王西成，錢亞明，吳偉民，趙密珍，周蓓蓓，王壯偉，巫建華

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 果樹研究所,江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京 210014；2.江蘇現(xiàn)代園藝工程技術(shù)中心，江蘇 句容 212400)

6-BA對(duì)葡萄果實(shí)中有機(jī)酸積累及相關(guān)基因表達(dá)的影響

王西成1，錢亞明1，吳偉民1，趙密珍1，周蓓蓓1，王壯偉1，巫建華2

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 果樹研究所,江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京 210014；2.江蘇現(xiàn)代園藝工程技術(shù)中心，江蘇 句容 212400)

為探究6-BA對(duì)葡萄果實(shí)中有機(jī)酸積累的影響，及其調(diào)控果實(shí)有機(jī)酸合成的分子機(jī)制，以里扎馬特葡萄為試材，花前5 d、花后3 d和花后10 d連續(xù)3次對(duì)花序與果穗進(jìn)行6-BA處理，研究6-BA對(duì)葡萄果實(shí)中有機(jī)酸積累及其代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響。結(jié)果表明，成熟果實(shí)中有機(jī)酸含量與6-BA處理濃度密切相關(guān)，30 mg/L處理后，成熟果實(shí)中的酒石酸和總酸含量均顯著低于對(duì)照，但對(duì)蘋果酸、檸檬酸和草酸含量并未產(chǎn)生較大影響；對(duì)于10，20 mg/L 6-BA處理而言，處理與對(duì)照成熟果實(shí)中的各種有機(jī)酸含量均不存在顯著差異?；虮磉_(dá)結(jié)果表明，6-BA處理對(duì)IDH、MDH和PEPC基因的表達(dá)總體表現(xiàn)為抑制，但對(duì)于ME基因的表達(dá)則主要表現(xiàn)為促進(jìn)。據(jù)此分析，6-BA處理抑制果實(shí)中有機(jī)酸合成的原因可能與其影響部分有機(jī)酸代謝相關(guān)基因的表達(dá)有關(guān)。

葡萄；6-BA；有機(jī)酸；基因表達(dá)

葡萄是世界范圍內(nèi)重要的果樹樹種之一，具有較高的經(jīng)濟(jì)學(xué)與生物學(xué)應(yīng)用價(jià)值，在果品市場(chǎng)中占有重要地位。有機(jī)酸的組分及含量是構(gòu)成果實(shí)風(fēng)味品質(zhì)的重要因素，直接影響著果實(shí)的商品與經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1]。通常情況下有機(jī)酸會(huì)在果實(shí)生長過程中逐步積累，在果實(shí)成熟過程中又作為三羧酸循環(huán)(TCA循環(huán))、糖酵解等呼吸基質(zhì)和糖原異生作用基質(zhì)而被消耗。已有研究表明，葡萄果實(shí)從著色期至成熟期，其呼吸商約增大為1.3，這表明此時(shí)果實(shí)是以蘋果酸為呼吸底物進(jìn)行氧化脫羧反應(yīng)[2]。成熟果實(shí)中的有機(jī)酸含量是有機(jī)酸合成、液泡內(nèi)貯存及轉(zhuǎn)移的綜合平衡結(jié)果，因此，如何通過對(duì)葡萄果實(shí)中有機(jī)酸含量的調(diào)控進(jìn)而實(shí)現(xiàn)果實(shí)品質(zhì)的改善，已成為我國葡萄工作者較為關(guān)注的問題[3]。

