李想 孫巖 王新珍 劉俊杰 王光華

（1. 中國科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所 中國科學(xué)院黑土區(qū)農(nóng)業(yè)生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150081；2. 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；3. 中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所農(nóng)業(yè)資源研究中心 中國科學(xué)院農(nóng)業(yè)水資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石家莊 050021）

一種新的噬菌體基因多樣性分子標(biāo)記基因phoH研究進(jìn)展

李想1，2孫巖1，2王新珍3劉俊杰1王光華1

（1. 中國科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所 中國科學(xué)院黑土區(qū)農(nóng)業(yè)生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150081；2. 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；3. 中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所農(nóng)業(yè)資源研究中心 中國科學(xué)院農(nóng)業(yè)水資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石家莊 050021）

噬菌體作為結(jié)構(gòu)最簡單的生命體，不僅在調(diào)節(jié)寄主群落結(jié)構(gòu)、遺傳物質(zhì)的水平移動方面作用巨大，同時也被證明在元素生物地球化學(xué)循環(huán)中具有非常重要的地位。盡管噬菌體的重要性越來越引起研究者的關(guān)注，但遺憾的是目前對于噬菌體基因多樣性的研究還存在很大的局限性，發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證一種適合于研究噬菌體基因多樣性的分子標(biāo)記基因是環(huán)境病毒生態(tài)學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。介紹了一種新的分子標(biāo)記基因-噬菌體輔助代謝磷酸鹽調(diào)節(jié)基因phoH，并綜述了近年來利用該基因揭示海洋海水、稻田田面水和沙漠石下生物中噬菌體基因多樣性的研究進(jìn)展。結(jié)果表明，噬菌體phoH基因分布與其生存環(huán)境關(guān)系密切，按獲取環(huán)境不同phoH基因被劃分為多個類群。最后對噬菌體phoH基因未來研究方向給予展望。

噬菌體；phoH基因；多樣性；海洋；稻田

通常學(xué)術(shù)界認(rèn)為噬菌體的研究史可以劃分為3個時期：細(xì)菌病毒最早于1915年和1917年被Twort和D’Herelle發(fā)現(xiàn)，當(dāng)時科學(xué)家期望利用噬菌體進(jìn)行醫(yī)療方面的開發(fā)研究，主要應(yīng)用于治療細(xì)菌感染。然而到20世紀(jì)40年代隨著抗生素的發(fā)現(xiàn)，噬菌體便迅速退出了治療細(xì)菌感染的領(lǐng)域，這一目標(biāo)逐漸被放棄，這被認(rèn)為是噬菌體研究的第一個時期。需要說明的是，近年來伴隨著細(xì)菌抗耐藥性的增強(qiáng)和超級細(xì)菌的出現(xiàn)，噬菌體療法的研究又開始復(fù)蘇。噬菌體研究的第二個時期是從20世紀(jì)70年代開始的，在這一時期，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)噬菌體是現(xiàn)代分子生物學(xué)研究的一個很好的工具，對推動分子生物學(xué)發(fā)展起到重要的作用，故此有 “高等生物的分子生物學(xué)并不是站在巨人的肩膀上，而是站在矮小的噬菌體上” 這樣的說法［8］。噬菌體研究的第三個階段是從21世紀(jì)初開始的，科學(xué)家（主要是海洋生物學(xué)家）發(fā)現(xiàn)噬菌體通過感染寄主，導(dǎo)致細(xì)胞裂解，細(xì)胞中營養(yǎng)元素釋放到環(huán)境中，間接地促進(jìn)了環(huán)境中有機(jī)和無機(jī)營養(yǎng)元素的循環(huán)，是元素生物地球化學(xué)循環(huán)的重要驅(qū)動者之一；噬菌體能侵染多個宿主，是物種間基因水平轉(zhuǎn)移的重要媒介，它直接影響到微生物群落結(jié)構(gòu)和物種進(jìn)化，是決定微生物多樣性的關(guān)鍵影響因子［9］；同時也發(fā)現(xiàn)噬菌體基因結(jié)構(gòu)組成非常復(fù)雜，大量未知的遺傳基因被認(rèn)為是基因庫中的“暗物質(zhì)”，對這些暗物質(zhì)基因的研究，有助于揭開生命的起源、演替和更迭規(guī)律，有助于確定噬菌體在生態(tài)系統(tǒng)中的地位和作用，從這一時期開始，科學(xué)家們開啟了研究病毒生態(tài)學(xué)的熱潮［10］。

