張尚卿，韓曉清，繆作清，吳志會(huì)，張立嬌

(1．唐山市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，河北 唐山 063001；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)研究所，北京 100193；3.石家莊市鹿泉區(qū)植物保護(hù)檢疫站，河北 石家莊 050200)

番茄頸腐根腐病病原鑒定及2種接種方法的評價(jià)

張尚卿1，韓曉清1，繆作清2，吳志會(huì)1，張立嬌3

(1．唐山市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，河北 唐山 063001；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)研究所，北京 100193；3.石家莊市鹿泉區(qū)植物保護(hù)檢疫站，河北 石家莊 050200)

為了確定引起河北省豐南區(qū)發(fā)現(xiàn)的一種植株青枯、維管束褐變的番茄病害的病原菌，進(jìn)行了病原菌分離培養(yǎng)純化、致病性測定、田間接種后再分離、菌落和形態(tài)學(xué)觀察結(jié)合分子鑒定，確定該病害為尖孢鐮刀菌番茄頸腐根腐病?；鸵鸬姆杨i腐根腐病。確定病原菌為尖孢鐮刀菌番茄頸腐根腐病?；汀ηo基接種和浸根接種進(jìn)行了評價(jià)，結(jié)果表明，莖基接種發(fā)病率和死亡率均高于浸根接種。為接種完成該病害的抗病育種和防治藥劑篩選的研究提供了理論依據(jù)。

番茄；頸腐根腐?。徊≡b定；浸根接種；莖基接種

番茄頸腐根腐病(Fusariumcrown and root rot，F(xiàn)CRR)是由尖孢鐮刀菌番茄頸腐根腐病?；?Fusariumoxysporumf.sp.radicis-lycopersici(Forl))引起的一種重要的土傳病害[1]。該病害于1974年首次在日本發(fā)現(xiàn)，隨后在美洲、歐洲和非洲等多個(gè)國家發(fā)生，造成嚴(yán)重?fù)p失[2-7]。該病菌在有機(jī)質(zhì)含量較高的土壤中幾乎不能生長，容易侵染高溫或廣譜殺菌劑滅菌的土壤，基質(zhì)或無土栽培設(shè)施番茄發(fā)病后嚴(yán)重減產(chǎn)甚至絕收。我國于2007年首次在北京地區(qū)發(fā)現(xiàn)該病，之后在山東、黑龍江等地設(shè)施番茄主產(chǎn)區(qū)發(fā)現(xiàn)該病害發(fā)生，并呈現(xiàn)暴發(fā)趨勢[8-10]。由于對該病害了解較少，多地誤診為青枯病或根腐病。菜農(nóng)稱之為“死棵”。番茄頸腐根腐病主要癥狀為植株莖基部交接處、環(huán)繞莖基部有明顯的深褐色病斑，被侵染植株苗期易從病斑處折倒而萎蔫致死；五葉期以后至開花結(jié)果期發(fā)病，則表現(xiàn)為莖基部縊縮、呈深褐色，植株仍然直立而萎蔫致死[10]。癥狀和寄主范圍區(qū)別于番茄枯萎病。

唐山市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院植物保護(hù)研究室于2016年在河北省唐山市豐南區(qū)錢營鎮(zhèn)后打弓莊村發(fā)現(xiàn)該地區(qū)多個(gè)日光溫室在番茄膨果期，出現(xiàn)一種地上癥狀“青枯”，莖部地表以上部分，可見綠色至褐色的縱向條狀凹陷斑(區(qū)別于番茄青枯病)的病害。該病害發(fā)現(xiàn)癥狀后幾天內(nèi)植株青枯死亡。發(fā)病日光溫室發(fā)病率達(dá)30%～60%，嚴(yán)重棚室絕收。造成嚴(yán)重?fù)p失。采樣后帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分析、分離培養(yǎng)后，對病原菌進(jìn)行了形態(tài)學(xué)和ITS序列分析鑒定。同時(shí)，對不同的接種方法進(jìn)行了評價(jià)，對番茄頸腐根腐病研究方法、防治方法和抗病育種研究工作提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1發(fā)病癥狀與標(biāo)本采集

于2016年4月在河北省唐山市豐南區(qū)春茬日光溫室中，選取典型發(fā)病番茄植株，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病株解剖觀察和病原菌分離。