植物內(nèi)源激素是由植物體自身合成的激素，其在果實(shí)生長發(fā)育和品質(zhì)形成過程中均發(fā)揮著重要作用，使用外源植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)可在一定程度上對(duì)其進(jìn)行調(diào)節(jié)，進(jìn)而達(dá)到改善果實(shí)品質(zhì)的目的[4-5]。6-芐基腺嘌呤(6-benzyladenine，6-BA)是一種人工合成的細(xì)胞分裂素，具有促進(jìn)細(xì)胞分裂、促進(jìn)植物新陳代謝、調(diào)節(jié)營養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸、改善果實(shí)品質(zhì)、促進(jìn)坐果等多種功能[6-7]。Turk等[8]研究發(fā)現(xiàn)，幼果期噴施6-BA對(duì)于蘋果單果重的提高具有較大的促進(jìn)作用。Bound等[9-11]也發(fā)現(xiàn)，外源6-BA處理不僅能夠顯著提高梨果實(shí)的單果重和可溶性固形物含量，同時(shí)對(duì)于蘋果產(chǎn)量和品質(zhì)的提高同樣具有積極的意義。目前，在葡萄上有關(guān)6-BA的應(yīng)用也已見諸報(bào)道，趙權(quán)等[12]認(rèn)為6-BA處理可顯著提高葡萄果實(shí)花色苷及可溶性固形物含量，降低果實(shí)有機(jī)酸含量，進(jìn)而提高果實(shí)品質(zhì)。也有研究發(fā)現(xiàn)，6-BA可通過影響葡萄果實(shí)中相關(guān)轉(zhuǎn)化酶的活性進(jìn)而改變果實(shí)中的可溶性糖含量[13-14]。此外，6-BA處理對(duì)于葡萄果實(shí)中碳氮同化物運(yùn)輸[15-16]、果實(shí)貯藏生理特性[17]、葉片衰老及活性氧代謝[18]等也會(huì)產(chǎn)生較大影響。但有關(guān)6-BA處理對(duì)葡萄果實(shí)中有機(jī)酸組分、含量及相關(guān)基因表達(dá)所產(chǎn)生影響的研究仍未見報(bào)道。鑒于此，本研究以里扎馬特葡萄為試材，通過分析3種不同濃度的6-BA對(duì)葡萄果實(shí)中有機(jī)酸組分、含量及蘋果酸脫氫酶(MDH)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)、L-艾杜糖脫氫酶(IDH)、蘋果酸酶(ME)等有機(jī)酸代謝相關(guān)酶編碼基因表達(dá)的影響，進(jìn)而為6-BA在葡萄生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2015年5-7月在江蘇省果樹種質(zhì)資源圃內(nèi)進(jìn)行，以9 年生里扎馬特葡萄為試材，株行距采用1 m×3 m，架勢(shì)為雙十字V型架，采用設(shè)施避雨栽培模式。供試葡萄植株長勢(shì)健壯、均一，管理水平為常規(guī)田間管理。

1.2試驗(yàn)處理與取樣方法

試驗(yàn)共設(shè)置4個(gè)處理：10，20，30 mg/L 6-BA，對(duì)照(CK)為清水處理，每個(gè)處理都選取6株生長勢(shì)較為一致且健壯的植株，2株作為1 次重復(fù)，每個(gè)處理設(shè)置3 次重復(fù)，植株生長過程中除處理因素以外，其管理措施和生長環(huán)境均一致。分別于花前5 d(5月7日)、花后3 d(5月15日)和花后10 d(5月22日)分3次進(jìn)行浸蘸花(果)穗處理，處理后從6月19日開始每隔7 d取樣一次，直至果實(shí)成熟(7月31日)。

取樣方法：分別從不同處理植株的東、南、西、北4個(gè)方位各取10粒果實(shí)，每個(gè)處理取果量約為240粒/次。所取樣品一部分立即進(jìn)行液氮速凍，之后保存于-70 ℃超低溫冰箱中，主要用于基因表達(dá)時(shí)各個(gè)樣品的RNA提??；另一部分則放入冰盒中，主要用于不同處理果實(shí)中單果重、可溶性固形物含量，以及各種有機(jī)酸酸含量的測(cè)定。

1.3不同處理果實(shí)單果重與可溶性固形物含量的測(cè)定

從每棵樹上隨機(jī)選取20粒果實(shí)，置于電子天平上稱其總重量，然后求其平均值即為單果重。從完成單果重測(cè)定的果實(shí)中，隨機(jī)選取10粒，利用手持糖度測(cè)定儀完成其可溶性固形物含量的測(cè)定，并求平均值。

1.4有機(jī)酸的提取與測(cè)定

葡萄果實(shí)中有機(jī)酸提取參照王海波等[19]的方法：首先將果肉加液氮充分研磨，取出0.8 g，加入0.2%(m/V)偏磷酸7 mL，超聲波提取2 h，10 000 r/min離心10 min。取上清液，用0.2%(m/V)偏磷酸定容至10 mL。經(jīng)0.22 mm有機(jī)濾頭過濾后進(jìn)色譜柱，用于有機(jī)酸含量及組分測(cè)定。試驗(yàn)共設(shè)置3次重復(fù)。本研究所采用的HPLC系統(tǒng)為Agilent 1100系列，色譜柱為ZORBAX Eclipse XDBC18 (416 mm×250 mm，5 μm)。色譜條件為：以0.2%(m/V)偏磷酸溶液為流動(dòng)相；流速為0.5 mL/min，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量5 μL，使用Shimadzu SPD-20A紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長為214 nm。采用外標(biāo)法進(jìn)行定量分析。試驗(yàn)所用的草酸、酒石酸、檸檬酸及蘋果酸等均購自Sigma公司。

