賈艷萍 殷愛鳴， 孫艷梅 程首濤 王旭明

（1. 東北電力大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，吉林 132012；2. 北京市農(nóng)林科學(xué)院北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心，北京 100097）

產(chǎn)聚谷氨酸菌株的篩選及菌株發(fā)酵液對(duì)玉米幼苗抗旱性的作用

賈艷萍1殷愛鳴1，2孫艷梅2程首濤2王旭明2

（1. 東北電力大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，吉林 132012；2. 北京市農(nóng)林科學(xué)院北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心，北京 100097）

聚谷氨酸（poly-γ-glutamic acid，γ-PGA）作為新型生物保水劑，具有重要的農(nóng)業(yè)應(yīng)用價(jià)值。從納豆和豆豉樣品中分離篩選到2株聚谷氨酸產(chǎn)生菌Y2與P1。經(jīng)形態(tài)、生理生化特征以及16S rRNA 序列分析，鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。研究分析聚谷氨酸產(chǎn)生菌發(fā)酵液對(duì)土壤持水性以及干旱脅迫下玉米抗旱能力的影響。結(jié)果表明，Y2和P1菌株發(fā)酵液對(duì)土壤水分蒸發(fā)有明顯的減緩效果。與對(duì)照相比，施加聚谷氨酸發(fā)酵液土壤含水率提高近4%。同時(shí)增強(qiáng)玉米幼苗的抗旱性，顯著提高了玉米幼苗地上部和地下部生物量。菌株P(guān)1的發(fā)酵液可使玉米幼苗的地上與地下生物量分別提高40.70%與19.59%。BiologECO結(jié)果顯示，添加菌株Y2和P1的聚谷氨酸發(fā)酵液未顯著影響土壤中常見微生物群落的代謝多樣性和均度。本研究的聚谷氨酸發(fā)酵液是一種安全的生物保水劑，可擴(kuò)大應(yīng)用于田間生態(tài)系統(tǒng)，以增強(qiáng)土壤保水性及植被的抗旱能力。

聚谷氨酸；抗旱；干旱脅迫；土壤微生物

我國是水資源嚴(yán)重短缺的國家，干旱、半干旱地區(qū)約占國土面積的一半以上，是世界上21個(gè)貧水和最缺水的國家之一［1］。干旱嚴(yán)重影響農(nóng)作物的生長(zhǎng)和產(chǎn)量，資料顯示，因干旱損失的糧食占各種自然災(zāi)害造成糧食損失的60%以上［2］。目前我國北方部分地區(qū)，水資源開發(fā)利用已經(jīng)超過資源環(huán)境的承受能力，成為工業(yè)化和城市化發(fā)展的瓶頸。其中，淡水資源70% 用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，因此發(fā)展節(jié)水農(nóng)業(yè)是應(yīng)對(duì)水資源危機(jī)的必由之路［3-5］。微生物土壤修復(fù)技術(shù)與物理、化學(xué)技術(shù)相比，具有廉價(jià)、高效、不易產(chǎn)生二次污染等特點(diǎn)［6-7］。開發(fā)抗旱的微生物菌劑，通過施加菌劑改善土壤的理化性質(zhì)及植物的抗逆性、促進(jìn)植物生長(zhǎng)，對(duì)于大面積干旱退化土壤的修復(fù)、提高水源涵養(yǎng)、治理水土流失、發(fā)展高效節(jié)水農(nóng)業(yè)具有重要意義。

微生物分泌的聚谷氨酸（Poly-γ-glutamic acid，γ-PGA）具有良好的保水性，聚谷氨酸是一種高分子氨基酸聚合物，其分子鏈上具有大量游離羧基，水溶性好，保水性強(qiáng)，同時(shí)具有無毒害、可生物降解、生產(chǎn)成本低等優(yōu)良特性，它在農(nóng)業(yè)上已經(jīng)表現(xiàn)出非常廣闊的應(yīng)用前景［8］。張新民等［9］研制的聚谷氨酸吸水材料的吸水率為化學(xué)常用的保水劑聚丙烯酸2.85倍，聚谷氨酸較強(qiáng)的保水性，可使水分在土壤中緩慢釋放，提高土壤水分的有效性［10-11］。聚谷氨酸同時(shí)具有減滲作用，可改變土壤剖面含水率的分布情況，使水分集中在作物根部［12］。因此開發(fā)高效的分泌聚谷氨酸的微生物，具有重要的實(shí)用價(jià)值。