1.2病原菌的分離純化

采用常規(guī)組織分離方法分離病原菌。用無菌水沖洗病莖，將病莖浸入75%酒精中30 s，對病莖表面進(jìn)行消毒。在超凈工作臺(tái)中切取病健交界處組織大小約0.3 mm×0.3 mm。在75%酒精中消毒30 s，再用無菌水沖洗5～6次。滅菌后將其均勻放在PDA培養(yǎng)基上，每皿8～10塊。于26 ℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，待菌落長出后進(jìn)行單孢純化，置于4 ℃下保存。

1.3病原菌的培養(yǎng)特性和形態(tài)學(xué)觀察

將病原菌接種在PDA培養(yǎng)基上，置于26 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)黑暗培養(yǎng)，3，5，7，14 d觀察菌落特征，測量菌落直徑，在光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲和孢子的形態(tài)學(xué)特征。

1.4致病性測定及病原菌再分離

1.4.1 致病性測定 將番茄種子于68 ℃干熱滅菌后，用45 ℃溫水催芽，于25 ℃待幼苗根長至1～2 cm，將幼苗置于培養(yǎng)好的待測病菌未轉(zhuǎn)接的原始分離菌落表面，定期觀察48，96 h后，調(diào)查發(fā)病情況。

1.4.2 兩種田間定植時(shí)接種方法 試驗(yàn)于2017年4月在唐山市農(nóng)科院試驗(yàn)場3號(hào)日光溫室中進(jìn)行。

浸根接種：將菌體刮入無菌水中，濾去菌體，配制成8×106個(gè)/mL的孢子懸浮液。使用滅菌土育苗，在番茄苗長到4～5片真葉時(shí)，用清水將根清洗干凈，用竹片(滅菌)壓住3～5根須根，在上面輕微摩擦，造成傷口，放在孢子懸浮液中浸根處理20 min，對照采用相同方式創(chuàng)傷后，放在清水中浸根處理20 min，然后移栽到唐山市農(nóng)科院試驗(yàn)場3號(hào)日光溫室中。每小區(qū)8 m2，分2行在畦內(nèi)栽種50～60棵處理過的番茄苗，每處理重復(fù)3次(參考Benaouali等[1]的接種方法)。

莖基部接種：使用滅菌土育苗，在番茄苗長到4～5片真葉時(shí)，將苗移栽到唐山市農(nóng)科院試驗(yàn)場3號(hào)日光溫室中。在土壤下面1～2 cm處用竹片(滅菌)擦傷0.5 cm×0.1 cm的表皮，將室內(nèi)培養(yǎng)的帶菌培養(yǎng)基切成1 cm×1 cm的小塊，將菌落面正對傷口連同培養(yǎng)基覆蓋貼靠在傷口上；對照采用相同方式創(chuàng)傷。定植時(shí)覆土位置高于創(chuàng)傷位置1～2 cm。每小區(qū)8 m2，分2行在畦內(nèi)栽種50～60棵處理過的番茄苗，每處理重復(fù)3次。

調(diào)查方法：定植后10，15 d調(diào)查各處理感病情況，記錄總株數(shù)、發(fā)病株數(shù)、死苗株數(shù)，計(jì)算發(fā)病率和死亡率(公式①、②)；每小區(qū)隨機(jī)取樣3株，連根挖出，洗凈后記錄須根條數(shù)。

①

②

1.4.3 病原菌再分離 待1.4.2中2種接菌方法發(fā)病后，采用1.2中的常規(guī)分離方法進(jìn)行再分離，并對分離得到的病原菌進(jìn)行鑒定。

1.5病原菌分子鑒定

將病原菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d，收集菌絲體，利用Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒對病原菌進(jìn)行提取。利用真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGC

GG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)對TSHD2016-5的rDNA-ITS區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用SaPrep柱式DNA膠回收試劑盒進(jìn)行回收，將擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。所得序列測序結(jié)果在NCBI上Blast比對。根據(jù)測序結(jié)果比對NCBI上其他真菌相關(guān)序列信息，利用MEGA 7軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1發(fā)病癥狀和病害種類初步判斷

發(fā)病植株膨果期中午高溫時(shí)全株葉片突然萎蔫，呈青枯狀(圖1-A)。莖部地表以上部分，可見綠色至褐色的縱向條狀凹陷斑，病斑可至地面上至少15～30 cm(圖1-B)。橫切或縱切莖基部，可見維管束褐色病變，部分褐色病變延續(xù)至韌皮部至外皮層；髓部正常，大部分韌皮部正常(圖1-C、D)。在地面以下部分，可見褐色腐爛，縱切面可見維管束褐色、韌皮部褐色腐爛(圖1-E)。