1.5有機(jī)酸代謝相關(guān)基因qRT-PCR表達(dá)分析

用于葡萄果實(shí)中總RNA提取的試劑盒為Quick RNA isolation Kit，購自北京華越洋生物科技有限公司。以提取的果實(shí)中總RNA為反轉(zhuǎn)錄模板，同時(shí)參考TaKaRa Prime ScriptTMRT-PCR試劑盒說明反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

葡萄內(nèi)參基因UBI(XM_002266714)，有機(jī)酸代謝相關(guān)基因IDH、ME、MDH和PEPC熒光定量PCR引物序列均參考已有報(bào)道(UBI-F：5′-GCTCGCTGTTTTGCAG

TTCTAC-3′，UBI-R：5′-AACATAGGTGAGGCCGCACTT-3′；Me-F：5′-CAACTGTTGGTGAGGCTTGC-3′，Me-R：5′-CCAGAATCCGCTCACCATCA-3′；IDH-F：5′-CCTGTGAG

AAGCTGAGACCG-3′,IDH-R：5′-GTCTTGATGCCCAGAA

GCCA-3′；MDH-F：5′-GCTGAGGCCAATGTACCAGT-3′，MDH-R：5′-ATGCCATTGAGAGGGTTGCA-3′；PEPC-F：5′-TACCTTCCGAGTTGCTGCTG-3′，PEPC-R：5′-GCTCCC

CTCAAGTCCTTCAC-3′)[20]?；虻谋磉_(dá)分析主要參照SYBR Premix Ex TaqTM實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒說明書進(jìn)行，實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系為：cDNA模板1 μL，上下游引物各0.8 μL，2×SYBR Premix Ex-TaqTM10 μL，ddH2O補(bǔ)足至20 μL。95 ℃預(yù)變性1 min；95 ℃變性 10 s，55 ℃退火 20 s，72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)；每個(gè)樣品設(shè)置3次重復(fù)，采用ΔΔCt法對(duì)熒光定量PCR結(jié)果進(jìn)行初步分析，而目的基因最終的相對(duì)表達(dá)量則通過2-ΔΔCt法計(jì)算獲得[21]。

本試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，相關(guān)數(shù)據(jù)分別采用Excel 2007和SPSS 17.0軟件進(jìn)行處理與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1不同濃度6-BA對(duì)葡萄單果重和可溶性固形物含量的影響

果實(shí)質(zhì)量測(cè)定結(jié)果表明，6-BA處理與對(duì)照果實(shí)的生長發(fā)育都表現(xiàn)為線性增長。與對(duì)照相比，6-BA處理35 d后可以顯著提高葡萄果實(shí)的單果重(圖1)?？扇苄怨绦挝锖繙y(cè)定結(jié)果則表明，在果實(shí)達(dá)到完熟狀態(tài)前，其可溶性固形物含量會(huì)隨著果實(shí)的進(jìn)一步發(fā)育而逐步提高。6-BA處理后49 d內(nèi)，處理與對(duì)照間可溶性固形物含量并未表現(xiàn)出顯著性差異，但自處理后56 d開始，處理果實(shí)中的可溶性固形物含量多顯著高于對(duì)照，且待果實(shí)完熟后，

不同小寫字母表示不同處理之間差異顯著(P<0.05)。圖2-4同。

30 mg/L 6-BA處理與對(duì)照間差異最為顯著(圖2)。

圖2 不同濃度6-BA處理對(duì)葡萄果實(shí)可溶性固形物含量的影響Fig.2 Effects of different concentrations of 6-BA on grape soluble solids content