目前國內(nèi)外對(duì)于聚谷氨酸在農(nóng)業(yè)方面的研究多集中在其發(fā)酵條件優(yōu)化、自身材料的改進(jìn)和對(duì)植物生長(zhǎng)及土壤理化性質(zhì)的影響［13-15］，但關(guān)于聚谷氨酸對(duì)土壤微生物的影響還鮮有報(bào)道。本研究旨在篩選聚谷氨酸產(chǎn)生菌，并利用其發(fā)酵液進(jìn)行土壤保水性實(shí)驗(yàn)，通過盆栽試驗(yàn)研究細(xì)菌發(fā)酵液對(duì)植物抗旱性以及土壤微生物群落的作用，旨為聚谷氨酸應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料及試劑 納豆及豆豉購自超市；葡萄糖、胰蛋白胨、酵母膏、谷氨酸鈉、氯化鈉、瓊脂、氯化銨等均為國產(chǎn)分析純；聚谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)品購自sigma公司；DNA提取試劑盒購自天根公司；引物合成由生工生物工程有限公司合成；DNA測(cè)序由北京博邁德生物科技有限公司完成。

1.1.2 培養(yǎng)基 產(chǎn)聚谷氨酸菌株的分離及保存采用LB固體培養(yǎng)基：酵母粉5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，瓊脂 20 g/L，pH 7.0，121℃滅菌 20min。以LB液體培養(yǎng)基作為種子培養(yǎng)基。發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，酵母粉1 g/L，谷氨酸鈉18 g/L，（NH4）2SO41g/L，CaCl20.2 g/L，K2HPO40.5 g/L，MgSO40.1 g/L。

1.2 方法

1.2.1 產(chǎn)聚谷氨酸菌株的分離及發(fā)酵培養(yǎng) 產(chǎn)聚谷氨酸菌株初篩：稱取 2 g納豆或豆豉于10 mL無菌水中，振蕩2 min，靜置30 min，然后放水浴鍋中，100℃維持5 min。冷卻后吸取上清液1mL，采用平板培養(yǎng)法進(jìn)行系列稀釋涂布，37℃培養(yǎng)24 h，挑取生長(zhǎng)迅速并且能夠拉絲的單菌落，分離純化后于LB試管斜面培養(yǎng)基4℃保存。復(fù)篩：將初篩得到的菌株接種到種子培養(yǎng)基中，37℃、150 r/min培養(yǎng)20 h，然后按2%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min培養(yǎng)48 h，發(fā)酵液用黏度計(jì)測(cè)量表觀黏度，選擇黏度較大的菌株作為復(fù)篩菌株。

1.2.2 聚谷氨酸產(chǎn)物的提取純化及產(chǎn)物分析

1.2.2.1 提取純化 將以上篩選獲得的黏度較大菌株的發(fā)酵液8 000 r/min離心15 min，去除菌體，取上清液用HCl調(diào)pH至3-4，加4倍的無水乙醇，低溫靜置過夜。去上清液得粗品，透析脫鹽過夜。將透析后的樣品進(jìn)行冷凍干燥，得到純化粗品。

1.2.2.2 產(chǎn)物分析 （1）聚谷氨酸的水解：取0.05 g純化樣品，放入水解管中，加入10 mL、6 mol/L的HCl，通入氮?dú)?，維持5 min后封口，120℃水解12h，冷卻后過濾至小燒杯中備用。（2）紫外掃描光譜分析：將水解后的溶液稀釋4倍，在190-600 nm的波長(zhǎng)下進(jìn)行紫外掃描，與聚谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行對(duì)比。（3）質(zhì)譜-同位素內(nèi)標(biāo)法分析：利用高效液相色譜-四級(jí)桿離子阱串聯(lián)質(zhì)譜儀HPLC-MS/MS Q-TRAP分析水解液中氨基酸的組成及含量。

1.2.3 產(chǎn)聚谷氨酸菌株鑒定 （1）生理生化鑒定：菌體形態(tài)、生理生化與Biolog GENIII鑒定板鑒定。（2）菌株16S rRNA鑒定：采用細(xì)菌DNA提取試劑盒（MoBio）進(jìn)行菌體DNA提取。擴(kuò)增應(yīng)用細(xì)菌通用引物 27F ：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，1492R ：5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'［16］。測(cè)序由北京博邁德公司完成。

