhengzhou， Henan 450002， China）

Abstract： Taking one year old green cuttings of 'Tunisian soft-seeded' pomegranate as materials， the indexes such as conductivity， catalase （CAT）， superoxide dismutase （SOD） and peroxidase （POD） was assayed for the root crown of 'Tunisian Soft-seeded pomegranate at -6 ℃ for different time stress（0， 6， 12， 18， 24， 30， 36， 42， 48， 54 h）. The results showed that the contents of soluble protein， CAT， SOD and POD were almost the same， and the survival rate was higher than 40% for 0～30 h at -6 ℃. Howerver ，the contents of CAT， SOD and POD were higher than those of CAT， SOD and POD， and the survival rate was only 5% for 36 at -6 ℃. Overexpression time （42， 48， 54 h） decreased the activity of CAT， SOD and POD， and the survival rate was 0. Therefore， the results of the study indicated that the 'Tunisian Soft-seeded' pomegranate one year old dormant seedlings placed at -6 ℃ could only endure 36 h of treatment time， too long time could lead to death because of its shallow roots.

Key words： pomegranate； 'Tunisian Soft-seeded'； low temperature stress

‘突尼斯軟子石榴原產(chǎn)于突尼斯等地中海氣候類型國(guó)家，在20世紀(jì)80年代被引種于鄭州滎陽(yáng)市，由于其綜合性狀表現(xiàn)優(yōu)良，從而成為石榴中的精品，廣受消費(fèi)者的喜愛(ài)[1]。但‘突尼斯軟子石榴喜溫懼寒，引種鄭州后的凍害問(wèn)題很嚴(yán)峻，由此給種植戶造成的經(jīng)濟(jì)損失不容小覷。關(guān)于解決‘突尼斯軟子石榴的凍害問(wèn)題，有許多相關(guān)的報(bào)道。LUKATKIN等[2]對(duì)凍害的機(jī)理進(jìn)行了綜述，楊雪梅等[3]通過(guò)測(cè)電導(dǎo)率等指標(biāo)對(duì)不同品種石榴的抗寒性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，郭曉麗[4]通過(guò)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)抗寒基因來(lái)提高‘突尼斯軟子石榴的抗寒力。有研究表明，凍害與低溫和低溫持續(xù)時(shí)間均有關(guān)系[5]，石榴在氣溫低于-10 ℃超過(guò)0.5 d就會(huì)發(fā)生凍害[6]，電導(dǎo)率和半致死溫度是研究石榴凍害的主要指標(biāo)[7]。但是，目前關(guān)于具體的低溫及其持續(xù)時(shí)間對(duì)石榴凍害的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。

本試驗(yàn)主要研究了在石榴主產(chǎn)區(qū)的常見(jiàn)最低溫（-6 ℃）條件下，不同時(shí)間處理對(duì)‘突尼斯軟子石榴凍害的影響，旨在為其他地區(qū)引種栽培提供一定參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為1年生‘突尼斯軟子石榴扦插苗。選擇粗度為0.7～0.8 cm、高度為120～130 cm、生長(zhǎng)狀況相對(duì)一致的幼苗，于2016年12月假植到河南農(nóng)業(yè)大學(xué)果樹試驗(yàn)園，隨用隨取。

1.2 試驗(yàn)方法

將所選幼苗栽植在盆（直徑30 cm，高40 cm）中，土與基質(zhì)比例是2∶1，盆外層包裹厚度0.3 cm的植物保護(hù)被，然后放入（-6±1）℃冷庫(kù)。每個(gè)處理30株苗，每隔6 h取出一組，共取9組，解凍12 h后取樣進(jìn)行拍照和生理生化分析。取出后即進(jìn)行電導(dǎo)率測(cè)定，其他生理生化指標(biāo)測(cè)定前可將幼苗的根頸部剪成長(zhǎng)15 cm的頸段，放入自封袋中并做好標(biāo)記，液氮預(yù)冷后，立即放入-80 ℃的超低溫冰箱內(nèi)保存待測(cè)。endprint

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.3.1 成活率調(diào)查 將處理過(guò)的苗木栽植于河南農(nóng)業(yè)大學(xué)果樹試驗(yàn)園，寬窄行種植，每個(gè)處理20株，于2017年3月進(jìn)行成活率調(diào)查。

