劉曄 劉曉丹 張林利 吳越 王國(guó)文 汪強(qiáng) 姜瑛

（1. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，鄭州 450002；2. 山東省土壤肥料總站，濟(jì)南 250100）

研究報(bào)告

花生根際多功能高效促生菌的篩選鑒定及其效應(yīng)研究

劉曄1劉曉丹1張林利1吳越2王國(guó)文1汪強(qiáng)1姜瑛1

（1. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，鄭州 450002；2. 山東省土壤肥料總站，濟(jì)南 250100）

為了獲得具有固氮、解磷解鉀及合成生長(zhǎng)素的多功能花生根際促生菌（PGPR），提高和改善河南花生種植區(qū)的花生產(chǎn)量和品質(zhì)。從華北地區(qū)花生根際砂質(zhì)潮土中篩選出5株多功能促生菌HS4、HS7、HS9、HS10、HS11，通過對(duì)其各功能指標(biāo)的對(duì)比挑選出菌株HS9，其固氮酶活性、解磷解鉀以及產(chǎn)IAA能力分別達(dá)到15.53 nmol C2H4/h·mL、279.23 mg/L、22.5 mg/L和40.96 mg/L。經(jīng)形態(tài)觀察、生理生化指標(biāo)以及16S rDNA保守序列鑒定，確定該菌株為彎曲芽胞桿菌（Bacillus flexus）。最后通過花生盆栽實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其促生能力。盆栽實(shí)驗(yàn)表明：接種HS9能顯著提高土壤中速效磷、鉀含量，極顯著地提高了土壤中IAA的含量；植株的根總長(zhǎng)、根表面積、根體積和根尖數(shù)分別增加了109.60%、84.30%、76.08%和386.24%，促進(jìn)植株對(duì)養(yǎng)分的吸收和利用，提高植株生物量以及養(yǎng)分含量；植株鮮重、株高、葉綠素值（Soil and plant analyzer development，SPAD）及氮、磷、鉀含量分別提高了70.05%、28.35%、16.06%、23.11%、83.04%和23.95%。該多功能菌株對(duì)花生具有良好的促生作用，具有廣闊的農(nóng)業(yè)應(yīng)用前景。

花生；固氮；解磷解鉀；indole-3-acetic acid；根際促生菌

花生作為世界主要的油料作物，是人類重要的油脂來源。河南是我國(guó)的糧油生產(chǎn)大省，其花生的種植和栽培具有悠久歷史，提高河南花生產(chǎn)區(qū)的產(chǎn)量及品質(zhì)對(duì)河南乃至全國(guó)都具有重要的意義。

作為河南省主要土壤類型之一，砂質(zhì)潮土具有養(yǎng)分含量低、保肥性差等特點(diǎn)。在該土壤上種植的作物后期容易出現(xiàn)脫肥早衰現(xiàn)象，但因其通氣性良好、通透性強(qiáng)，適合微生物生存。同時(shí)由于我國(guó)農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化的進(jìn)程不斷加快和深入，過量農(nóng)藥和化肥的施用不但增加了生產(chǎn)成本同時(shí)也極大程度上破壞了生態(tài)環(huán)境，到2020年我國(guó)化肥施用量要基本實(shí)現(xiàn)零增長(zhǎng)，因此“減肥增效”是當(dāng)前我國(guó)農(nóng)業(yè)面臨的重要挑戰(zhàn)［1］。應(yīng)用微生物制劑來替代部分化肥與農(nóng)藥也逐漸成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。