盡管噬菌體廣泛存在于各種生境中，但學(xué)術(shù)界對其數(shù)量和遺傳基因多樣性的研究還存在許多瓶頸問題需要克服。首先是人們對自然界中噬菌體認(rèn)識的傳統(tǒng)的方法主要是依靠寄主細(xì)胞誘捕和電子顯微鏡觀察。然而自然環(huán)境中決大部分噬菌體的宿主目前尚處于不可培養(yǎng)狀態(tài)［11］，從而限制了噬菌體的獲取，其次是目前尚缺乏通用的標(biāo)記基因用于病毒或者噬菌體基因多樣性研究，即沒有發(fā)現(xiàn)諸如像原核生物16S rDNA和真核生物18S rDNA中存在共有的保守序列，用于基因多樣性研究［12］。但近年來，隨著噬菌體基因組學(xué)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)噬菌體某些家族的結(jié)構(gòu)或功能蛋白氨基酸片段序列高度保守，利用這些保守片段氨基酸序列設(shè)計(jì)引物，可以直接采用PCR 擴(kuò)增技術(shù)，從環(huán)境中獲得噬菌體特定家族基因序列，用于噬菌體遺傳多樣性分析［13］。這些基因包括編碼噬藍(lán)藻體殼組裝蛋白的g20基因［14-16］、編碼T4型噬菌體主要?dú)さ鞍椎?g23 基因［17-18］、T7 型噬菌體的DNA 合成酶pol 基因［19-20］、編碼藍(lán)藻噬菌體光系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）反應(yīng)中心蛋白D1和D2蛋白的psbA和psbD基因［21-22］，磷酸鹽調(diào)節(jié)基因phoH基因［23-26］等。前文對自然環(huán)境中編碼g23 基因和g20基因多樣性研究進(jìn)展已進(jìn)行了綜述［27-28］，本文以最新報(bào)道的phoH基因?yàn)槟繕?biāo)，綜述近年來海洋和稻田環(huán)境中噬菌體該基因多樣性的研究進(jìn)展，目的向研究者推薦一種用于噬菌體生態(tài)學(xué)研究新的標(biāo)記基因，從而促進(jìn)該基因在噬菌體基因多樣性研究中的應(yīng)用，促進(jìn)病毒生態(tài)學(xué)研究進(jìn)展。

1 噬菌體輔助代謝基因——phoH基因

噬菌體輔助代謝基因（Auxiliary metabolic genes，AMGs）是指與其寄主具有同源關(guān)系的基因。噬菌體AMG是從寄主那里獲得的，但其基因序列又與寄主的代謝基因有所區(qū)別。通常我們認(rèn)為噬菌體的生存完全依賴于寄主細(xì)胞的生命活動，不會攜帶冗余的代謝基因，但最近科學(xué)家針對部分海洋噬菌體全基因組測序和海洋病毒宏基因組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，一些噬菌體攜帶與寄主同源的代謝基因，這些基因包括藍(lán)藻噬菌體參與光合作用的基因psbA和psbD［29］，噬菌體焦磷核苷酸水解酶基因mazG［30］及磷酸鹽調(diào)節(jié)基因phoH［23-26］等。藍(lán)藻噬菌體攜帶輔助代謝基因psbA和psbD的功能被科學(xué)家解讀為在寄主細(xì)胞光合系統(tǒng)受到光損失時，噬菌體啟動自身攜帶的光合基因以彌補(bǔ)修復(fù)寄主的光合作用系統(tǒng)，從而使噬菌體更好地繁殖［21，31-32］。但關(guān)于噬菌體phoH基因是否和怎樣參與寄主的磷營養(yǎng)吸收還沒有明確的研究報(bào)道。盡管對噬菌體phoH基因的代謝功能尚不明確，但研究者發(fā)現(xiàn)該基因可以作為研究噬菌體基因多樣性一個好的分子標(biāo)記基因。

