李紹翠，姜新強(qiáng)，丁愛(ài)琴，劉慶超，王奎玲，李 偉，劉慶華

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 園林與林學(xué)院，山東 青島 266109)

月季RhMYB61基因的克隆及表達(dá)特性分析

李紹翠，姜新強(qiáng)，丁愛(ài)琴，劉慶超，王奎玲，李 偉，劉慶華

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 園林與林學(xué)院，山東 青島 266109)

為了研究月季MYB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子在月季花朵開(kāi)放中的分子特征和表達(dá)特性，利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的序列信息，結(jié)合RACE技術(shù)，從切花月季薩蔓莎中分離獲得一個(gè)MYB類(lèi)型的轉(zhuǎn)錄因子基因，命名為RhMYB61(登錄號(hào)KY921844)。該基因ORF區(qū)包含1 323 bp，編碼441個(gè)aa，分子量為49.1 kDa，等電點(diǎn)為7.66，公式C2123H3280N620O688S18。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明，RhMYB61與桃樹(shù)中的PpMYB86和枇杷EjMYB8聚為一類(lèi)，屬于R2R3-MYB類(lèi)型轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)一步的蛋白序列多重比較發(fā)現(xiàn)，RhMYB61在N端具有保守的R2-MYB和R3-MYB區(qū)域，包含有7個(gè)保守的基序，在R3-MYB區(qū)域包含有核定位序列。利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)分析了RhMYB61的時(shí)空表達(dá)模式，結(jié)果顯示，隨著開(kāi)花級(jí)數(shù)的增加，RhMYB61的表達(dá)特性呈逐漸增加的趨勢(shì)，在開(kāi)花級(jí)數(shù)5級(jí)時(shí)表達(dá)倍數(shù)最高；失水12 h處理提高了RhMYB61的表達(dá)倍數(shù)；與對(duì)照相比較，乙烯處理6，12，24 h顯著提高了RhMYB61的表達(dá)特性，1-MCP則顯著抑制了其表達(dá)。上述結(jié)果為月季RhMYB61生物學(xué)功能的研究奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也為今后月季的分子育種研究提供了理論參考。

切花月季；RhMYB61；qRT-PCR；表達(dá)特性

MYB轉(zhuǎn)錄因子是植物體內(nèi)最大的轉(zhuǎn)錄因子基因家族之一，成員眾多、功能多樣，廣泛參與了植物的次生代謝調(diào)控、激素和環(huán)境因子的應(yīng)答，并對(duì)細(xì)胞分化、細(xì)胞周期、器官的形成以及植物葉片的形態(tài)建成具有重要的調(diào)節(jié)作用[1]。眾多植物中均分離獲得了與非生物脅迫應(yīng)答相關(guān)的MYB類(lèi)型轉(zhuǎn)錄因子，在草本植物擬南芥AtMYB32[2]、水稻[3]、菊花CmMYB1、CmMYB2[4]，木本植物蘋(píng)果MdSIMYB1[5]、楊樹(shù)PtoMYB170[6]中的MYB轉(zhuǎn)錄因子均能夠?qū)Ψ巧锩{迫如高鹽、干旱、冷脅迫等做出積極的響應(yīng)，MYB轉(zhuǎn)錄因子在對(duì)非生物脅迫中的應(yīng)答方面作用突出。

月季(Rosahybrida)是我國(guó)傳統(tǒng)名花也是世界四大切花之一，其切花銷(xiāo)售量和銷(xiāo)售額在全球花卉貿(mào)易中均居切花之首[7]。因其花期長(zhǎng)、花色豐富等特點(diǎn)，已逐漸成為花朵開(kāi)放等方面研究的模式材料[8]。我國(guó)月季切花主產(chǎn)區(qū)為云南，主要消費(fèi)區(qū)域集中在北京、上海和廣州等城市，需要經(jīng)歷長(zhǎng)時(shí)間長(zhǎng)距離的干式運(yùn)輸，極易遭受失水脅迫和乙烯誘導(dǎo)的花朵開(kāi)放，流通損耗在30%～50%，易造成僵花、僵蕾、花朵不能正常開(kāi)放和衰老過(guò)速，制約了商品價(jià)值的發(fā)揮，對(duì)花卉生產(chǎn)者造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[9]。因此，系統(tǒng)研究月季切花失水脅迫耐性和乙烯作用調(diào)節(jié)的分子機(jī)理，對(duì)切花月季品質(zhì)提高具有重要的理論和實(shí)踐意義。