根際促生菌（Plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）是指生長(zhǎng)在植物根際土壤中的具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)、提高植物抗性功能的一類有益細(xì)菌［2-4］。大量研究表明，PGPR 在水稻［5］、小麥［6］、玉米［7］、棉花［8］、大豆［9］及煙草［10］中的應(yīng)用均取得了良好的效果。但是在花生上面的應(yīng)用較少且功能相對(duì)單一，如姜瑛等［11］從灰潮土中的花生根際中篩選出具有固氮解磷功能的花生促生菌；李引等［12］從紅壤中的花生根際中篩選出7株具有合成生長(zhǎng)素的花生促生菌；閆小梅等［13］從潮土中篩選出一株具有解磷作用花生促生菌。花生根際促生菌在華北地區(qū)砂質(zhì)潮土上的應(yīng)用則更少，本實(shí)驗(yàn)室在前期，由張東艷等［14］從華北地區(qū)砂質(zhì)潮土中篩選出一株具有產(chǎn)IAA功能的根際促生菌，本研究則后續(xù)從砂質(zhì)潮土花生根際土中篩選一株具有固氮、解磷解鉀以及合成生長(zhǎng)素等多種促生功能的根際促生菌，并通過花生盆栽試驗(yàn)來驗(yàn)證其促生效應(yīng)，旨為河南花生種植區(qū)產(chǎn)量和品質(zhì)的提升奠定技術(shù)基礎(chǔ)和提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土樣采集與保存 根際土壤采集：農(nóng)業(yè)部華北小麥玉米輪作營(yíng)養(yǎng)與施肥科學(xué)觀測(cè)試驗(yàn)站（河南，許昌）中選出一株長(zhǎng)勢(shì)較好的花生植株，取其根際10 cm范圍內(nèi)的土壤，用手輕輕抖落根系上的土壤，裝入無菌袋中，帶回實(shí)驗(yàn)室，備用。

盆栽土樣采自農(nóng)業(yè)部華北小麥玉米輪作營(yíng)養(yǎng)與施肥科學(xué)觀測(cè)試驗(yàn)站（河南許昌市）。取表層土壤（0-20 cm）土樣，剔除枯枝落葉及根系后，過2 mm篩保存?zhèn)溆?，土壤基本性狀如?所示。

表1 供試土壤基本理化性狀

1.1.2 培養(yǎng)基的配置［16］LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0-7.2。121℃滅菌30 min；PKO液體培養(yǎng)基（無機(jī)磷細(xì)菌培養(yǎng)基）：氯化鈉0.3 g，葡萄糖10 g，氯化鉀0.3 g，磷酸三鈣 5 g，硫酸銨0.5 g，七水合硫酸鎂0.3 g，硫酸錳 0.03 g，七水合硫酸亞鐵 0.03 g，蒸餾水 1 000 mL，調(diào)節(jié) pH 7.0-7.2，121℃滅菌 30 min；Ashby無氮培養(yǎng)基：甘露醇10.0 g，磷酸氫二鉀0.2g，七水硫酸鎂0.2 g，氯化鉀0.2 g，二水硫酸銨0.2 g，碳酸鈣5.0 g，pH 7.2；液態(tài)解鉀細(xì)菌培養(yǎng)基：蔗糖10.0 g，酵母膏0.5 g，硫酸銨1.0 g，磷酸氫二鉀2.0 g，七水硫酸鎂0.5 g，碳酸鈣1.0 g，鉀長(zhǎng)石粉1.0 g，蒸餾水1 L，121℃滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 供試土壤理化性質(zhì)與植株的測(cè)定方法 供試土壤理化性質(zhì)和盆栽植株各指標(biāo)的測(cè)定方法參考鮑士旦［15］的《土壤農(nóng)化分析》。

1.2.2 菌株的篩選 菌株的分離純化：從農(nóng)業(yè)部華北小麥玉米輪作營(yíng)養(yǎng)與施肥科學(xué)觀測(cè)試驗(yàn)站中選出一株長(zhǎng)勢(shì)較好的花生植株，取其根際10 cm范圍內(nèi)的土壤，用手輕輕抖落根系上的土壤，裝入無菌袋中，帶回實(shí)驗(yàn)室。在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，取10 g土壤樣品將其加入到裝有100 mL無菌水的250 mL錐形瓶中，震蕩20 min，靜置10 min形成濃度為0.1 g/mL的菌懸液。按照稀釋平板法將懸浮液稀釋至10-6，30℃培養(yǎng)24h，之后分離純化出不同的根際菌株，保存在4℃冰箱中備用［16］。

1.2.3 溶磷能力的測(cè)定 將篩選得到的菌株進(jìn)行溶磷能力的定量測(cè)定，將純化后的解磷菌接種于盛有50 mL的PKO液體培養(yǎng)基的三角瓶中，置于恒溫?fù)u床上振蕩，溫度為30℃、轉(zhuǎn)速為180 r/min、培養(yǎng)時(shí)間為3 d，培養(yǎng)結(jié)束后將10 mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至10 mL離心管中，溫度4℃、轉(zhuǎn)速10 000 r/min條件下離心15 min，離心后上收集上清液，用鉬藍(lán)比色法測(cè)定上清液中有效磷的含量。