Goldsmith等［25］通過使用來自大腸桿菌（Escherichia coli）菌株K-12亞型MG1655，原綠球藻（Prochlorococcus） 菌 株 NATL1A和 NATL2A的基因組的磷酸鹽調(diào)節(jié)基因與GenBank數(shù)據(jù)庫中的病毒子集進(jìn)行BLAST相似性檢索。在檢測的35個磷酸鹽調(diào)節(jié)基因中［33］，只有5個基因（phoH，pstS，phoA，phoE和ugpQ）在噬菌體基因組中被發(fā)現(xiàn)。比對結(jié)果表明，在GenBank數(shù)據(jù)庫中完全測序的602個噬菌體基因組中有42個攜帶phoH基因，而攜帶pstS、phoA、phoE和ugpQ基因噬菌體的基因分布只出現(xiàn)在9、2、1和3個噬菌體基因組中。為此，Goldsmith等認(rèn)為phoH基因可以作為一種新的分子標(biāo)記基因用于研究海洋噬菌體多樣性。與目前普遍使用的研究噬菌體多樣性其他分子標(biāo)記基因，如g23、g20、DNA pol和psbA等不同，phoH基因不局限于某一特定形態(tài)的病毒家族［34］，同時該基因在一些侵染自養(yǎng)和異養(yǎng)細(xì)菌的噬菌體，甚至在感染自養(yǎng)真核微生物病毒中都有可能存在，故此該基因的使用范圍更寬泛。

基于此，美國南佛羅里達(dá)大學(xué)的Goldsmith等［25］通過比較聚球藻（Synechococcus）噬菌體S-PM2，原綠球藻噬菌體P-SSM2 和P-SSM4，以及弧菌（Vibrio）噬菌體KVP40的phoH基因的全長序列，設(shè)計(jì)出了簡并性引物vPhoHf（5'-TGC RGG WAC AGG TAA RAC AT-3'）和 vPhoHr（5'-TCR CCR CAG AAA AYM ATT TT-3'），他們首次采用該引物PCR擴(kuò)增海水病毒DNA樣品，評估了海水中噬菌體phoH基因的多樣性。

2 海洋環(huán)境中噬菌體phoH基因多樣性

對噬菌體phoH基因多樣性的研究主要集中在海洋水體環(huán)境。Goldsmith等［25］采用其設(shè)計(jì)的簡并性引物vPhoHf 和vPhoHr率先對大西洋馬尾藻海深度分別為0米、200米、500米和1 000米海水中病毒的DNA進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，通過氨基酸比對構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹表明，來自該海域海水噬菌體phoH序列形成5個類群（Group 1-5）。其中，Group 1和Group 5分布廣，在所有深度剖面的樣品中均檢測得到；Group 2含有大部分的可培養(yǎng)的藍(lán)藻噬菌體的phoH序列和環(huán)境樣品克隆，但在深度500 m的樣品中未檢出；Group 3中的克隆序列在光照區(qū)域較為豐富，并隨著深度增加而減小，在深度1 000米的樣品中未檢出，Group 3進(jìn)一步被劃分為3個亞群，分別為Group 3a、3b 和 3c；Group 4包含的克隆均來自于1 000 m深度的樣品中。在5個類群中，只有Group 2含有可培養(yǎng)的藍(lán)藻噬菌體phoH序列，其他4個類群全部由未知的環(huán)境噬菌體克隆組成。該研究表明，在馬尾藻海域環(huán)境中存在著獨(dú)特的噬菌體類群，且這些噬菌體中phoH序列分布隨采樣深度不同存在顯著差異。