2.2不同濃度6-BA對(duì)葡萄果實(shí)中有機(jī)酸含量的影響

由圖3可知，伴隨著葡萄果實(shí)的逐步發(fā)育與成熟，除草酸外，其他種類有機(jī)酸的含量都表現(xiàn)為逐漸下降。對(duì)于總酸含量(以鮮質(zhì)量計(jì))，不同濃度6-BA處理對(duì)其含量所產(chǎn)生的影響存在較大差異，10，20 mg/L6-BA處理多數(shù)時(shí)期并未對(duì)總酸含量產(chǎn)生較大影響，而30 mg/L 6-BA處理則顯著降低了成熟果實(shí)中總酸含量。與總酸含量變化相似，成熟果實(shí)中酒石酸的合成同樣受到30 mg/L 6-BA處理的顯著抑制，而其他2種濃度6-BA處理則未對(duì)成熟果實(shí)中酒石酸含量(以鮮質(zhì)量計(jì))產(chǎn)生顯著影響。蘋果酸與檸檬酸含量(以鮮質(zhì)量計(jì))變化趨勢(shì)較為一致，且在處理49 d(7月10日)后，處理與對(duì)照果實(shí)間基本不存在顯著差異。與上述有機(jī)酸相比，草酸含量(以鮮質(zhì)量計(jì))變化較為復(fù)雜，但總體呈現(xiàn)出先升高后降低的變化趨勢(shì)，且在處理后70 d時(shí)(7月31日)的成熟果實(shí)中基本檢測(cè)不到草酸的存在。

圖3 不同濃度6-BA處理對(duì)葡萄果實(shí)中有機(jī)酸含量的影響Fig.3 Effects of different concentrations of 6-BA on grape organic acids content

2.36-BA對(duì)葡萄果實(shí)中有機(jī)酸代謝相關(guān)基因表達(dá)量的影響

qRT-PCR分析結(jié)果表明，6-BA處理對(duì)4個(gè)有機(jī)酸代謝相關(guān)基因的表達(dá)均產(chǎn)生了一定影響(圖4)。處理后28 d(6月19日)，6-BA處理抑制了PEPC基因的表達(dá)，但卻促進(jìn)了ME基因的表達(dá)，對(duì)于IDH和MDH的表達(dá)則表現(xiàn)為高濃度處理抑制，低濃度處理影響較小。處理后35 d，30 mg/L 6-BA處理抑制了IDH和MDH表達(dá)，對(duì)PEPC影響不顯著，但卻促進(jìn)了ME基因的表達(dá)。處理后42 d，6-BA處理對(duì)IDH、ME和PEPC表達(dá)多表現(xiàn)為抑制，但對(duì)MDH基因表達(dá)則主要表現(xiàn)為促進(jìn)。處理后49～56 d時(shí)，不同濃度的6-BA處理會(huì)對(duì)相關(guān)基因的表達(dá)產(chǎn)生較大差異。處理后63～70 d時(shí)，6-BA處理主要表現(xiàn)為促進(jìn)ME基因的上調(diào)表達(dá)，但對(duì)于其他基因的表達(dá)則會(huì)有不同程度的抑制?？傮w分析發(fā)現(xiàn)，外源6-BA處理對(duì)IDH、MDH和PEPC的表達(dá)總體表現(xiàn)為抑制，但對(duì)于ME基因的表達(dá)則主要表現(xiàn)為促進(jìn)作用。

圖4 6-BA處理對(duì)葡萄果實(shí)有機(jī)酸代謝相關(guān)基因表達(dá)量的影響Fig.4 Effects of 6-BA on the relative expression of organic acid metabolism related genes in grape berries

3 討論

果實(shí)內(nèi)的有機(jī)酸主要包括：蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、琥珀酸、奎寧酸、抗壞血酸及莽草酸等。不同種類果樹的果實(shí)中其有機(jī)酸組分和比例存在一定差異，而恰恰是這種差異使得不同種類果實(shí)呈現(xiàn)出各自獨(dú)特的風(fēng)味[22]。已有研究表明，酒石酸、檸檬酸、蘋果酸、草酸及琥珀酸等是構(gòu)成葡萄果實(shí)中有機(jī)酸的主要成分[23-24]，這與本研究中酒石酸和蘋果酸含量較高、檸檬酸和草酸含量較低的情況較為一致。同時(shí)也說明外源6-BA處理僅僅改變了葡萄果實(shí)中有機(jī)酸組分所占比例，并未影響其組成類型。

有機(jī)酸的含量與種類不僅會(huì)直接影響葡萄果實(shí)的風(fēng)味口感、營養(yǎng)價(jià)值，同時(shí)對(duì)于釀造出的葡萄酒品質(zhì)也會(huì)產(chǎn)生較大影響。酒石酸作為葡萄果實(shí)中重要的有機(jī)酸之一，其不僅能夠?yàn)槠咸丫铺峁┕羌芪镔|(zhì)，同時(shí)也是葡萄酒酸味的主要來源[25-26]。本研究結(jié)果表明，3種不同濃度的6-BA處理中僅30 mg/L處理對(duì)成熟果實(shí)中的總酸和酒石酸含量產(chǎn)生了顯著的抑制作用，而10，20 mg/L 6-BA處理則未對(duì)成熟果實(shí)中酒石酸、蘋果酸、檸檬酸、草酸，以及總酸含量等產(chǎn)生顯著影響。據(jù)此分析認(rèn)為，外源6-BA處理可抑制果實(shí)有機(jī)酸的合成，但其效果與處理濃度之間存在緊密聯(lián)系。