根據(jù)植株癥狀，判斷可能是真菌性頸腐根腐病、枯萎病或者是細(xì)菌性青枯病，因此，首先通過病莖橫切面擠壓，未見菌濃流出，再通過將橫切莖置于無菌水中，放置1～8 h觀察，未見菌濃溢出，在維管束的褐色病變處，可見白色絮狀菌絲產(chǎn)生(圖1-F)。因此，初步鑒定該病為真菌性病害。

A.田間發(fā)病癥狀；B.莖部地表以上；C.縱切莖基部；D.橫切莖基部；E.斜切莖基部；F.橫切面靜置出現(xiàn)白色菌絲。A.Symptoms of plant; B.Collar rot; C.Longitudinal sections of the pivot of tomato plant，browning; D.Cross section of tomato plant pivot;E.Oblique section of tomato plant; F.Static presence of white hyphae.

2.2分離純化

在河北省唐山市豐南區(qū)采集的番茄病莖中共分離獲得7個(gè)菌株，對菌株產(chǎn)生的菌落和真菌的形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行觀察。結(jié)果表明，性狀和分生孢子形態(tài)特征上無明顯差異。將該病菌編號(hào)TSHD2016-5。

2.3病原菌的培養(yǎng)特性和形態(tài)學(xué)特征

TSHD2016-5在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d，菌落直徑為5.46 cm(圖2-A、B)，7～8 d長滿直徑為90 mm的培養(yǎng)基。菌落圓形，菌絲白色絨氈狀，隨時(shí)間增加，菌落逐漸變?yōu)榈仙＞哂写?、小分生孢子、厚垣孢?圖3)。大分生孢子多隔，兩端尖鐮刀型。小型分生孢子0～3隔，長圓形。根據(jù)形態(tài)學(xué)特征初步判斷該病原菌為一種尖孢鐮刀菌。

2.4致病性測定

結(jié)果表明，2 d后有部分根系發(fā)褐色，莖部完好(圖4-A)；4 d后大部分根系變褐色；7 d后大部分根系褐色腐爛，莖部一般大多完好(圖4-B、C)。

圖2 TSHD2016-5菌落形態(tài)Fig.2 Colony morphology of TSHD2016-5

2.5田間定植時(shí)浸根接種和莖基部接種的比較

2.5.1接種發(fā)病癥狀 TSHD2016-5接種后出現(xiàn)田間采樣病株根、莖類相似癥狀(圖5)。2種接種方法接種后與未接菌的對照處理(圖5-C)進(jìn)行比較，莖部均出現(xiàn)縱向條形褐色病斑，略有凹陷，切開橫截面，兩接種處理均出現(xiàn)維管束褐色病變。莖部接種發(fā)病較快，接種后第8 天莖基部接種出現(xiàn)該癥狀(圖5-B)；根部壞死，須根脫落；病斑上部近地表處長出次生根。莖基部接種的莖基部易折，根部輕度壞死，須根少量脫落，次生根數(shù)量較多；浸根接種根部大量壞死，須根大量脫落，次生根數(shù)量較多(圖5)。

A.根部接種；B.莖基接種；C.對照處理莖基；照片右下角為對應(yīng)處理病部橫切面。A.Inoculation on root; B.Inoculation on the base of stem; C.Not inoculated;The lower right corner of the photograph is the cross section of the sick section.

2.5.2 浸根接種和莖基接種的發(fā)病情況比較 由表1可以看出，接種后10 d 兩接種處理須根數(shù)顯著低于對照，浸根接種須根數(shù)最少，為17.33條；莖基接種發(fā)病率和死亡率高于浸根處理，分別達(dá)到81.25%，23.33%。接種后15 d浸根接種須根數(shù)最少，為23.67條；莖基接種發(fā)病率和死亡率高于浸根處理，分別達(dá)到93.33%和23.33%。

2.5.3 接種后再分離 接種后3 d，浸根接種和莖基接種的病莖組織在PDA培養(yǎng)基上長出了相同的菌落(圖6)，挑取菌落孢子在顯微鏡下觀察，菌落形態(tài)與孢子性狀大小與TSHD2016-5一致。

該病害田間發(fā)病癥狀與《Plant Pathology》第5版中記錄的由尖孢鐮刀菌番茄頸腐根腐?；椭虏〉姆杨i腐根腐病癥狀、發(fā)病速度和發(fā)病時(shí)期一致[11]；產(chǎn)生孢子類型、大小和形狀與Benaouali等[1]研究的尖孢鐮刀菌番茄頸腐根腐專化型相同。因此，判斷分離純化得到的病原菌為尖孢鐮刀菌番茄頸腐根腐?；?Fusariumoxysporumf.sp.radicis-lycopersici)。

表1 浸根接種、莖基接種試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Result of inoculation test

A.浸根接種；B.莖基接種。A.Inoculation on root;B.Inoculation on the base of stem.