1.2.4 解鉀能力的測(cè)定 在無菌操作臺(tái)中，將分離的菌株分別接種于盛有50 mL液態(tài)解鉀細(xì)菌培養(yǎng)基的150 mL三角瓶，放置于搖床中，設(shè)置搖床溫度為30℃，轉(zhuǎn)速180 r/min。培養(yǎng)3 d，用10 mL的離心管將培養(yǎng)液10 000 r/min離心，10 min后，取出離心管，轉(zhuǎn)移出上清液，用火焰分光光度計(jì)測(cè)定鉀的含量。

1.2.5 固氮能力測(cè)定 向無氮液體培養(yǎng)基中分別接入已純化的菌株，恒溫培養(yǎng)24 h后，離心收集菌細(xì)胞，并向菌細(xì)胞中加入45 mL無菌水和5 mL無氮液體培養(yǎng)基，形成50 mL的菌懸浮液（濃度約為107個(gè)/mL）作為待接種菌液，并采用乙炔還原法測(cè)定固氮酶活性。乙炔還原活性（ARA）采用美國(guó)HP公司生產(chǎn)的HP6890型氣相色譜儀測(cè)定其具體設(shè)置項(xiàng)目參數(shù)，如表2所示。

表2 氣相色譜儀項(xiàng)目及參數(shù)

乙炔還原活性（ARA），其計(jì)算公式為（單位：nmolC2H4/h·mL）：

1.2.6 IAA含量的測(cè)定［17-18］

1.2.6.1 IAA的定性測(cè)定 將分離純化后的細(xì)菌接種于含有 L-色氨酸（80 mg/L）的LB液體培養(yǎng)基，每一菌株3個(gè)重復(fù)，搖床培養(yǎng)（30℃，180 r/min）1 d后，取50 μL 菌懸液滴于白色陶瓷板上，同時(shí)加入等體積的Salkowski比色液（50 mL 35% HClO4+ 1 mL 0.5 mol/LFeCl3），并以加入 50 μL 未接菌的 LB 液體培養(yǎng)基與等體積比色液的混合溶液為對(duì)照。將白色陶瓷板于室溫避光放置 30 min 后觀察，顏色變粉紅者為陽性，表示能夠分泌IAA，顏色越深表示分泌的強(qiáng)度越大，不變色為陰性，表示不能分泌IAA。

1.2.6.2 IAA含量的定量分析 對(duì)初篩獲得的能分泌IAA的細(xì)菌進(jìn)行定量測(cè)定，培養(yǎng)條件同上。首先用分光光度法測(cè)定菌懸液的OD600值，然后將菌懸液以10 000 r/min 離心10 min取上清液加入等體積Salkowski 比色液，避光靜置 30 min，測(cè)定其 OD530值。對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算單位體積發(fā)酵液中 IAA 的含量。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制采用分析純的 IAA 梯度稀釋制備。1.2.6.3 IAA標(biāo)準(zhǔn)曲線配置 精確稱取32.8 mg的IAA于100 mL容量瓶中，用甲醇定容（該溶液含IAA 328 μg/mL）。再用甲醇依次稀釋1倍，連續(xù)進(jìn)行4次，配成5份濃度依次相差1倍的標(biāo)準(zhǔn)溶液，比色時(shí)也是等量的標(biāo)準(zhǔn)溶液加等量的比色液。

1.2.7 植物促生菌的生理生化及16S rDNA分子學(xué)鑒定

1.2.7.1 菌落的形態(tài)觀察 將篩選的菌株接種到LB平板上，30℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落的大小、形狀、顏色、光澤度、粘稠度、隆起形狀、透明度、邊緣特征及有無芽胞等。

1.2.7.2 菌株生理生化指標(biāo)的測(cè)定 生理生化鑒定試驗(yàn)的方法參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》［19，20］，對(duì)該菌株進(jìn)行革蘭氏染色、好氧性、過氧化氫酶、甲基紅、乙酞甲基甲醇、淀粉水解、硝酸鹽還原、檸檬酸鹽利用以及明膠液化試驗(yàn)。

