江文靜 張軍毅 杜陽 孫麗偉

（1. 東南大學(xué)能源與環(huán)境學(xué)院 東南大學(xué)太湖水環(huán)境工程研究中心，無錫 214000；2. 無錫市環(huán)境監(jiān)測中心站，無錫 214000）

以核糖體蛋白質(zhì)鑒別銅綠微囊藻的應(yīng)用分析

江文靜1，2張軍毅2杜陽1，2孫麗偉1，2

（1. 東南大學(xué)能源與環(huán)境學(xué)院 東南大學(xué)太湖水環(huán)境工程研究中心，無錫 214000；2. 無錫市環(huán)境監(jiān)測中心站，無錫 214000）

旨為研究以核糖體蛋白質(zhì)為生物標(biāo)識物的基質(zhì)輔助激光解吸/電離平衡飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF MS）法鑒別混合及實際藍(lán)藻樣品的可行性。通過機(jī)械破碎和高速離心的前處理步驟獲取待測藍(lán)藻樣品的核糖體蛋白質(zhì)組分，使蛋白質(zhì)原位結(jié)晶后進(jìn)行MALDI-TOF MS測定，并選擇特定的13個核糖體蛋白質(zhì)為生物標(biāo)識物進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析。結(jié)果表明在篩選的最優(yōu)實驗條件下，模式藻株銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）能在混合樣品中被精確鑒別出，標(biāo)識物特征峰的檢出率均大于75%，通過對不同藻細(xì)胞密度的樣品測定，混合藍(lán)藻樣品中M. aeruginosa的最低生物量檢出限為2.88×106cell，所占比例為37%，核糖體蛋白質(zhì)特征峰值的誤差在合理范圍內(nèi)；M. aeruginosa在太湖實際藍(lán)藻樣品中也被成功鑒別出，特征峰的檢出率為76.9%。綜合分析表明，基于核糖體蛋白質(zhì)為生物標(biāo)識物的MALDI-TOF MS法能成功應(yīng)用于混合和實際藍(lán)藻樣品的鑒別且可能成為未來實際水體中藍(lán)藻日常監(jiān)測的手段。

核糖體蛋白質(zhì)；銅綠微囊藻；MALDI-TOF MS；藍(lán)藻水華

基于質(zhì)譜分析的蛋白質(zhì)組學(xué)/生物信息學(xué)方法——基質(zhì)輔助激光解吸/電離平衡飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF MS）可用來在屬、種水平上鑒別微生物［8-10］。蛋白質(zhì)因其大量豐富且在檢測中較好的敏感性和特異性，常被用作生物標(biāo)識物，尤其是核糖體蛋白質(zhì)具有管家功能，穩(wěn)定地高度表達(dá)于不同細(xì)胞和組織中［11-14］，因此與MALDI-TOF MS結(jié)合可用于高通量常規(guī)分析和臨床微生物學(xué)［15-17］。

筆者前期研究將此手段引入藍(lán)藻鑒別領(lǐng)域，建立了以13個核糖體蛋白質(zhì)（RP）為生物標(biāo)識物的MALDI-TOF MS直接鑒別純種藍(lán)藻細(xì)胞的新方法。藍(lán)藻中約52個核糖體蛋白質(zhì)的氨基酸序列情報可以反映出不同藻株之間的差異，與目前主流的以16S rRNA基因序列作為生物標(biāo)識物鑒定方法相比，無需遺傳物質(zhì)的提取擴(kuò)增，快速、簡便、樣品用量少，可實現(xiàn)在株的水平上對藍(lán)藻進(jìn)行鑒定鑒別［18］。本研究在已建立的新方法基礎(chǔ)上，以4種優(yōu)勢水華藍(lán)藻按不同比例配置模擬湖泊中混合藍(lán)藻樣品，探討所建立的方法對于從混合藍(lán)藻樣品中鑒別出M. aeruginosa的可行性，并分析M. aeruginosa在MALDI-TOF MS法下被檢測出的敏感性，并將該方法應(yīng)用于實際太湖水體中藍(lán)藻的鑒別，旨在為今后藍(lán)藻的日常程序化監(jiān)測以及對淡水湖泊中的藍(lán)藻爆發(fā)提前預(yù)警提供參考與依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 本研究人工混合樣品所用的四株水華優(yōu)勢藍(lán)藻均來自日本國立環(huán)境研究所的藻種保存機(jī)構(gòu)（MCC-NIES，Tsukuba，Japan），為銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa Lemmermann，NIES-843）即模式株、細(xì)小平裂藻（Merismopedia tenuissima Lemmermann，NIES-230）、 爬 行 顫 藻（Oscillatoria animalis Agardh ex Gomont，NIES-206）和近親魚腥藻（Anabaena affinis Lemmermann，NIES-1639）；實際藍(lán)藻樣品為2016年水華易爆發(fā)期5月30日內(nèi)太湖竺山湖和梅園水廠外采集的水樣。