1.3.2 生理生化指標(biāo)測(cè)定 相對(duì)電導(dǎo)率參考賀普超等[8]的方法進(jìn)行，可溶性糖含量采用蒽酮比色法測(cè)定，可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定，MDA含量及CAT，SOD，POD活性采用比色法測(cè)定[9-11]，3次重復(fù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel軟件進(jìn)行處理，采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同持續(xù)時(shí)間對(duì)‘突尼斯軟子石榴根頸部相對(duì)電導(dǎo)率的影響

將休眠期1年生‘突尼斯軟子石榴苗木置于-6 ℃低溫下，通過(guò)不同脅迫時(shí)間處理，解凍后測(cè)其根頸部枝條的相對(duì)電導(dǎo)率，結(jié)果如圖1所示。從圖1可以看出，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，相對(duì)電導(dǎo)率逐漸上升；其中，在低溫脅迫30 h內(nèi)，相對(duì)電導(dǎo)率隨著脅迫時(shí)間的加長(zhǎng)，相對(duì)電導(dǎo)率緩慢上升；在低溫脅迫36 h時(shí)，相對(duì)電導(dǎo)率顯著升高至73.84%；在54 h時(shí)，相對(duì)電導(dǎo)率達(dá)到最大值80%。可見(jiàn)，從電導(dǎo)率來(lái)看，-6 ℃低溫脅迫36 h為‘突尼斯軟子石榴的低溫忍耐極限。

2.2 不同持續(xù)時(shí)間對(duì)‘突尼斯軟子石榴根頸部可溶性蛋白含量的影響

從圖2可以看出，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，可溶性蛋白在24 h內(nèi)先保持平穩(wěn)，后又急劇上升。其中，低溫脅迫0～30 h內(nèi)，可溶性蛋白含量基本不變，均維持在140 g·g -1左右；在處理時(shí)間達(dá)到36 h時(shí)，可溶性蛋白含量顯著升高。可見(jiàn)，從可溶性蛋白這個(gè)指標(biāo)來(lái)看，-6 ℃低溫脅迫36 h為‘突尼斯軟子石榴的低溫忍耐極限。

2.3 不同持續(xù)時(shí)間對(duì)‘突尼斯軟子石榴根頸部丙二醛含量的影響

從圖3可以看出，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，丙二醛含量呈逐漸上升的趨勢(shì)。其中，在低溫脅迫30 h內(nèi)，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，丙二醛含量緩慢上升。在低溫脅迫36 h時(shí)，丙二醛含量顯著升高。可見(jiàn)，從丙二醛來(lái)看，-6 ℃低溫脅迫36 h為‘突尼斯軟子石榴的低溫忍耐極限。

2.4 不同持續(xù)時(shí)間對(duì)‘突尼斯軟子石榴根頸部中CAT活性的影響

從圖4可以看出，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，CAT活性呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)。在低溫脅迫0～24 h內(nèi)，CAT活性基本保持不變；低溫脅迫30 h時(shí)，CAT活性緩慢升高；在低溫脅迫36 h時(shí)，CAT活性顯著升高且達(dá)到最大，之后又急劇下降。可見(jiàn)，從CAT來(lái)看，-6 ℃低溫脅迫36 h為‘突尼斯軟子石榴的低溫忍耐極限。

2.5 不同持續(xù)時(shí)間對(duì)‘突尼斯軟子石榴根頸部SOD活性的影響

從圖5可以看出，隨著脅迫時(shí)間的增加，SOD活性呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)。其中，在30 h之前，SOD活性基本不變；36 h突然增加并達(dá)到最大值，顯著高于其他處理，之后又下降?？梢?jiàn)，從SOD活性的變化來(lái)看，-6 ℃低溫脅迫36 h為‘突尼斯軟子石榴的低溫忍耐極限。

2.6 不同持續(xù)時(shí)間對(duì)‘突尼斯軟子石榴根頸部POD活性的影響

從圖6可以看出，隨著脅迫時(shí)間的增加，POD活性呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)。其中，在30 h之前，POD活性基本不變；36 h突然增加并達(dá)到最大值，顯著高于其他處理；之后又下降?？梢?jiàn)，從POD活性的變化來(lái)看，-6 ℃低溫脅迫36 h為‘突尼斯軟子石榴的低溫忍耐極限。