迄今為止，在月季中獲得了3個(gè)MYB類(lèi)型的轉(zhuǎn)錄因子，分別為RhMYB1[10]、RhMYBs4-1和RhMYBs6-1，它們?cè)诓煌ㄉ录净ㄇ嗨睾铣珊驼{(diào)控花瓣顏色方面發(fā)揮著調(diào)控作用[11]，但對(duì)于數(shù)量眾多、功能多樣的月季MYBs還未充分挖掘。鑒于此，本試驗(yàn)選取切花月季薩曼莎為材料，結(jié)合前期轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，從花瓣cDNA中克隆得到一個(gè)MYB基因，命名為RhMYB61。采用生物信息學(xué)的方法對(duì)該基因的氨基酸序列進(jìn)行序列比對(duì)、理化性質(zhì)和親/疏水性和二級(jí)結(jié)構(gòu)等方面的分析；并利用熒光定量PCR方法檢測(cè)了RhMYB61在月季不同開(kāi)花級(jí)數(shù)、失水脅迫和乙烯處理下的轉(zhuǎn)錄本水平變化。為進(jìn)一步明確RhMYB61基因特性及其對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1試驗(yàn)材料

供試材料為切花月季薩蔓莎(RosahybridaSamantha)，開(kāi)花級(jí)數(shù)2級(jí)，按花枝長(zhǎng)30 cm、留3復(fù)葉的基準(zhǔn)剪切并插入蒸餾水中，復(fù)水1 h后備用。

1.2試驗(yàn)處理

開(kāi)花級(jí)數(shù)參考馬男等[12]對(duì)月季開(kāi)花級(jí)數(shù)的劃分并進(jìn)行取樣。

失水脅迫處理參照按照Dai等[13]進(jìn)行，在溫度為22～25 ℃、相對(duì)濕度為30%～50%、140 μmol/(m2·s)熒光燈(照光12 h/d)照光的條件下水平干置0～24 h。在0，1，3，6，12，24 h分別取樣。

乙烯處理參照馬男等[12]進(jìn)行，將修剪后的花枝置于去離子水中進(jìn)行處理。乙烯處理時(shí)，在64 L密閉容器內(nèi)注入乙烯使其終濃度為10 μL/L，處理24 h，以密閉于不含乙烯氣體的64 L密封箱中的花枝為對(duì)照。

各處理結(jié)束后將花瓣取下立即進(jìn)行液氮冷凍，存于-80 ℃冰箱備用。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1 總RNA提取和cDNA的合成 以1.2中處理后的切花月季花瓣為材料，Hot borate法提取不同處理下花瓣總RNA[14]。利用Nanodrop(美國(guó)Effendorf公司)檢測(cè)提取的RNA樣品濃度，1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取質(zhì)量。cDNA反轉(zhuǎn)錄采用PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Erase(大連TaKaRa公司)試劑盒，將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋4倍后-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2RhMYB61基因的克隆 利用月季EST數(shù)據(jù)庫(kù)[13]的Unigene序列為模板設(shè)計(jì)5′Race擴(kuò)增和3′Race擴(kuò)增特異性引物(表1)并進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為上下游引物 (10 μmol/L) 各 1 μL，ExTaq聚合酶 (5 U/μL) 0.1 μL，10×PCR Buffer 2 μL，dNTP(2.5 mmol/L) 1.6 μL，總cDNA (1 μg/μL) 1 μL，ddH2O補(bǔ)足20 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，利用TaKaRa Mini BESTAgarose Gel DNA Extraction Kit試劑盒(大連TaKaRa公司)回收目的條帶，并與pMD18-T載體連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，藍(lán)白斑篩選，挑取白色單菌落鑒定，根據(jù)菌落PCR結(jié)果，將鑒定出的陽(yáng)性克隆交由青島擎科梓熙生物工程有限公司測(cè)序。