1.2.7.3 菌株的分子生物學(xué)鑒定 采用 SDS-CTAB法提取總基因組 DNA［21］，采用16S rDNA通用引物 27f（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'） 和 1492 r（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'） 進(jìn) 行 16S rDNA 的 PCR 擴(kuò)增［22］。PCR 反應(yīng)條件 ：94℃預(yù)變性30 s；94℃變性 30 s，36℃退火 30 s，72℃延伸 60 s，35個(gè)循環(huán)。將PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1.5%的瓊脂糖凝膠電泳。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后回收純化測(cè)序（北京美億美生物技術(shù)有限公司），根據(jù)獲得的16S rDNA序列在GenBank中Blast 搜索同源序列，通過 MEGA 5.0 軟件，通過MEGA 5.0軟件，用鄰接法（Neighbour-Joining）建立系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.8 促生盆栽試驗(yàn)設(shè)計(jì) 花生盆栽試驗(yàn)于2015年6月在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)科教園區(qū)內(nèi)（鄭州）進(jìn)行，每盆裝土700 g，調(diào)節(jié)含水量至田間持水量的60%［23］。試驗(yàn)用花生品種為“豫花八號(hào)”，20%雙氧水消毒20 min后，無菌水沖洗多次，催芽2 d。選取生長(zhǎng)狀況一致的種子每盆種植兩顆，待長(zhǎng)勢(shì)穩(wěn)定后定植為每盆一棵。

接菌處理：將HS9接種于LB液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度30℃，180 r/min 搖床培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，然后將菌懸液10 000 r/min 離心10 min，再用無菌水重懸并反復(fù)離心3次，此時(shí)接種量為108CFU/g（等量菌株121℃，30 min高溫高壓滅菌即得滅活菌株）。將重懸后的菌株沿小麥根周圍均勻的澆入土壤中。對(duì)照處理：對(duì)照處理土壤不施菌液以等體積滅活菌懸液代替。每個(gè)處理設(shè)置設(shè)6個(gè)重復(fù)。試驗(yàn)過程中不再施入其他肥料。

自然條件下生長(zhǎng)30 d后進(jìn)行采樣（植株樣和土壤）并對(duì)花生根系指標(biāo)進(jìn)行分析（Winrhizo2003，Canada），并測(cè)定土壤礦質(zhì)氮、速效磷、速效鉀含量，以及植株鮮重、干重、株高、SPAD值及全氮、全磷、全鉀［17］，土壤 IAA 含量用 HPLC 法測(cè)定［24］。

1.2.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 本試驗(yàn)中所得采用SPSS 23.0進(jìn)行相關(guān)分析統(tǒng)計(jì)，用Duncan（新復(fù)極差）法以及LSD法進(jìn)行數(shù)據(jù)的方差分析（P＜0.05）；運(yùn)用Office 2016以及origin 2017進(jìn)行相關(guān)圖表的制作。

圖1 各菌株對(duì)固氮酶活性、解磷解鉀、IAA合成量的影響

2 結(jié)果

2.1 菌株的固氮酶活性、磷鉀溶解及IAA合成能力以及優(yōu)勢(shì)菌株的篩選

從花生根際土壤中篩選出5株花生根際促生菌HS4、HS7、HS9、HS10和HS11。在經(jīng)過液態(tài)搖瓶培養(yǎng)后，測(cè)定5株菌株的固氮酶活性、解磷解鉀以及合成IAA的能力。由圖1可知，菌株HS9的固氮酶活性、溶鉀能力均顯著高于其他菌株，分別為15.53 nmol C2H4/h·mL和22.5 mg/L。這表明在5種菌株中，HS9具有較強(qiáng)的固氮、溶鉀能力；解磷能力方面，菌株HS4、HS9和HS11三個(gè)菌株的解磷能力較好，但三者之間的差異不顯著，其中HS9的無機(jī)磷含量最高為279.23 mg/L。由圖1可看出，5株菌均為產(chǎn)IAA菌，其產(chǎn)IAA能力大小順序依次為HS10＞HS9＞HS7＞HS4＞HS11，其中 HS10 菌株的 IAA合成量最大，為50.03 mg/L，且與其他菌株呈顯著性差異。而HS9菌株的IAA合成量為40.96 mg/L，均與其他菌株呈顯著性差異。因此我們選取菌株HS9 為高效的固氮、解磷溶鉀、以及合成IA的多功能促生菌，并進(jìn)行盆栽試驗(yàn)驗(yàn)證其促生效果。

2.2 HS9菌株形態(tài)分析及生理生化指標(biāo)分析

2.2.1 HS9的形態(tài)分析 經(jīng)平板劃線、革蘭氏染色，觀察菌株培養(yǎng)特征及形態(tài)特征分析后發(fā)現(xiàn)根際促生菌HS9菌落形態(tài)呈同心圓狀，不透明，表面粗糙，不濕潤(rùn)，產(chǎn)芽胞，菌體形態(tài)呈彎曲桿狀（圖2）。