植物有機(jī)酸的合成與代謝是一個(gè)復(fù)雜的過程，需要多種酶體系的共同參與，因此，明確6-BA處理對(duì)于葡萄果實(shí)中有機(jī)酸代謝相關(guān)基因表達(dá)所產(chǎn)生的影響，會(huì)對(duì)其在葡萄生產(chǎn)中的應(yīng)用帶來重要幫助。L-艾杜糖脫氫酶(IDH)是葡萄酒石酸合成的限速酶，其編碼基因調(diào)控著酒石酸的生物合成[27]。本研究結(jié)果表明，6-BA處理對(duì)于IDH基因的表達(dá)主要表現(xiàn)為抑制，尤其對(duì)于30 mg/L 6-BA處理而言，該情況與此處理果實(shí)中酒石酸含量顯著低于對(duì)照的實(shí)際情況表現(xiàn)一致。對(duì)于MDH和PEPC基因，其編碼酶主要與蘋果酸的合成有關(guān)，而ME基因的表達(dá)則與蘋果酸的降解密切相關(guān)?；虮磉_(dá)分析結(jié)果表明，6-BA處理對(duì)MDH和PEPC的表達(dá)總體表現(xiàn)為抑制作用，對(duì)于ME的表達(dá)主要表現(xiàn)為促進(jìn)作用，但這與處理和對(duì)照果實(shí)中蘋果酸含量不存在顯著差異的情況存在一定差異。究其原因可能在于6-BA處理在影響上述基因表達(dá)的同時(shí)，對(duì)于其他與蘋果酸代謝相關(guān)基因的表達(dá)也產(chǎn)生了影響，結(jié)果導(dǎo)致處理與對(duì)照果實(shí)中的蘋果酸含量并未表現(xiàn)出顯著差異。

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Effectof6-BAonOrganicAcidContentandRelatedGenesExpressioninGrapeBerry

WANG Xicheng1，QIAN Yaming1，WU Weimin1，ZHAO Mizhen1，ZHOU Beibei1，WANG Zhuangwei1，WU Jianhua2

(1.Institute of Pomology，Jiangsu Academy of Agricultural Sciences,Jiangsu Key Laboratory for Horticultural Crop Genetic Improvement，Nanjing 210014，China；2.Jiangsu Engineering and Technology Center for Modern Horticultural，Jurong 212400，China)

In order to study the effect of 6-BA on grape fruit organic acid accumulation，and the possible molecular mechanism of 6-BA regulating organic acid synthesis，a grape cultivar，Rizamat was selected to study the effect of 6-BA on fruit organic acid accumulation and related genes expression. The inflorescences and fruit clusters were treated with 6-BA at 5 days before blooming,3 and 10 days after anthesis respectively.The results showed that organic acid content of the mature grape fruit was closely related to treatment concentration of 6-BA. Tartaric acid and total organic acid content of the mature fruits that treated by 30 mg/L 6-BA was significantly lower than control. But it didn′t play important roles in the content of malic acid，citric acid and oxalic acid. For 10,20 mg/L 6-BA treatment，all kinds of organic acid didn′t show significant difference between treated and control mature fruits. Gene expression result showed that the expression ofIDH,MDHandPEPCwere mainly suppressed by 6-BA treatment，but it also promoted the expression ofME. Therefore，we speculated that the reason for inhibiting organic acid synthesis was that parts of the organic synthesis related genes expression were affected by 6-BA treatment.

Grape；6-BA；Organic acid；Gene expression

2017-06-11

江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(BK20160587)

王西成(1982-)，男，安徽亳州人，副研究員，博士，主要從事葡萄育種及分子生物學(xué)研究。王西成、錢亞明為同等貢獻(xiàn)作者。

趙密珍(1964-)，女，江蘇蘇州人，研究員，碩士，主要從事草莓、葡萄育種及分子生物學(xué)研究。

S663.03

A

1000-7091(2017)05-0149-05

10.7668/hbnxb.2017.05.023