為了探究海洋中噬菌體phoH基因分布是否存在地域性，Goldsmith等［25］進(jìn)一步對6個海域（墨西哥灣、北冰洋、不列顛哥倫比亞沿海水域、地中海、馬尾藻海、挪威海岸水域）0-100米深度水體病毒濃縮物的DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增。構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹表明，在前面發(fā)現(xiàn)的5個噬菌體類群基礎(chǔ)上，還發(fā)現(xiàn)1個新的噬菌體phoH類群（Group 6）。其中，Group 1中80%以上的序列來自挪威海岸水域（Raunefjorden）；而Group 2僅在馬尾藻海和墨西哥灣這兩個研究地點(diǎn)被發(fā)現(xiàn)；Group 3主要存在于采自不列顛哥倫比亞海灣的樣品中；Group 4包含的克隆主要來自北冰洋王灣（Kongsfjorden）；Group 5中的噬菌體也主要存在于馬尾藻海的海水中；而Group 6則主要來自Raunefjorden和墨西哥灣的海水樣品中。在6個類群中，除Group 2含有分離得到的藍(lán)藻噬菌體外，其他5個類群組成均為環(huán)境克隆。該結(jié)果進(jìn)一步表明，目前學(xué)術(shù)界獲得的可培養(yǎng)噬菌體只能表征海洋噬菌體多樣性的極小部分，海洋中存在大量的未知的噬菌體phoH基因資源。

在上述發(fā)現(xiàn)基礎(chǔ)上，2015年Goldsmith等［35］對大西洋馬尾藻百慕大海域研究站夏季（9月）和冬季（3月）采集的海水樣品進(jìn)行3年（2008、2010和2011年）的追蹤研究。他們采用454高通量測序技術(shù)共獲得了3 600個phoH基因操作分類單元（OTU），發(fā)現(xiàn)夏季和冬季噬菌體phoH基因分布顯著不同，且噬菌體季節(jié)性差異明顯大于年際間的差異。雖然采用高通量測序技術(shù)捕獲到非常豐富的phoH基因序列，但大多數(shù)phoH序列屬于幾個主要的OTU，其中OTU1-OTU5平均占所有序列的52.4%，相對豐度最高的前18個OUT占所測得序列的82%。同樣，從該海域獲得的phoH基因劃分到Group 1-Group 5中，沒有發(fā)現(xiàn)新的類群，這與他們團(tuán)隊(duì)2011年報(bào)道的結(jié)果相似。不同年份研究獲得相似的結(jié)果充分表明利用phoH基因表征的噬菌體基因多樣性具有較強(qiáng)的可靠性。

3 稻田中噬菌體phoH 基因多樣性

對GenBank上噬菌體基因組信息分析發(fā)現(xiàn)，有大約40%來自海洋環(huán)境的噬菌體攜帶phoH基因，與此相對應(yīng)只有4%來自非海洋環(huán)境噬菌體攜帶phoH基因［25］。這一發(fā)現(xiàn)似乎限制了phoH基因在陸地生態(tài)系統(tǒng)噬菌體多樣性研究中的應(yīng)用。但需要指出的是，GenBank中噬菌體全基因組信息來源于可培養(yǎng)噬菌體，由于環(huán)境中可培養(yǎng)的細(xì)菌只占很小部分，這無疑限制了噬菌體的獲得，進(jìn)而導(dǎo)致自然環(huán)境中許多可能攜帶phoH基因的病毒不能被發(fā)現(xiàn)。另外，如果磷營養(yǎng)缺乏是誘發(fā)噬菌體攜帶輔助代謝phoH基因的前提條件，那么與海洋水體環(huán)境相比，非海洋的陸地環(huán)境可能不缺磷，由此提出是否非海洋生態(tài)系統(tǒng)噬菌體也攜帶phoH基因。