1.1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件 NIES-843的培養(yǎng)采用MA培養(yǎng)基，NIES-230為C培養(yǎng)基，NIES-206被培養(yǎng)于MDM瓊脂培養(yǎng)基，NIES-1639為CB培養(yǎng)基，各培養(yǎng)基的配方均由MCC-NIES提供［19］。以光∶暗比12h∶12 h 為循環(huán)周期，光照密度 15-25 μmol·m-2·s-1以及溫度20℃為條件培養(yǎng)3-4周后用作實驗。

1.1.3 主要儀器和試劑 高速冷凍離心機(jī)（德國SIGMA 3-18K型和美國Beckman Allegra 64R型），均質(zhì)研磨器（美國Biospec Mini Beadbeater-16型），飛行時間質(zhì)譜儀（日本島津Axima CFR Plus型）。TMA-1 buffer：Tris-HCl 10 mmol/L（pH 7.8）、NH4Cl 30mmol/L、MgCl210 mmol/L、2-巰基乙醇 6 mmol/L；混合液A：乙腈（ACN）500 μL、三氟乙酸（TFA）10 μL、去離子水500 μL；芥子酸基質(zhì)溶液：芥子酸（SA）10 mg、500 μL 混合液 A。

1.2 方法

1.2.1 藻株混合樣品的準(zhǔn)備 4株實驗用藍(lán)藻的原始細(xì)胞密度見表1所示，單位為cells/mL。從細(xì)胞形態(tài)學(xué)來說，4株藍(lán)藻具有非常明顯的區(qū)別，NIES-206 和 NIES-1639是長鏈狀的，因而其生物量在生物學(xué)上經(jīng)常用volume/mL表達(dá)，為了使這4株藍(lán)藻的生物量具有可比性，通過測量單個細(xì)胞體積來使生物量轉(zhuǎn)換成volume/mL的表達(dá)方式，因此本研究的4個混合樣品的成分配比，見表2。

表1 四種藍(lán)藻的細(xì)胞密度

1.2.2 核糖體蛋白質(zhì)組分的制備 所測樣品只需離心和機(jī)械破碎的前處理即可獲得70S核糖體亞基：樣品做好標(biāo)記進(jìn)行超聲波輕微除泡，移入15 mL離心管中入離心機(jī)離心10 min，操作條件：9 100×g，4℃；去除上清液，取出底部沉淀物轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管內(nèi)（離心管提前稱量）離心10 min，操作條件：20 400×g，4℃；上一步操作后各樣品加入160 μL的TMA-1緩沖液混勻，移入提前備好的含160 mg氧化鋯-二氧化硅微粒的細(xì)胞破碎專用離心管，置入均質(zhì)研磨器進(jìn)行機(jī)械破碎，操作條件：3 000 r/min，破碎兩次，每次45 s，間隔30 s；將機(jī)械破碎后的樣品移入1.5 mL離心管離心25 min，操作條件：5 800×g，4℃；上述樣品取上清液移入1.5 mL離心管高速離心4 h后去上清液，操作條件：64 000×g，4℃，獲得核糖體亞單位沉淀物。

表2 混合樣品配比

1.2.3 蛋白質(zhì)原位結(jié)晶 上述制備完成后，即進(jìn)行點靶操作。在獲得核糖體亞單位沉淀物中加入10 μL混合液A，充分混勻，先吸取2 μL該樣品滴入專用樣品板上，再滴入1.5 μL基質(zhì)SA溶液覆蓋，在空氣中自然風(fēng)干，使蛋白質(zhì)原位結(jié)晶。

1.2.4 MALDI-TOF MS測定 質(zhì)荷比（m/z）設(shè)定在2-40 kD的范圍內(nèi)，通過一個配備N2的激光脈沖儀（λ= 337 nm，脈沖寬度為3 ns，頻率為10 Hz）的Axima CFR加飛行時間質(zhì)譜測定儀在正線性模式下得到質(zhì)譜圖。