1.3.3 RhMYB61的生物信息學(xué)分析 采用ProtParam (http：//web.Expasy.org/compute_pi/) 預(yù)測(cè)RhMYB61分子量和理論等電點(diǎn)。通過(guò)SignalP軟件進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)[15]；利用ProtScale (http：//web.Expasy.org/protscale/) 分析RhMYB61氨基酸序列的疏水性/親水性；利用TMHMM Server v. 2.0軟件(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)對(duì)RhMYB61進(jìn)行蛋白跨膜性分析[16]。利用ProtFun(http：//www.cbs.dtu.dk/services/ProtFun/) 和PRABI(https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl)對(duì)蛋白質(zhì)功能和二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)[17]。利用Motif分析工具[18]進(jìn)行RhMYB61基序保守性分析。用DNAMAN軟件進(jìn)行序列比對(duì)及翻譯，利用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)[11]。

表1 切花月季RhMYB61基因表達(dá)檢測(cè)引物Tab.1 Primers used to determine the expression of RhMYB61 in cut rose Samantha

1.3.4RhMYB61基因表達(dá)特性分析 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative real-time PCR，qRT-PCR)分析月季切花RhMYB61基因在不同開(kāi)花級(jí)數(shù)及失水、乙烯和1-MCP處理下的表達(dá)模式。不同處理?xiàng)l件總RNA提取和cDNA的合成如1.3.1，按照SYBR PremixExTaq試劑盒(大連TaKaRa公司)的操作說(shuō)明進(jìn)行qRT-PCR，所有反應(yīng)均在Setp One Plus熒光定量PCR平臺(tái)(美國(guó)ABI公司)進(jìn)行，RhUBI1為內(nèi)參基因[19](表1)。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性60 s；95 ℃變性10 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸15 s，共40個(gè)循環(huán)。Melt曲線從72 ℃至99 ℃，第1步維持45 s，以后每升高1 ℃維持5 s。采用2-ΔΔCT法分析數(shù)據(jù)[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1RhMYB61克隆

以開(kāi)花級(jí)數(shù)2級(jí)的切花月季薩蔓莎進(jìn)行失水12 h處理，提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA模板，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組EST序列信息設(shè)計(jì)5′和3′擴(kuò)增引物(表1)，分別進(jìn)行3′RACE和5′RACE，將上述片段與pMD-18T載體連接、轉(zhuǎn)化，并進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，將鑒定正確的樣品測(cè)序。所得結(jié)果如圖1所示，月季RhMYB61登錄號(hào)為KY921844，全長(zhǎng)為1 727 bp，5′端非編碼區(qū)(5′-UTR)為178 bp，開(kāi)放閱讀框?yàn)? 323 bp，編碼441個(gè)氨基酸，3′端非編碼區(qū)(3′-UTR)為226 bp。

M. DL2000 Marker；A. 3′RACE 產(chǎn)物；B.5′RACE 產(chǎn)物；C. RhMYB61開(kāi)放閱讀框片段克隆；D. RhMYB61全長(zhǎng)片段克隆。M. DL2000 Marker；A. 3′RACE fragment；B.5′RACE fragment；C. Open reading frame of RhMYB61；D. Full length of RhMYB61.

2.2RhMYB61生物信息學(xué)分析

2.2.1 RhMYB61基本特性分析 利用生物信息學(xué)軟件ProtParam等對(duì)RhMYB61的蛋白組成成分和理化性質(zhì)進(jìn)行了分析[21]。RhMYB61蛋白相對(duì)分子量49.1 kDa，理論等電點(diǎn)(pI)為7.66，公式C2123H3280N620O688S18，原子量6 729。RhMYB61蛋白為親水蛋白，其N(xiāo)-端頭部較親水，中間氨基酸也表現(xiàn)出親水性，蛋白在第81位疏水性最強(qiáng)，最高值為2.189，第177位親水性最強(qiáng)，最低值為-3.111。蛋白峰值的分布在0.5以上的比在-0.5以下的要少，表明蛋白為親水性蛋白。信號(hào)肽結(jié)果分析表明，RhMYB61不屬于分泌蛋白。蛋白跨膜性分析顯示RhMYB61氨基酸序列中未發(fā)現(xiàn)含有跨膜區(qū)域，不屬于膜蛋白；對(duì)RhMYB61蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示，其氨基酸組成α-螺旋(Hh)為137個(gè)(31.07%)，延伸鏈(Ee)為53個(gè)(12.02%)，無(wú)規(guī)則卷曲(Cc)為219個(gè)(49.66%)，屬于不規(guī)則結(jié)構(gòu)。生物學(xué)功能預(yù)測(cè)顯示RhMYB61具有合成輔酶因子、嘌呤、嘧啶和脂肪酸代謝等方面的功能(表2)。