為了解開這一謎團(tuán)，2016年Wang等［36］首次采用引物vPhoHf/vPhoHr 對采集到我國東北4個稻田（大安、牡丹江、閻家崗和綏化）水體樣品DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。然后將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用膠純化、克隆和Sanger測序方法，分析研究phoH基因多樣性。從4個稻田水體中獲得了424個噬菌體phoH基因序列，其中約90%的序列分布在含有自養(yǎng)細(xì)菌病毒分離株的phoH基因群中，據(jù)此判斷這些序列可能來源于藍(lán)藻病毒；其余10%的序列則分布在含有異養(yǎng)細(xì)菌病毒分離株的phoH基因群中，推斷其來源于異養(yǎng)細(xì)菌病毒。將獲得的phoH基因序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLASTp比對后發(fā)現(xiàn)，大約70%的基因序列與登錄的序列的最高相似度均小于70%，表明稻田生態(tài)系統(tǒng)中存在大量未知的噬菌體phoH基因。該研究首次揭示出稻田生態(tài)系統(tǒng)中噬菌體也攜帶phoH基因，表明此基因也可以作為研究海洋以外其他陸地環(huán)境中噬菌體多樣性的有效標(biāo)記基因。

將來自稻田水體和海洋水體中噬菌體phoH基因一起構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)，在原有的6個海洋水體噬菌體phoH基因類群（Group 1-6）的基礎(chǔ)上［25］，又將從稻田水體獲得的大部分phoH基因序列建立了4個獨(dú)特的類群和7個新的亞群，其中Groups 2、3、4、6為海洋水體和我國東北稻田水體共有類群；Group 1和Group 5在本次我國東北稻田水體中未檢出，而類群 Group α、Group β、Group γ和 Group δ和亞群Group 2b、Group 3d、Group 3e、Group 6a、Group 6b、Group 6c和 Group 6d為我國東北稻田特有類群，來自海洋環(huán)境中的克隆未被劃分到這些類群中。研究還發(fā)現(xiàn)，不同稻田水體的噬菌體phoH基因序列分布到不同類群中的比例存在差異，說明稻田噬菌體群落結(jié)構(gòu)組成具有明顯的地理分布特征。采用非度量多維尺度分析（NMDS）方法對采自世界不同海洋水體和中國稻田水體中的噬菌體phoH基因集群分析發(fā)現(xiàn)，稻田與海洋環(huán)境中的噬菌體phoH基因群集差異非常明顯，不同環(huán)境單獨(dú)聚在一起（圖1）。該發(fā)現(xiàn)證明以phoH基因表征的噬菌體群落結(jié)構(gòu)組成在稻田和海洋環(huán)境中完全不同，該結(jié)果進(jìn)一步印證前期我們針對噬菌體g23和g20的研究發(fā)現(xiàn)［27，37］。

圖1 來自不同海洋水體和稻田水體中噬菌體phoH基因群集的NMDS分析［36］

4 沙漠環(huán)境中phoH基因多樣性

最近噬菌體在沙漠中的分布情況也得到了研究者的關(guān)注。2015年Adriaenssens等［38］調(diào)查納米比亞沙漠石下生物宏病毒組中發(fā)現(xiàn)存在輔助代謝基因phoH。通過MetaVir鑒定出18條完整的phoH序列和23條部分phoH序列，構(gòu)建的PhyML系統(tǒng)發(fā)生樹顯示大部分沙漠石下病毒phoH氨基酸序列與來自NCBI數(shù)據(jù)庫中的已知噬菌體的phoH基因關(guān)系遠(yuǎn)，且海洋和沙漠石下病毒phoH基因分布在完全不同的進(jìn)化枝上，該研究說明在陸地生態(tài)環(huán)境中存在獨(dú)特的病毒或噬菌體的phoH基因序列。