1.2.5 生物信息學(xué)分析 利用國際數(shù)據(jù)庫檢索M.aeruginosa NIES-843的RP氨基酸全序列（http://www.ncbi.NLM.NIH.gov/），并通過蛋白分析專家系統(tǒng)中（http:// www.expasy.org /）的序列等電點和分子質(zhì)量分析軟件，考慮“ N端規(guī)則”［20］，計算出NIES-843的核糖體亞基蛋白的理論值。依據(jù)筆者之前的實驗，選取其中13個RP作為生物標(biāo)識物，將MALDI-TOF MS測定得出的質(zhì)譜圖與13個RP的理論值對比分析后鑒別藍(lán)藻的種類。

2 結(jié)果

2.1 人工混合藍(lán)藻樣品中RP的峰值的檢測

四種人工混合藍(lán)藻樣品經(jīng)MALDI-TOF MS測定后質(zhì)譜圖見圖1。混合樣品1和2中都能完全檢測出這13個特征RP標(biāo)識峰，樣品3則包含10個特征RP標(biāo)識峰，檢出率為76.9%。而樣品4僅能檢測到6個特征RP標(biāo)識峰，檢出率為38.5%（表3）。能從13個RP標(biāo)識物中測得大于等于10個RP即檢出率大于75%定義為能夠鑒別該樣品，上述結(jié)果表明建立的新方法可以在前3個混合藍(lán)藻樣品中鑒別出NIES-843，而不能從樣品4中鑒別出NIES-843，對應(yīng)的混合樣品中能檢測出的NIES-843所占的最低比例為37%。

表3 混合藍(lán)藻樣品中特征RP峰值一覽表

2.2 人工混合藍(lán)藻樣品RP峰值誤差及強(qiáng)度研究

隨著混合樣品中NIES-843配比的降低即從樣品1逐步到樣品4（表2），RP標(biāo)識物的觀察值與理論值之間的誤差隨之相對增加而RP特征峰的相對強(qiáng)度則相應(yīng)降低（表4），如樣品4只能檢測出6個RP特征峰且強(qiáng)度都很弱。同時，從RPL32逐步到RPS14，同種樣品的峰值強(qiáng)度也從S19之后有所降低，即當(dāng)分子量大于10 kD（表3）時，強(qiáng)度變?nèi)?，同時質(zhì)譜圖的信噪比也在隨著RP特征峰強(qiáng)度的降低而反向增大（圖1）。上述結(jié)果表明隨著所測目標(biāo)藍(lán)藻濃度的減少，測得的質(zhì)譜圖誤差增大，穩(wěn)定性降低，即鑒定效果減弱。

圖1 四種混合藍(lán)藻樣品的質(zhì)譜圖

表4 混合藍(lán)藻樣品中特征RP誤差及強(qiáng)度一覽表

2.3 人工混合藍(lán)藻樣品的檢出限分析

M. aeruginosa NIES-843可以在前3個混合藍(lán)藻樣品中被精確地鑒別出來，而不能在樣品4中被成功識別，即樣品3中NIES-843所含的生物量為新方法對其檢測鑒別的最低檢出限。最初所用的原始NIES-843的細(xì)胞密度為1.44×106cells/mL，樣品3中共使用NIES-843的體積為2 mL，因此對于在人工混合藍(lán)藻樣品中使用RP為生物標(biāo)識物的MALDITOF MS法對M. aeruginosa NIES-843的最低檢出限為2.88×106cells，相對應(yīng)的混合樣品中NIES-843所占的比例為37%。

2.4 MALIDI-TOF MS法應(yīng)用于實際太湖藍(lán)藻

實際太湖4個采樣點的藍(lán)藻樣品a、b、c和d經(jīng)MALDI-TOF MS測定后質(zhì)譜圖見圖2。四個實際樣品中都能檢測出這13個特征RP標(biāo)識峰中的10個，檢出率為76.9%。各個樣品能檢測出的特征峰并不完全相同，如只有樣品d能夠檢測出RPS14（表5）。依據(jù)實驗室藍(lán)藻樣品能從13個RP標(biāo)識物中測得大于等于10個RP即檢出率大于75%定義為能夠鑒別該樣品，上述結(jié)果表明建立的新方法可以在這兩個實際太湖藍(lán)藻樣品中鑒別出NIES-843，即新方法可以成功應(yīng)用于實際湖泊中藍(lán)藻的鑒別。同時太湖樣品RP峰值的絕對誤差與人工混合樣品相比較，實際太湖樣品a和b的誤差值相對更大一點，而實際太湖樣品c和d的誤差值比人工混合樣品2和樣品3更低，甚至與人工混合樣品1相當(dāng)。