1.2.4 聚谷氨酸產(chǎn)生菌對(duì)土壤保水性分析 將土壤去除雜質(zhì)，烘干充分研碎后備用。取6 mL聚谷氨酸發(fā)酵液稀釋液，以蒸餾水作為對(duì)照，將水或聚谷氨酸發(fā)酵液充分拌于16 g烘干土壤中，然后均勻分散在直徑為9 cm的表面皿中。將表面皿放置恒溫40℃的培養(yǎng)箱中，定時(shí)取出稱重，計(jì)算失水量：

式中：Q'為保水劑的失水量（g），Mt0為最初表面皿的總重量（g），Mt 為t 時(shí)刻表面皿的總重量（g）。

1.2.5 玉米盆栽實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)于2017年3月至4月在北京市農(nóng)林科學(xué)院玻璃溫室內(nèi)進(jìn)行。用塑料盆（120×100 mm）裝400 g混合土（大田土∶營(yíng)養(yǎng)土∶蛭石=1V∶1V∶1V），土壤田間持水量為15.22%，室溫為20.8-35.4℃，濕度7.9%-12.3%，采用自然光照。供試玉米品種為鄭58，挑取飽滿玉米種子在28℃暗箱里進(jìn)行催芽育苗，3-4 d后選取生長(zhǎng)和健壯程度一致的玉米苗移栽。玉米在三葉一心期進(jìn)行控水，實(shí)驗(yàn)共設(shè)3個(gè)處理（聚谷氨酸發(fā)酵液P1，聚谷氨酸發(fā)酵液Y2，自來水），每個(gè)處理設(shè)置5盆重復(fù)，每盆種3株。每周測(cè)一次生態(tài)指標(biāo)，包括玉米的苗長(zhǎng)、最大葉片葉面長(zhǎng)和寬。盆栽實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，分別將植株的莖葉和根放在80℃烘箱中烘干24 h，記錄植株地上部分和地下部分干重。

1.2.6 土壤理化性質(zhì)和微生物群落代謝特征測(cè)定方法 土壤含水率采用烘干法，pH和電導(dǎo)率分別使用pH計(jì)和電導(dǎo)率儀。采用BiologECO微平板測(cè)定微生物代謝特征，該板包括31種碳源和空白對(duì)照，各3個(gè)重復(fù)。取新鮮土樣制成微生物加樣液，每孔加入150 μL置于28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)10 d，每隔24 h用Biolog細(xì)菌自動(dòng)讀數(shù)儀讀數(shù)。選取144 h的Biolog平均光密度吸收值進(jìn)行后續(xù)數(shù)據(jù)的處理。

1.2.7 微生物群落代謝特征多樣性計(jì)算 經(jīng)檢測(cè)得到的每個(gè)吸光度值數(shù)據(jù)都是微生物對(duì)碳源利用的量值體現(xiàn)，這些量的差異主要由平均色度值（Average well color development，AWCD）、Shannon-Wiener多樣性指數(shù)（H'）、Mclntosh 多樣性指數(shù)（U）、Simpson 優(yōu)勢(shì)度指數(shù)（D）以及Pielou 均勻度指數(shù)（Jsw）來表征。其計(jì)算公式分別如下：

式中，n 為培養(yǎng)基碳源種類數(shù)（本研究n = 31），Ci為第i（i = 1，2，3…，31）個(gè)非對(duì)照孔的吸光度值，R為對(duì)照孔的吸光度值，Pi為第i個(gè)非對(duì)照孔的吸光度值與所有非對(duì)照孔吸光度值總和的比值。采用EXCEL2013進(jìn)行數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)處理，采用R語言進(jìn)行數(shù)據(jù)差異顯著性分析。

2 結(jié)果

2.1 聚谷氨酸產(chǎn)生菌的分離及鑒定

2.1.1 聚谷氨酸產(chǎn)生菌的分離 采用平板培養(yǎng)法，從3種不同的納豆樣品和1種豆豉中分離、純化，初篩得到6株生長(zhǎng)迅速并且能夠拉絲的菌株。經(jīng)過搖瓶發(fā)酵復(fù)篩得到表觀黏度較大的菌株2株（表1）。其中Y2和P1產(chǎn)聚谷氨酸穩(wěn)定，產(chǎn)量可達(dá)6 g/L和6.59 g/L。