圖2 菌株HS9的形態(tài)觀察

2.2.2 HS9的生理生化指標(biāo)分析 對(duì)菌株HS9進(jìn)行革蘭氏染色、好氧性試驗(yàn)、接觸酶試驗(yàn)、甲基紅反應(yīng)（M.R）以及V-P試驗(yàn)后得到其生理生化指標(biāo)。由表3可知，菌株HS9為革蘭氏陽性的兼性厭氧性細(xì)菌。其淀粉水解、明膠液化、接觸酶試驗(yàn)、硝酸鹽還原、V-P試驗(yàn)項(xiàng)目均呈現(xiàn)陽性反應(yīng)，甲基紅（M.R）反應(yīng)、檸檬酸鹽利用則呈現(xiàn)陰性反應(yīng)。

表3 HS9的生理生化指標(biāo)

2.3 HS9的16S rDNA鑒定結(jié)果

將16S rDNA 的測(cè)序結(jié)果和GenBank 中已登錄的核苷酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)，發(fā)現(xiàn)菌株HS9與Bacillus flexus IFO15715（AB021185）同源性達(dá)到99%，運(yùn)用MEGA5.0 軟件N-J 方法構(gòu)建HS9 的16S rDNA 系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）。結(jié)合生理生化特征結(jié)果，菌株HS9鑒定為彎曲芽胞桿菌（Bacillus flexus），將其序列上傳至NCBI，獲得登錄號(hào)為KP743122。

2.4 菌株HS9對(duì)花生盆栽的促生試驗(yàn)

在對(duì)HS9菌株功能進(jìn)行搖瓶試驗(yàn)分析后，進(jìn)行花生盆栽試驗(yàn)對(duì)其促生作用進(jìn)行驗(yàn)證。

2.4.1 HS9對(duì)盆栽土壤養(yǎng)分的影響 菌株接種花生盆栽后對(duì)盆栽土壤中養(yǎng)分的影響由表4所示，與對(duì)照相比，土壤中礦質(zhì)態(tài)氮、速效磷、速效鉀以及IAA含量均得到提高。礦質(zhì)態(tài)氮含量增加了2.4%，接種HS9的盆栽土壤中的速效磷、鉀的養(yǎng)分含量分別顯著增高了17.72%、20.58%；土壤IAA含量增加了171.4%。HS9的固氮作用為作物提供氮素，在實(shí)際的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中能夠降低化肥的施用量，更加有利于花生品質(zhì)的改善。

2.4.2 HS9對(duì)花生根系的影響 接種菌株HS9后花生根系指標(biāo)如表5所示。與對(duì)照處理相比，接種HS9菌株能極顯著地提高花生根系的根長(zhǎng)、根表面積、根體積以及根尖數(shù)，并分別增加了109.60%、84.30%、76.08%和386.24%。這表明，HS9能使花生根系變得更長(zhǎng)，有更多的分支，進(jìn)一步增加根系與土壤的接觸面積，促進(jìn)了花生地上部對(duì)土壤養(yǎng)分的吸收。

2.4.3 HS9對(duì)花生植株的影響 接種菌株HS9對(duì)花生地上部的影響，如表6所示，與對(duì)照處理相比，菌株HS9極顯著地提高了花生的鮮重、株高，分別提高了70.05%、28.35%。由于花生地下部生長(zhǎng)得到促進(jìn)，導(dǎo)致植株地上部的生物量增加以及養(yǎng)分積累量提高，植株地上部的SPAD值、氮、磷、鉀含量分別增加了16.06%、23.11%、83.04%和23.95%。其中與CK處理相比HS9處理的植株全氮含量達(dá)到顯著性差異，而SPAD值、全磷、全鉀差異則達(dá)到極顯著水平。SPAD值表示植株的葉綠素含量，其值越高則表明植株光合作用能力越強(qiáng)，促進(jìn)植株地上部養(yǎng)分的積累，從而提高植株株高以及鮮重等農(nóng)藝性狀。