圖2 實際太湖藍(lán)藻樣品的質(zhì)譜圖

3 討論

因日本諾貝爾得主田中耕一［21］的研究成果，新型分析化學(xué)方法被引入微生物鑒定領(lǐng)域：利用MALDI-TOF MS為手段，對微生物細(xì)胞直接測定，根據(jù)測定得到的特征波譜，以構(gòu)成微生物細(xì)胞成分的多酯類或蛋白質(zhì)作為生物標(biāo)識物，對微生物進(jìn)行鑒定［22］。但該法在測定微生物得到的波譜中，包括了多種成分的峰值，容易受到微生物的培養(yǎng)條件、測試條件及測試儀器等因素的影響，影響判斷的準(zhǔn)確性，因此，需要確立不易受上述各因素影響的生物標(biāo)識物。Ochi和Ochiai［23-24］首先提出各物種都有其獨特的RP氨基酸序列及其所決定的分子量大小，與在基因水平上決定著不同物種的16S rRNA基因指標(biāo)一樣，能反映出分子進(jìn)化過程和親緣關(guān)系，是物種分類的有力指標(biāo)，可將RP作為鑒定微生物的標(biāo)識蛋白質(zhì)；Pineda等［25］也證實了RP作為生物標(biāo)識物能成功用于細(xì)菌的鑒定。迄今為止，MALDI-TOF MS已廣泛應(yīng)用于臨床及食品行業(yè)的各種微生物的快速、準(zhǔn)確識別。

在前期研究中，筆者建立了利用MALDI-TOF MS法鑒別純種藍(lán)藻的新方法，因M. aeruginosa NIES-843的全基因及RP的氨基酸序列被測出［26］，且其作為太湖中占主導(dǎo)地位的有毒藍(lán)藻［27］被確立為模式株，也因此確立了13個特征RP為生物標(biāo)識物。在此基礎(chǔ)上為了分析新方法應(yīng)用于實際湖泊中藍(lán)藻日常監(jiān)測鑒別的可行性，本研究首先將實驗室中不同藍(lán)藻菌株混合，為了模擬實際樣品，藻株選擇為實際湖泊中水華爆發(fā)時的優(yōu)勢種類；為了分析該方法的敏感性與實際采樣體積的合理性，本研究中混合樣品按模式株濃度遞減設(shè)計，得出MALDITOF MS對M. aeruginosa的最低檢出生物量，并依據(jù)其原始濃度計算出所需樣品體積。滇池將1×106cells/mL作為藍(lán)藻水華的5級標(biāo)準(zhǔn)，同時也作為滇池藍(lán)藻水華爆發(fā)的判斷依據(jù)［28］。我國的太湖，目前主要以葉綠素a的濃度來判斷藍(lán)藻水華的發(fā)生以及發(fā)生的等級，通過葉綠色a的濃度與銅綠微囊藻細(xì)胞密度的轉(zhuǎn)換，當(dāng)密度為4.58×104cells/mL 到2.75×105cells/mL之間常被認(rèn)為發(fā)生藍(lán)藻水華［29］。依據(jù)本研究中混合樣品檢測鑒別的結(jié)果與最低檢測限，只需3 mL樣品即可判別滇池藍(lán)藻爆發(fā)，而15-50 mL水樣即可判別太湖藍(lán)藻的發(fā)生，這在環(huán)境監(jiān)測中是非常合理的采樣體積。當(dāng)然，發(fā)生水華的水體中藻類不僅僅包含M. aeruginosa，所以在實際監(jiān)測中水樣的體積要高于計算出的檢出體積，且通過離心或過濾的手段，水樣的體積能夠符合新建方法的預(yù)處理步驟。因此，本研究所確立的新方法不僅可以定性地鑒別混合藍(lán)藻樣品，而且它的檢測靈敏度也能達(dá)到預(yù)測與預(yù)警的要求。在實驗室試驗成功且合理的情況下，本研究將所建立的新方法用于太湖實際藍(lán)藻樣品的鑒別，結(jié)果表明，該方法能成功應(yīng)用于太湖水樣中藍(lán)藻的鑒別。