2.7 不同持續(xù)時(shí)間對(duì)‘突尼斯軟子石榴成活率的影響

從表1可以看出，隨著低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，成活率逐漸下降。其中，在0～30 h時(shí)，成活率下降較為緩慢；在處理36 h時(shí)，成活率急劇下降，由處理30 h時(shí)的40%降到5%；之后的處理其成活率為0?？赡苁且?yàn)榈蜏貙?dǎo)致‘突尼斯軟子石榴各種代謝失調(diào)，無(wú)法正常生長(zhǎng)?？梢?jiàn)，從成活率來(lái)看，-6 ℃低溫脅迫36 h為‘突尼斯軟子石榴的低溫忍耐極限。

3 結(jié)論與討論

當(dāng)冷害、凍害發(fā)生時(shí)，對(duì)低溫敏感的植物細(xì)胞就會(huì)發(fā)生多重紊亂，其高爾基體、線粒體、葉綠體、核糖體、淀粉粒均會(huì)發(fā)生顯著改變，膜也會(huì)發(fā)生膨脹。低溫過(guò)后，由于細(xì)胞的自身調(diào)節(jié)能力有限，無(wú)法恢復(fù)原狀，則會(huì)導(dǎo)致膜破裂。這使細(xì)胞質(zhì)的流動(dòng)速度發(fā)生明顯改變，為維持穩(wěn)定，細(xì)胞里的溶質(zhì)會(huì)透過(guò)細(xì)胞膜，在一定的時(shí)間內(nèi)，這些溶質(zhì)可溶于外界的水中，從而可以通過(guò)電導(dǎo)法測(cè)出[2]。本研究結(jié)果表明，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，相對(duì)電導(dǎo)率逐漸上升，這與前人在葡萄[12]、核桃[13]、杏[14]、梨[15]、香蕉[16]、菊花[17]、連翹[18]、石榴[3]上的研究結(jié)果相似。在36 h時(shí)相對(duì)電導(dǎo)率顯著上升，表明‘突尼斯軟子石榴在持續(xù)脅迫36 h時(shí)，其細(xì)胞膜破損程度明顯加重，無(wú)法再忍受更長(zhǎng)時(shí)間的低溫脅迫。

植物在遭受低溫時(shí)，體內(nèi)的物質(zhì)分解大于物質(zhì)合成，體內(nèi)淀粉水解為葡萄糖，同時(shí)蛋白質(zhì)的水解能力加強(qiáng)，可溶性蛋白的含量增加[19]。本試驗(yàn)在36 h時(shí)，可溶性蛋白含量顯著升高，在54 h時(shí)達(dá)到最大值，表明‘突尼斯軟子石榴可通過(guò)增加可溶性蛋白含量來(lái)抵御凍害。

在逆境條件下，植物體內(nèi)的氧代謝失調(diào)，致使活性氧增多，從而導(dǎo)致膜脂過(guò)氧化，MDA作為膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物之一，其含量應(yīng)增加[20]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，MDA含量逐漸上升，這與大多數(shù)有關(guān)抗寒性相關(guān)研究的結(jié)果一致，但有的研究卻表明，MDA呈現(xiàn)先上升下降的趨勢(shì)[12-18，21]。這可能與所研究的植物種類、樹齡、樹體營(yíng)養(yǎng)狀況、低溫條件以及低溫脅迫時(shí)間等因素有關(guān)。

SOD，POD，CAT是三大保護(hù)酶，在抗寒方面具有無(wú)可替代的作用[22]。其中，SOD主要清除超氧陰離子自由基，與其反應(yīng)生成過(guò)氧化氫（H2O2）[23]。雖然過(guò)氧化氫可作為第2信使激活植物體內(nèi)的防御基因進(jìn)行抗寒，但過(guò)多的過(guò)氧化氫在植物體內(nèi)是有毒性的，因此，植物中過(guò)多的過(guò)氧化氫將主要由CAT和POD清除[24]。前人在研究葡萄[12]、杏[14]、梨[15]等植物的抗寒性時(shí)，隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，SOD， POD，CAT三大保護(hù)酶活性均有隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)呈先升高后下降的變化趨勢(shì)，將其視作評(píng)判抗寒性的重要指標(biāo)。在本研究中，石榴的這3種酶同樣反映了石榴自身的抗寒水平。endprint

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