圖3 基于HS9和相關(guān)菌株的16S rDNA序列采用鄰接法建立的系統(tǒng)發(fā)育樹

表4 接種菌株HS9對(duì)土壤速效養(yǎng)分及IAA含量的影響

表5 接種菌株HS9對(duì)花生根系的影響

表6 接種菌株HS9對(duì)花生植株的影響

3 討論

本研究從華北地區(qū)石灰性潮土中的一株花生根際土中篩選出一株多功能根際促生菌HS9，對(duì)其進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)HS9具有溶磷、解鉀、固氮、以及產(chǎn)IAA等多種功能。根際促生菌（PGPR）的概念最早是由Kloepper等［25］提出的，是能夠促進(jìn)宿主植物生長(zhǎng)的不可或缺的根際微生物。由于其強(qiáng)大的環(huán)境適應(yīng)能力、快速的生長(zhǎng)速率以及生物多樣性并且通過自身代謝產(chǎn)物能過在土壤生態(tài)系統(tǒng)中穩(wěn)定定殖［26］。根際促生菌的促生作用是通過多種方式以及多種途徑來促進(jìn)宿主植物生長(zhǎng)以及改善土壤養(yǎng)分質(zhì)量。Weller和Vessey等［27，28］對(duì)根際促生菌進(jìn)一步研究后指出，根際促生菌判定應(yīng)當(dāng)滿足3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，即能夠主動(dòng)定殖或者侵染宿主植物、促進(jìn)植物生長(zhǎng)及生防功能。植物促生菌促進(jìn)生長(zhǎng)的機(jī)制分為直接與間接機(jī)制，直接影響機(jī)制通過釋放出一些有利于植物生長(zhǎng)的積極因子例如溶解養(yǎng)分，提高生物有效性、固氮以及分泌植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)；亦或是通過病原體的競(jìng)爭(zhēng)排斥作用以及清楚植物毒性產(chǎn)物來間接促進(jìn)植物生長(zhǎng)［26］。

圖4 接種菌株HS9對(duì)花生植株的影響

研究表明，PGPR能夠通過直接和間接途徑來促進(jìn)植物生長(zhǎng)以及提高糧食作物的產(chǎn)量。一些植物促生菌主要是通過固氮、溶磷解鉀以及分泌植物激素，如IAA、細(xì)胞分裂素和一些易揮發(fā)的植物生長(zhǎng)調(diào)解物質(zhì)例如乙烯和2，3-丁二醇等物質(zhì)［27-29］。本研究所篩選出的HS9具有固氮，解磷溶鉀以及產(chǎn)IAA等功能。據(jù)研究報(bào)道，有些根際促生菌能夠通過分泌螯合鐵載體、抗生素、氰化氫等物質(zhì)來最大程度的避免植株受到植物病原體以及根際有害細(xì)菌的干擾［30-34］，從而來促進(jìn)植物生長(zhǎng)，但不論P(yáng)GPR是通過哪種途徑或機(jī)制來促進(jìn)生長(zhǎng)，必須能夠定殖在根圈附近或者直接能夠在根部穩(wěn)定存在［35］。

華北黃泛地區(qū)土壤類型多為堿性的石灰性土壤，土壤養(yǎng)分貧瘠，特別是在砂質(zhì)潮土中，由于土壤質(zhì)地等因素，土壤黏?？障洞髮?dǎo)致其養(yǎng)分保持及礦化能力較低。芽胞桿菌作為土壤中的一個(gè)優(yōu)勢(shì)菌種，能夠在環(huán)境條件比較惡劣的情況下穩(wěn)定生長(zhǎng)和定殖，通過產(chǎn)芽胞、耐高鹽等方式穩(wěn)定存活［36］。目前，對(duì)于芽胞桿菌的促生效果的研究較為常見，但大都集中在挖掘和探索其單一的促生作用方面上，對(duì)于根際促生菌的多功能促生作用的研究報(bào)告相對(duì)較少［37，38］。張東艷等［14］在砂質(zhì)潮土中篩選出一株產(chǎn)IAA功能的根際促生菌HS10（特基拉芽胞桿菌），對(duì)花生具有較好的促生作用，其產(chǎn)IAA能力達(dá)到了52.03 mg/mL，而本研究中的HS9也具有較強(qiáng)的產(chǎn)IAA能力為40.96 mg/L，略小于HS10。尹瑞齡［39］分離出具有解磷功能的巨大芽抱桿菌、節(jié)桿菌、黃桿菌、歐文氏菌及假單胞菌，它們的溶磷能力為25-30 mg/g。