表1 聚谷氨酸產(chǎn)生菌發(fā)酵液黏度及產(chǎn)量

2.1.2 菌株發(fā)酵產(chǎn)物的鑒定 將水解后的溶液稀釋4倍，在190-600 nm的波長(zhǎng)下進(jìn)行紫外掃描，與聚谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行對(duì)比（圖1）。樣品水解液與聚谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)品在264 nm處均出現(xiàn)吸收峰，因此可以確定為發(fā)酵產(chǎn)物由谷氨酸聚合而成。此外在218 nm處出現(xiàn)吸收峰，據(jù)資料顯示聚谷氨酸的吸收峰為216nm，由紫外掃描的光譜圖鑒定菌株P(guān)1與Y2的產(chǎn)物為聚谷氨酸。利用質(zhì)譜-同位素內(nèi)標(biāo)法檢測(cè)水解液中50種常見氨基酸的組成及含量（圖2）。P1和Y2水解液中谷氨酸含量分別占92.63%和95.48%，因此可以確定菌株發(fā)酵液的主要產(chǎn)物為谷氨酸聚合而成的高分子聚合物聚谷氨酸。

圖1 菌株發(fā)酵產(chǎn)物水解液的紫外掃描峰圖

圖2 菌株發(fā)酵產(chǎn)物水解液的氨基酸組成

2.1.3 菌株的鑒定

2.1.3.1 形態(tài)特征 篩選出的菌株菌落表面光滑。生長(zhǎng)到一定程度后就變成奶白色菌落，傘形，菌落表面有褶皺，菌落較大，挑取菌落，會(huì)出現(xiàn)拉絲。取少量種子液進(jìn)行革蘭氏鑒定，為革蘭氏陽性菌。經(jīng)芽孢染色，可觀察到桿狀細(xì)胞，有芽孢。

2.1.3.2 生理生化特征 對(duì)P1和Y2菌株進(jìn)行了部分生理生化鑒定，并使用Biolog GENIII鑒定板進(jìn)行菌株碳代謝情況的測(cè)定，得到P1和Y2菌株可以水解淀粉，葡萄糖產(chǎn)酸，好氧，甲基紅陽性，利用葡萄糖，蔗糖，山梨醇，丙氨酸，天冬氨酸，蘋果酸和甲酸（表2）。

表2 Y2和P1菌株的表型特征

2.1.3.3 16S rRNA鑒定 從菌株基因組內(nèi)擴(kuò)增出1 500 bp 的單一條帶，經(jīng)測(cè)序確定16S rRNA 基因序列。序列與NCBI 數(shù)據(jù)庫中的16S rRNA 序列進(jìn)行BLAST 比對(duì)分析。比對(duì)結(jié)果表明，NCBI 數(shù)據(jù)庫中與菌株Y2與P1相似度較高的菌株均屬于枯草芽孢桿菌，利用MEGA軟件，將Y2與P1菌株16S rRNA序列與GenBank數(shù)據(jù)中已知菌株的序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果（圖3）顯示Y2和P1與Bacillus subtilis subsp.subtilis str.168（NC000964）、Bacillus subtilis subsp.subtilis strain PCD3（KY910140）、Bacillus subtilis strain TLO3（CP021169） 和 Bacillus subtilis strain SFA6（HM486416）聚集在一起，因此在分子水平上確定Y2和P1菌株為枯草芽孢桿菌。

2.2 聚谷氨酸發(fā)酵液對(duì)土壤保水性及玉米苗期抗旱性分析

2.2.1 聚谷氨酸發(fā)酵液對(duì)土壤保水性能分析 為檢測(cè)菌株聚谷氨酸發(fā)酵液對(duì)土壤的保水性，將聚谷氨酸發(fā)酵液加到干土中，40℃恒溫蒸發(fā)30 h，加聚谷氨酸發(fā)酵液的樣品土壤失水率始終低于加蒸餾水的樣品，蒸發(fā)3 h各處理組失水率基本一致，分別為8.06%、7.57%和7.5%，這可能是由于泥土表面的水分相對(duì)比較均勻的蒸發(fā)；到第6 h發(fā)酵液處理組的失水率明顯低于對(duì)照組，P1聚谷氨酸發(fā)酵液、Y2聚谷氨酸發(fā)酵液與蒸餾水的失水率分別為16.93%、17.47%和20.61%（圖4）。說明聚谷氨酸發(fā)酵液可以減緩?fù)寥乐兴值恼舭l(fā)，對(duì)土壤有一定保水效果；到第20 h處理組與對(duì)照組差異減小，各處理組失水量基本不變。