5 展望

噬菌體的發(fā)現(xiàn)己經(jīng)有100多年的歷史［39］，一直受到研究者的高度關(guān)注。在過去數(shù)年里，一些用于研究環(huán)境噬菌體基因多樣性的引物被設(shè)計(jì)出來，推動了噬菌體基因多樣性的研究工作［18，21，40-41］。本文介紹的phoH基因是一種新的噬菌體分子標(biāo)記基因，但到目前為止，針對該基因研究僅限于海洋［25］、稻田生態(tài)系統(tǒng)及沙漠生物中［36］，是否在其他生態(tài)環(huán)境中適用尚未見報(bào)道。現(xiàn)有的研究結(jié)果表明，只有Group 2類群包含可分離培養(yǎng)的藍(lán)藻噬菌體phoH基因序列，其他類群都不含有可培養(yǎng)的噬菌體，因此定性這些擴(kuò)增得到的未知噬菌體phoH基因來源還有待明晰。另外，phoH基因是磷酸鹽調(diào)節(jié)基因，其表達(dá)與磷酸鹽脅迫相關(guān)，但為什么噬菌體也攜帶該基因；該基因在噬菌體中的作用是什么；不同磷營養(yǎng)水平是否能夠影響噬菌體該基因的豐度和多樣性，以及多大范圍內(nèi)噬菌體攜帶該基因等問題還不明確。對上述問題的研究將會在一定程度上豐富和推動環(huán)境病毒生態(tài)學(xué)研究的進(jìn)展。

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Research Progress of New Biomarker Gene of phoH for Bacteriophage Genetic Diversity

LI Xiang1，2SUN Yan1，2WANG Xin-zhen3LIU Jun-jie1WANG Guang-hua1
（1. Key Laboratory of Mollisols Agroecology，Northeast Institute of Geography and Agroecology，Chinese Academy of Sciences，Harbin 150081；2.University of Chinese Academy of Sciences，Beijing 100049 ；3. Key Laboratory of Agricultural Water Resources，Center for Agricultural Resources Research，Institute of Genetics and Developmental Biology，Chinese Academy of Sciences，Shijiazhuang 050021）

Bacteriophages（phages）are the simplest biological entities，which play important roles not only in the regulation of their host communities and horizontal transfer of genetic materials，but also in the element biogeochemical cycles. Although the importance of phages is increasingly being paid attentions by researchers，however there are still great limitations on the study of phage gene diversity until now. Therefore，the work of finding and verification of a suitable molecular marker gene for studying the genetic diversity of phage in natural environments is one of the hotspots of virus ecology. In this paper，a new molecular biomarker gene of phage auxiliary metabolic gene of phoH was introduced，and the recent advances in using this gene to reveal the phage genetic diversity in marine waters，paddy floodwaters and desert hypoliths are reviewed. Results showed that the distribution of phage phoH gene was closely related to its living environments，and phoH clones were divided into several groups according their obtained environments. In the end of the paper，the future research directions of phage phoH gene are also proposed.

bacteriophage；phoH gene；diversity；marine；paddy field

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0725

病毒是目前已知的最簡單的生命單位，通常是由DNA或RNA組成的基因組和外殼蛋白（衣殼）兩部分構(gòu)成。病毒在自然界分布廣泛，是地球上最豐富的生物體［1-2］。噬菌體是侵染細(xì)菌的病毒統(tǒng)稱，細(xì)菌是地球上最多的活生物體，僅在海洋中細(xì)菌數(shù)量就高達(dá)1.2×1029［3］。噬菌體數(shù)量遠(yuǎn)大于細(xì)菌數(shù)量，保守估計(jì)海洋中的噬菌體總數(shù)高達(dá)1031［4-6］。在海洋環(huán)境中噬菌體每秒與寄主發(fā)生高達(dá)1023次感染幾率，以維持噬菌體在環(huán)境中的數(shù)量［7］。

2017-09-01

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（41571246）

李想，女，碩士研究生，研究方向：微生物生態(tài)；E-mail：lixiang215@mails.ucas.edu.cn

王光華，男，博士，研究員，研究方向：微生物生態(tài)；E-mail：wanggh@iga.ac.cn

（責(zé)任編輯 李楠）