SPAD值表示植株的葉綠素含量，其值越高則表明植株光合作用能力越強(qiáng)，促進(jìn)植株地上部養(yǎng)分的積累，從而提高植株株高以及鮮重等農(nóng)藝性狀。Baset等［40］通過香蕉苗的水培試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與不接種促生菌處理相比，根際促生菌通過增大葉面積和葉綠素含量來增加香蕉的生物量。Dobbelaere［41］通過對(duì)一些主要農(nóng)作物接種固氮螺菌后發(fā)現(xiàn)，接菌處理作物的地下部和地上部干重均顯著高于未接菌處理，作物能夠更好地生長(zhǎng)。

根系是植物吸收養(yǎng)分促進(jìn)其生長(zhǎng)的最主要來源，根系系統(tǒng)的發(fā)達(dá)與否直接影響到植物的生長(zhǎng)狀況。Saravanakumar等［42］通過對(duì)黃瓜促生菌研究后發(fā)現(xiàn)，接種熒光假單胞菌92 rk 和 P190r后，黃瓜的鮮重增加量為6.37%-49.66%和根長(zhǎng)增加了5.92%-21.71%。Baset 等［40］通過對(duì)香蕉施用根際促生菌后發(fā)現(xiàn)其根長(zhǎng)增加了33%-44%，根體積增加了76%-168%。而本試驗(yàn)中篩選出的HS9能夠使根長(zhǎng)和根體積分別增加109.60%和76.08%。根際促生菌促進(jìn)植物根系發(fā)育是由于在根際促生菌的作用下促進(jìn)了小麥和玉米幼苗根尖細(xì)胞的分裂引起了跟皮層外部的變化進(jìn)而促進(jìn)作物根系更加發(fā)達(dá)，提高植物對(duì)養(yǎng)分的吸收能力。在本實(shí)驗(yàn)中，接種菌株HS9的花生根系變得更加發(fā)達(dá)，分支數(shù)更多、更長(zhǎng)。其中根尖數(shù)的增加量最大，這可能是由于根尖細(xì)胞在整個(gè)根部中最為活躍，分裂速度最快。因此能夠讓根系更為發(fā)達(dá)，能夠更加充分的與土壤中的養(yǎng)分進(jìn)行交互，從而提高其養(yǎng)分的利用增加花生養(yǎng)分積累量，促進(jìn)了花生的生長(zhǎng)。

根際促生菌能夠改變植物生理以及一些根際土壤的理化性質(zhì)及養(yǎng)分狀況。因此能夠維持和改善土壤肥力以及促進(jìn)養(yǎng)分吸收，主要是由于根際促生菌在固氮、產(chǎn)IAA、解磷溶鉀表現(xiàn)出很強(qiáng)的能力［43-47］，同時(shí)除了這些主要功能之外，有研究表明，多數(shù)根際促生菌在其生長(zhǎng)過程中會(huì)分泌多種有機(jī)酸，例如羥基乙酸、乳酸、檸檬酸、草酸、琥珀酸和延胡索酸，這些有機(jī)酸的分泌能夠降低培養(yǎng)介質(zhì)的pH同時(shí)螯合某些微量金屬元素增加其生物有效性［48］。本試驗(yàn)中HS9的接種有效地提高了土壤中NPK養(yǎng)分的提高從而促進(jìn)花生的生長(zhǎng)，而土壤微環(huán)境的改變還需要進(jìn)一步的深入研究。