圖3 Y2和P1菌株的16S rRNA的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖4 聚谷氨酸發(fā)酵液對(duì)土壤的保水作用

2.2.2 聚谷氨酸發(fā)酵液對(duì)玉米苗期抗旱性作用 為試驗(yàn)聚谷氨酸發(fā)酵液在玉米幼苗生長(zhǎng)過程的作用，兩周施用一次聚谷氨酸發(fā)酵液的2倍稀釋液，共施加兩次?？刂仆寥篮繛樘镩g最大持水量的30%-40%，相當(dāng)中度干旱脅迫，移栽30 d后，測(cè)定植株生長(zhǎng)狀況。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，聚谷氨酸發(fā)酵液Y2處理可提高玉米幼苗的株高及生物量，但提高幅度小于聚谷氨酸發(fā)酵液P1。P1處理使玉米幼苗株高與最大葉面積顯著增加；地上與地下生物量分別提高40.70%與19.59%，差異達(dá)到顯著水平（P ＜0.05）（表3）。由此可見，聚谷氨酸發(fā)酵液P1可增強(qiáng)玉米幼苗的抗旱性，同時(shí)對(duì)其生長(zhǎng)具有良好的促進(jìn)作用。

表3 干旱脅迫24 d聚谷氨酸發(fā)酵液對(duì)玉米幼苗的影響

2.3 聚谷氨酸發(fā)酵液對(duì)玉米幼苗根際土壤環(huán)境的影響

2.3.1 聚谷氨酸發(fā)酵液對(duì)玉米幼苗根際土壤理化性質(zhì)的影響 為進(jìn)一步研究菌株的聚谷氨酸發(fā)酵液施加到土壤中是否對(duì)土壤理化性質(zhì)造成影響，本研究分析了施加聚谷氨酸土壤中各項(xiàng)理化指標(biāo)的變化。在盆栽實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，測(cè)量各處理土壤的含水率、pH和電導(dǎo)率。結(jié)果（表4）表明，聚谷氨酸發(fā)酵液處理對(duì)土壤pH和電導(dǎo)率基本無影響。處理組與對(duì)照組的pH在7.3-7.4左右，為中性。P1處理組的電導(dǎo)率略高于對(duì)照組和Y2處理組，但差異不顯著。兩株聚谷氨酸發(fā)酵液P1和Y2處理的土壤含水率分別為 9.08%和9.18%均高于對(duì)照組土壤，差異達(dá)到顯著水平（P ＜ 0.05）。由此可知，聚谷氨酸發(fā)酵液的施加減緩?fù)寥乐兴值恼舭l(fā)，緩解干旱脅迫對(duì)玉米幼苗的危害。

表4 土壤理化指標(biāo)變化

2.3.2 聚谷氨酸發(fā)酵液對(duì)玉米幼苗根際土壤微生物代謝多樣性的影響 采用Biolog ECO 微平板技術(shù)檢測(cè)了土壤微生物的代謝多樣性，平均顏色變化率（Average well color development，AWCD）表征微生物群落碳源利用率，反映了土壤微生物活性、微生物群落生理功能多樣性。連續(xù)10 d每隔24 h測(cè)AWCD，從圖5中可以看出，AWCD隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而提高，不同處理都表現(xiàn)出在開始的24 h變化不大，而在第24-72 h內(nèi)快速升高，隨后持續(xù)緩慢地升高直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束。不同處理AWCD的變化情況基本一致，表明聚谷氨酸發(fā)酵液的施加對(duì)碳代謝微生物的影響較小。為了進(jìn)一步分析施加聚谷氨酸發(fā)酵液對(duì)土壤微生物豐度及均度的影響，計(jì)算了Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、Pielou 指數(shù)與Mclntosh指數(shù)，它們分別反映土壤微生物物種的豐富度、優(yōu)勢(shì)度以及群落物種的均勻度。Shannon指數(shù)的結(jié)果（表5）表明，施加菌株P(guān)1的聚谷氨酸發(fā)酵液，玉米根際土壤微生物群落多樣性呈增加趨勢(shì)，施加菌株Y2的聚谷氨酸發(fā)酵液處理多樣性降低，然而施加發(fā)酵液處理與對(duì)照組相比并沒有顯著性差異。Pielou和McIntosh指數(shù)的結(jié)果顯示，P1處理的微生物均勻度最高；與處理組相比，加Y2聚谷氨酸發(fā)酵液略降低土壤微生物的均勻度。Simpson指數(shù)較多反映群落中常見的物種［17］，本研究中與對(duì)照水處理相比，P1與Y2處理沒有顯著差異（P＞0.05），可見施加菌株的聚谷氨酸發(fā)酵液對(duì)土壤中常見微生物的多樣性和均度沒有顯著影響。