表2 RhMYB61蛋白質(zhì)功能預(yù)測(cè)Tab.2 Biological function prediction of RhMYB61

2.2.2 RhMYB61保守基序和氨基酸序列比對(duì) 選取擬南芥(Arabidopsisthaliana)、大豆(Glycinemax)、蘋(píng)果(Malusdomestica)、枇杷(Eriobotryajaponica)、白樺(Betulaplatyphylla)、菊花(Chrysanthemummorifolium)、厚葉蒴苣苔(Boeacrassifolia)、黑楊(Populusnigra)、桃(Prunuspercica)、水稻(Oryzasativa)和小麥(Triticumaestivum)中的MYB蛋白序列與月季RhMYB61進(jìn)行基序保守分析，結(jié)果如圖2所示。由圖可知，不同植物MYB蛋白保守基序數(shù)量和位置不盡相同，所有植物均含有基序1、基序2和基序3。RhMYB61與AtMYB61、PpMYB86、MdMYB、EjMYB8、PnMYB和GmMYB86氨基酸序列類(lèi)似，包含有7個(gè)保守基序，在N-端含有5個(gè)保守基序，并呈串聯(lián)排列，C-端含有2個(gè)保守基序，分別為基序4和基序8。基序7僅在TaMYB3R1和OsMYB3R2中有，其他植物中未發(fā)現(xiàn)。

方框表示MYB蛋白的保守基序；灰線條顯示非保守序列；標(biāo)尺代表100個(gè)氨基酸。Each motif is represented by a number in the box and the grey lines represent the nonconserved sequences；The scale bar represents 100 amino acids.

進(jìn)一步選取擬南芥、大豆、蘋(píng)果、枇杷和白樺中的MYB蛋白與月季RhMYB61蛋白進(jìn)行序列多重比對(duì)分析(圖3)。結(jié)果顯示，5個(gè)不同物種MYB蛋白氨基酸序列與月季RhMYB61的一致性分別為42.63%，47.78%，63.19%，62.61%和44.62%，在12-60 aa和61-111 aa處含有2個(gè)保守的MYB結(jié)構(gòu)域，上述不同植物MYB蛋白序列都屬于2R類(lèi)型MYB轉(zhuǎn)錄因子，其N(xiāo)-端都含有非常保守的R2-MYB和R3-MYB結(jié)構(gòu)域，具有 MYB家族典型的結(jié)構(gòu)特征，SeqNLS[22]分析顯示RhMYB61的R3-MYB結(jié)構(gòu)域中還包含有3處核定位序列(NLS，圖3方框部分)，所有植物MYB蛋白C-端氨基酸序列高度分化，推測(cè)不同物種中MYB蛋白功能的多樣性。

At.擬南芥；Gm.大豆；Md.蘋(píng)果；Ej.枇杷；Bp.白樺；Rh.月季。箭頭表示保守的R2和R3結(jié)構(gòu)域；NLS表示核定位序列。At. Arabidopsis thaliana；Gm.Glycine max；Md.Malus domestica；Ej.Eriobotrya japonica；Bp.Betula platyphylla；Rh.Rosa hybrid.The two conserved MYB domain repeat (R2 and R3) are indicated with arrows；Nuclear localization sites was shown with boxed.