當(dāng)然該方法還存在一些不足，目前還不能實現(xiàn)完全定量檢測，且與實驗室混合樣品相比，實際藍(lán)藻樣品a和b中的誤差值更大，原因可能是實際湖泊的水體成分復(fù)雜，存在各種干擾物質(zhì)（如細(xì)菌、泥渣、各類雜質(zhì)等）等，這還有待進(jìn)一步研究。針對這一現(xiàn)象，首先可以在采樣時采用浮游植物網(wǎng)進(jìn)行采樣，如樣品c和樣品d即采用該采樣方法，過濾掉部分干擾物質(zhì)且提高了藍(lán)藻在水樣中的濃度；其次在質(zhì)譜測定時可以相應(yīng)增加激光強(qiáng)度和激光擊打次數(shù)來提高測量精確度和穩(wěn)定性，因此太湖樣品c和d的誤差值則與實驗室混合樣品相當(dāng)。同時混合樣品中所選用的其他菌株的基因還未完全測序，因而將來隨著蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的不斷完善及發(fā)展，越來越多的藍(lán)藻藻株將通過我們建立的MALDI-TOF MS法被檢測鑒別出，這也將有助于弄清水華爆發(fā)時藍(lán)藻的物種組成與形成機(jī)理，為藍(lán)藻的預(yù)警預(yù)測提供有力依據(jù)。

表5 實際太湖藍(lán)藻樣品中特征RP 峰值及誤差一覽表

4 結(jié)論

本研究利用RP為生物標(biāo)識物結(jié)合MALDI-TOF MS成功從實驗室混合藍(lán)藻樣品中鑒別出目標(biāo)M.aeruginosa，并得出對其最低生物量檢測限及所占的比例，同時將建立的新方法成功應(yīng)用于實際太湖藍(lán)藻的鑒別，并驗證了RP作為生物標(biāo)識物鑒別藍(lán)藻的可行性。

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Application Analysis of Microcystis aeruginosa Identification Based on Ribosomal Proteins

JIANG Wen-jing1，2ZHANG Jun-yi2DU Yang1，2SUN Li-wei1，2
（1. School of Energy and Environment，Southeast University，Taihu Lake Water Environment Engineering Research Center，Southeast University，Wuxi 214000 ；2. Wuxi Environmental Monitoring Centre，Wuxi 214000）

This research is to verify the feasibility of matrix-assisted laser desorption-ionization-time-of -flight mass spectrometry（MALDI-TOF MS）in the identification of mixed and actual cyanobacterial samples by employing ribosomal proteins as biomarkers. Mechanical disruption and high speed centrifugation were used as pre-treatments to collect the ribosomal protein fraction of cyanobacterial samples，and then MALDI-TOF MS was applied to identify Microcystis aeruginosa in samples after proteins in situ crystallization with proteomic analysis based on 13 ribosomal proteins as biomarkers. The results showed that under the optimal conditions，model strain M. aeruginosa was precisely identified in the mixed samples and the detection rates of assigned peaks were all greater than 75% with reasonable errors range except the fourth sample. The lowest biomass detection limit and ratio of M. aeruginosa was 2.88×106cells and 37%，respectively. Furthermore，M.aeruginosa was identified and detected in the cyanobacterial samples from Taihu Lake and the detection rate of assigned peaks was 76.9%. In conclusion，MALDI-TOF MS employing ribosomal proteins as biomarkers could be successfully applied to the identification of mixed and actual cyanobacterial samples and will be expected as routine tool in environmental cyanobacteria monitoring.

ribosomal protein；Microcystis aeruginosa；MALDI-TOF MS；cyanobacterial bloom

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0268

藍(lán)藻為一種原始而古老的藻類原核微生物，在適宜的水文、氣象條件下易在富營養(yǎng)湖泊中大量繁殖而形成藍(lán)藻水華，被認(rèn)為是影響水質(zhì)指標(biāo)的重要因素［1］。許多藍(lán)藻尤其是淡水水體中常見的銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）會產(chǎn)生以微囊藻毒素為代表的有毒次生代謝產(chǎn)物，對人畜的肝臟及皮膚產(chǎn)生極大傷害，嚴(yán)重危害水體環(huán)境以及人類自身身體健康和生命安全［2-4］，這也使得藍(lán)藻水華問題成為國內(nèi)外關(guān)注的重要環(huán)境問題之一?，F(xiàn)今對藍(lán)藻的鑒別方法主要有傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)和基于16S rRNA基因的分子生物技術(shù)，耗時耗力操作復(fù)雜且精度不夠［5-7］，因此，簡便、快速、精確地鑒別藍(lán)藻的方法是非常必要的。

2017-04-05

國家重點研發(fā)計劃（2016YFC0400801）

江文靜，女，碩士研究生，研究方向：鑒別藍(lán)藻新方法的研究與應(yīng)用；E-mail：1452765330@qq.com

孫麗偉，女，博士，副教授，研究方向：富營養(yǎng)化湖泊的機(jī)理與治理；E-mail：liwei-sun@seu.edu.cn

（責(zé)任編輯 狄艷紅）