圖5 微生物AWCD值隨培養(yǎng)時(shí)間的變化曲線

3 討論

3.1 菌株聚谷氨酸發(fā)酵液的保水性能

本研究從豆豉和納豆中分離得到兩株聚谷氨酸產(chǎn)生菌，經(jīng)生理生化、Biolog GEN III鑒定板以及16s rRNA鑒定兩株菌均為枯草芽孢桿菌。應(yīng)用菌株的聚谷氨酸發(fā)酵液對(duì)土壤保水性能分析及玉米盆栽實(shí)驗(yàn)，研究發(fā)現(xiàn)這兩株聚谷氨酸產(chǎn)生菌的發(fā)酵液均可減緩?fù)寥乐兴值恼舭l(fā)，土壤含水率均高于對(duì)照組土壤。聚谷氨酸發(fā)酵液可能在土壤表面形成保護(hù)膜，使水分可以較長(zhǎng)時(shí)間的保持在土壤中、緩慢釋放，以提高土壤水分的有效性。一些研究者認(rèn)為聚谷氨酸粉末拌土不但增加了土壤的持水性，還能改變土壤剖面水分的分布形態(tài)，使水分蓄積在作物根部土層區(qū)［9］。這與聚谷氨酸的分子結(jié)構(gòu)相關(guān)，其上含有大量的親水性羧基和肽鍵，易交聯(lián)、吸水飽和形成水凝膠，從而增加土壤顆粒的持水容量及釋放速率。已有研究也表明聚谷氨酸可以使土壤顆粒膨脹，引起土壤結(jié)構(gòu)、孔隙改變，增強(qiáng)土壤通透性［18］，同時(shí)具有一定的緩沖作用，能有效平衡土壤酸堿性［19］。盆栽實(shí)驗(yàn)表明在中度干旱脅迫下，聚谷氨酸發(fā)酵液的施加可顯著提高玉米幼苗的株高和生物量，施加聚谷氨酸發(fā)酵液P1對(duì)玉米幼苗有明顯的促生效果。朱安婷等［20］研究也證明聚谷氨酸施加可以提高水稻幼苗的葉片活力，增加滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累，緩解干旱對(duì)水稻幼苗的傷害。然而菌株Y2的聚谷氨酸發(fā)酵液相對(duì)于對(duì)照組增長(zhǎng)不顯著（P＞0.05），這可能是與兩株菌的發(fā)酵產(chǎn)物的分子量和濃度不同有關(guān)。郝榮華等［21］的研究表明，不同分子量的聚谷氨酸能夠不同程度地增加幼苗的株高、根長(zhǎng)以及鮮重等指標(biāo)。由此可見，菌株的聚谷氨酸發(fā)酵液可增加植被在輕中度干旱土壤中的抗脅迫能力，提高植被的生物量。