2.6病原菌分子鑒定

通過rDNA-ITS PCR擴(kuò)增，獲得520 bp長度的片段(圖7)。菌株TSHD2016-5的DNA測序，拼裝后去除測序引物，獲得505 bp長度的片段。在GenBank中同源性比對。結(jié)果表明，該菌與尖孢鐮刀菌KY318502.1、KX421442.1同源性達(dá)到100%。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹顯示(圖8)，菌株TSHD2016-5與尖孢鐮刀菌鷹嘴豆?；?Fusariumoxysporumf.sp.ciceris isolate)位于同一分支上。

因此，結(jié)合培養(yǎng)性狀、形態(tài)特征和田間發(fā)病癥狀，確定引起該病害的病原菌TSHD2016-5為尖孢鐮刀菌番茄頸腐根腐病專化型。

圖7 PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.7 Result of PCR amplification

圖8 TSHD2016-5和其他鐮刀菌構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.8 Phylogenetic tree constructed by TSHD2016-5 and other Fusarium

3 結(jié)論與討論

本研究在河北省唐山市豐南區(qū)錢營鎮(zhèn)發(fā)現(xiàn)一種類似青枯病癥狀的病害，經(jīng)病原菌分離培養(yǎng)純化、致病性測定、田間接種后再分離、菌落和形態(tài)學(xué)觀察結(jié)合分子鑒定，確定該病害為尖孢鐮刀菌番茄頸腐根腐病專化型引起的番茄頸腐根腐病。該病害田間癥狀類似青枯病，但橫切面擠壓、置于無菌水中靜置，未見菌濃溢出。在維管束的褐色病變處，可見白色絮狀菌絲。區(qū)別于青枯病[12-16]。另外，該病害顯癥到植株死亡時(shí)間較短，較少出現(xiàn)葉片黃化，莖部綠色至褐色的縱向條狀凹陷斑可至地面上15～30 cm，區(qū)別于枯萎病[17-19]。

目前，對于該病害的研究，主要采用浸根接種[20-21]。本研究對2種接種方法進(jìn)行了評價(jià)。2種方法均可接種發(fā)病，莖基接種發(fā)病較快，8 d出現(xiàn)番茄頸腐根腐病典型癥狀：莖基部出現(xiàn)縱向條形褐色病斑，略有凹陷；發(fā)病率和死亡率高于浸根接種。接種后10 d發(fā)病率達(dá)到81.25%，15 d發(fā)病率達(dá)到93.33%。為莖基接種方式進(jìn)行該病害的發(fā)病條件、寄主范圍、抗病育種和防治藥劑篩選的研究提供了理論依據(jù)。

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PathogenIdentificationandTwoInoculationMethodofFusariumCrownandRootRot

ZHANG Shangqing1，HAN Xiaoqing1，MIAO Zuoqing2，WU Zhihui1，ZHANG Lijiao3

(1.Tangshan Academy of Agricultural Sciences，Tangshan 063001，China; 2.Institute of Plant Protection，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193，China;3.Luquan District Plant Protection and Quarantine Station,Shijiazhuang 050200，China)

In order to identify the pathogenic fungi which causing tomato bacterial wilt in Fengnan District of Hebei Province.This study proved the disease asBipolarissorokinianaby pathogen isolation，pathogenicity test，morphological observation，and rDNA-ITS gene sequence analyses was caused byFusariumoxysporumf.sp.radicis-lycopersici(Forl).The result showed that the mortality and morbidity of stem based inoculation were higher than root soaking inoculation.So，the disease with stem based inoculation developed faster.The study provided theoretical basis for the breeding of disease resistance and the screening of the fungicides.

Tomato;Fusariumcrown and root rot;Identification of pathogenic bacteria;Root soaking inoculation; Inoculation on the base of stem

2017-07-28

唐山市科技計(jì)劃項(xiàng)目(15120203a)

張尚卿(1985-),男,河北唐山人,助理研究員,碩士,主要從事農(nóng)藥施藥技術(shù)及有害生物綜合防治研究。

韓曉清(1966-),女,河北唐山人,副研究員,主要從事有害生物綜合防治研究。

S436.412

A

1000-7091(2017)05-0124-06

10.7668/hbnxb.2017.05.019