綜合以上討論和分析再結(jié)合本試驗(yàn)的研究結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)植物促生菌促進(jìn)植物生長(zhǎng)不僅僅是促進(jìn)了植物某一方面的生長(zhǎng)，而是整個(gè)地上部、地下部一個(gè)系統(tǒng)的影響。由于促生菌能夠在土壤中穩(wěn)定的定殖存在，提高了土壤中的養(yǎng)分活性以及某些具有生長(zhǎng)調(diào)解功能的小分子物質(zhì)的數(shù)量；植物在受到促生菌的影響之后，葉綠素含量提升，根系更加發(fā)達(dá)，從而提高養(yǎng)分的吸收效率以及利用率用，而土壤養(yǎng)分的提高又反過來影響了植物的根系分布，在土壤與植株互相影響相互促進(jìn)之下促進(jìn)了植株養(yǎng)分的積累以及生物量的提高。在我國(guó)實(shí)現(xiàn)肥料和農(nóng)藥施用量都不再增加，“減肥增效”的大背景下，以根際促生菌為基礎(chǔ)的新型微生物肥料的研發(fā)具有巨大的發(fā)展?jié)摿褪袌?chǎng)前景。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)從華北地區(qū)花生根際砂質(zhì)潮土中篩選出5株具有固氮、解磷解鉀以及產(chǎn)IAA能力的根際促生菌HS4、HS7、HS9、HS10和HS11。通過功能指標(biāo)對(duì)比篩選出一株優(yōu)勢(shì)菌種HS9，其固氮、解磷解鉀以及產(chǎn)IAA能力分別為15.53 nmol C2H4/h·mL、279.23 mg/L、22.5 mg/L和40.96 mg/L。通過其菌落形態(tài)特征、生理生化指標(biāo)以及16S rDNA基因序列分析，鑒定HS9為彎曲芽胞桿菌（Bacillus flexus）。搖瓶試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株HS9具有固氮、解磷解鉀及合成IAA的能力，這表明該菌株能夠提高土壤中的速效氮、磷、鉀含量，從而促進(jìn)花生的生長(zhǎng)發(fā)育。盆栽試驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了菌株HS9能夠提高盆栽土壤中的礦質(zhì)態(tài)氮、速效磷、鉀以及IAA含量并且能夠促進(jìn)花生根系生長(zhǎng)，提高作物對(duì)養(yǎng)分的吸收利用，促進(jìn)作物生長(zhǎng)發(fā)育，提高花生地上部生物量以及養(yǎng)分含量。

［1］中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部. 農(nóng)業(yè)部關(guān)于印發(fā)《到2020年化肥使用量零增長(zhǎng)行動(dòng)方案》的通知［EB/OL］. http://www. moa. gov.cn/zwllm/tzgg/tz/201503/t20150318_4444765. htm.

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Screening，Identification of Multifunctional Peanut Root-promoting Rhizobacteria and Its Promoting Effects on Peanuts（Arachis hypogaea L.）

LIU Ye1LIU Xiao-dan1ZHANG Lin-li1WU Yue2WANG Guo-wen1WANG iang1JIANG Ying1
（1. College of Resources and Environment，Henan Agricultural University，Zhengzhou 450002 ；2. Soil and Fertilizer Station of Shandong Province，Jinan 250100）

This study aims to acquire the peanut root-promoting rhizobacteria（PGPR）with multifunction of fixing nitrogen，dissolving phosphorus and potassium，and synthesizing the auxin，for increasing and improving the yield and quality of peanuts in Henan. Five PGPR strains of HS4，HS7，HS9，HS10，and HS11 were screened from sandy alluvial soil of peanut rhizosphere in North China. Further HS9 was chosen by comparing various functional indexes. The activity of nitrogenase，dissolving phosphorus and potassium and IAA synthesis of HS9 were 15.53 nmol C2H4/h·mL，279.23 mg/L，and 22.5 mg/L and 40.96 mg/L， respectively. HS9 was identified as Bacillus flexus based on the morphological observation，16S rDNA gene sequence analysis accompanied with physiological and biochemical test. Pot experiment was then conducted to test and verify the effects of growth promoting，and the results showed that inoculation with HS9 significantly increased the content of available phosphorus and potassium in soil，and distinctly enhanced the content of IAA in soil. This led to the root length，surface area，root volumes and root tips of peanut increased 109.60%，84.30%，76.08% and 386.24%，respectively. It indicated that the strain promoted plant nutrient uptake and utilization，and increased plant biomass and nutrient content. The average wet weight of plants was 1.7 times higher than the control treatment and the height of peanut inoculated with HS9 significantly increased by 28.35%；the SPAD（Soil and plant analyzer Development）value significantly increased by 16.06% and the total N，P and K content of peanut significantly increased by 23.11%、83.04%and 23.95%，respectively. Conclusively，the multifunctional strain HS9 has solid growth-promoting effect on peanut and broad agricultural application prospect.

peanuts；nitrogen fixing；dissolving phosphorus and potassium；indole-3-acetic acid；root-promoting rhizobacteria

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0233

2017-03-24

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（41401274），河南省科技攻關(guān)計(jì)劃（國(guó)際科技合作）項(xiàng)目（162102410031），河南省教育廳項(xiàng)目（15A210012，14B210025）

劉曄，男，碩士研究生，研究方向：植物營(yíng)養(yǎng)學(xué)；E-mail：luernerliu@163.com

姜瑛，女，博士，研究方向：土壤生態(tài)學(xué)；E-mail：JY27486@163.com

（責(zé)任編輯 狄艷紅）