表5 不同處理微生物多樣性與均度指數(shù)變化

3.2 聚谷氨酸發(fā)酵液對(duì)土壤微生物區(qū)系的影響

土壤微生物對(duì)維持土壤功能至關(guān)重要，豐富的土壤微生物多樣性有利于提高生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性、生產(chǎn)力以及可持續(xù)性［22-23］。有研究表明接種促生菌或添加有機(jī)肥都會(huì)調(diào)控細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性［24］。本文應(yīng)用BiologECO微平板技術(shù)進(jìn)行土壤微生物的代謝多樣性分析，與對(duì)照組相比，施加菌株Y2的聚谷氨酸發(fā)酵液，對(duì)土壤中常見菌種的多樣性及均度影響不大，菌株P(guān)1發(fā)酵液的施加具有提高玉米根際土壤微生物群落豐富度以及均度的趨勢(shì)，這可能助于玉米幼苗的生長(zhǎng)以及抗旱性。Ling等［25］發(fā)現(xiàn)一種新型的有機(jī)生物肥料可以提高土壤細(xì)菌群落的多樣，其他有機(jī)聚合物如腐殖酸物等亦可改變土壤微生物群落多樣性［26-28］。也有研究表明聚谷氨酸不但具有保水保肥性能，還可以為微生物提供碳源和氮源，提高土壤有益微生物活性［29］，此外，土壤微生物群體生物量和多樣性與植物生物量之間存在正相關(guān)性［30］。Xu等［31］利用聚谷氨酸作為肥料增效劑，調(diào)查了不同施加方式下，聚谷氨酸和尿素對(duì)土壤微生物多樣性和氮循環(huán)的影響，研究結(jié)果表明聚谷氨酸包裹尿素的施加方式，不但可以提高油菜的產(chǎn)量，還可增加土壤可培養(yǎng)微生物的數(shù)量，提高土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性。本研究中的兩株菌的聚谷氨酸發(fā)酵液直接施加到土壤，未顯著改變土壤中常見的微生物群落多樣性及均度，其對(duì)于土壤中總的微生物組成是否有作用以及哪些菌群發(fā)生改變?nèi)孕韬罄m(xù)微生物群落高通量測(cè)序?qū)嶒?yàn)進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

從納豆和豆豉中分離出兩株聚谷氨酸產(chǎn)生菌，經(jīng)鑒定均為枯草芽孢桿菌，且其發(fā)酵液均可提高土壤的持水性。在中度干旱脅迫條件下，菌株P(guān)1聚谷氨酸發(fā)酵液可顯著提高玉米幼苗抗旱性、幼苗株高、葉面積以及生物量。菌株聚谷氨酸發(fā)酵液具有良好的保水性，且不顯著影響土壤微生物群落的多樣性及均度，是安全的土壤生態(tài)保水劑。

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Screen of Poly-γ-gamma Glutamic Acid Producing Bacteria and Their Glutamic Acid Fermentation Broth’s Function on the Drought Resistance of Maize

JIA Yan-ping1YIN Ai-ming1，2SUN Yan-mei2CHENG Shou-tao2WANG Xu-ming2
（1. School of Chemical Engineering，Northeast Electric Power University，Jilin 132012 ；2. Beijing Agro-Biotechnology Research Center，Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Beijing 100097）

As a novel biological water absorbent，poly-γ-gamma glutamic acid（γ-PGA）has a significant application value on watersaving agricultural production. Two γ-PGA-producing strains，Y2 and P1，were isolated and screened from natto and fermented soya bean samples. By analyzing their morphological and physic-chemical characters，and 16S rRNA sequence，they were identified as Bacillus subtilis.Then，the effects of γ-PGA fermentation broth on the soil water-holding capacity and the drought resistance of maize seedling under water stress were also studied. The results showed that the fermentation broth of Y2 and P1 significantly decreased the soil water evaporation. Compared with the control treatment，adding fermentation broth from γ-PGA-producing strain promoted the soil water content by 4%. At the same time，the addition of γ-PGA fermentation broth enhanced the drought resistance of maize seedlings，and significantly increased aboveground and underground biomass of maize seedlings by 40.70% and 19.59%，respectively. The result of biologECO showed that the γ-PGA fermentation broth from Y2 and P1 had insignificant effect on microbial diversity and evenness. Thus，the γ-PGA fermentation broth is an environmental friendly biological water absorbent，which can be used directly to enhance soil water retention and drought resistance of vegetation in field.

poly-γ-glutamic acid；drought resistance；drought stress；soil microbes

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0699

2017-08-24

北京市農(nóng)林科學(xué)院科技創(chuàng)新能力建設(shè)專項(xiàng)（KJCX20161502-4）

賈艷萍，女，博士，研究方向：廢水生物處理；E-mail：jiayanping1111@sina.com

孫艷梅，女，博士，研究方向：環(huán)境微生物；E-mail：sunyanmei2001@126.com

（責(zé)任編輯 朱琳峰）