2.2.3 RhMYB61蛋白進(jìn)化樹(shù)分析 為進(jìn)一步探究月季RhMYB61與其他物種的同源性進(jìn)化關(guān)系，選用擬南芥、水稻、厚葉旋蒴苣苔、蘋(píng)果、菊花、大豆、枇杷、桃、黑楊、白樺和小麥中的22個(gè)MYB蛋白質(zhì)序列與月季RhMYB61構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系圖(圖4)。結(jié)果顯示，月季RhMYB61與桃PpMYB86、枇杷EjMYB8、蘋(píng)果MdMYB、大豆GmMYB86、擬南芥AtMYB61親緣關(guān)系較近，與水稻OsMYB4、蘋(píng)果MdoMYB121、厚葉旋蒴苣苔BcMYB1親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，上述MYB蛋白均屬于R2R3-MYB類(lèi)蛋白。單子葉植物小麥TaMYB3R1和水稻OsMYB3R1、OsMYB3R2屬于R1R2R3-MYB類(lèi)蛋白，與月季RhMYB61親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。上述結(jié)果暗示了MYB類(lèi)蛋白在雙子葉植物和單子葉植物進(jìn)化上的保守性和多樣性。

2.3RhMYB61表達(dá)特異性分析

2.3.1RhMYB61在不同開(kāi)花級(jí)數(shù)中的表達(dá) 為了明確RhMYB61在月季花朵發(fā)育中的作用，采用qRT-PCR的方法檢測(cè)RhMYB61在月季不同開(kāi)花級(jí)數(shù)中的表達(dá)情況(圖5)。由圖5可知，隨著月季開(kāi)花過(guò)程的進(jìn)行，花瓣中RhMYB61的表達(dá)量呈現(xiàn)逐漸增高的趨勢(shì)，在開(kāi)花級(jí)數(shù)0級(jí)和1級(jí)時(shí)相對(duì)表達(dá)量差別不大，分別為1.00和0.81，開(kāi)花級(jí)數(shù)2級(jí)時(shí)表達(dá)量升高至3.00，顯著高于開(kāi)花級(jí)數(shù)0級(jí)和1級(jí)，開(kāi)花級(jí)數(shù)5級(jí)時(shí)相對(duì)表達(dá)量最高，為13.60，顯著高于其他開(kāi)花級(jí)數(shù)。RhMYB61在月季不同開(kāi)花級(jí)數(shù)中的表達(dá)量暗示著其參與了花朵開(kāi)放的過(guò)程。

2.3.2 不同處理對(duì)RhMYB61表達(dá)量的影響 用定量PCR檢測(cè)了RhMYB61在轉(zhuǎn)錄本水平上對(duì)乙烯處理和失水脅迫處理的響應(yīng)(圖6)。結(jié)果表明，在正常瓶插條件下，花瓣RhMYB61瓶插1，6，12 h只有微弱的表達(dá)，表達(dá)量分別為0.73，1.50，1.80，瓶插24 h后表達(dá)量升高到5.69，乙烯處理明顯誘導(dǎo)了RhMYB61的表達(dá)，乙烯處理6，12 h后，相對(duì)表達(dá)量分別為7.92，7.72，高于同一時(shí)間正常瓶插下的表達(dá)量，乙烯處理24 hRhMYB61相對(duì)表達(dá)量最高為8.37。乙烯抑制劑1-MCP處理降低了RhMYB61的表達(dá)水平，1-MCP處理1，6，12，24 h后RhMYB61表達(dá)量分別為0.21，0.46，0.57，1.07。

At.擬南芥；Gm.大豆；Md.蘋(píng)果；Ej.枇杷；Bp.白樺；Cm.菊花；Pp.桃；Pn.黑楊；Bc.厚葉旋蒴苣苔；Ta.小麥；Os.水稻。At.Arabidopsis thaliana；Gm.Glycine max；Md.Malus domestica；Ej.Eriobotrya japonica；Bp.Betula platyphylla；Cm.Chrysanthemum morifolium；Pp.Prunus percica；Pn.Populus nigra；Bc.Boea crassifolia；Ta.Triticum aestivum；Os.Oryza sativa.

圖中不同小寫(xiě)字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。圖6-7同。Bars with different lowercase letters indicate significant differences by Turkey HSD test(P<0.05).The same as Fig.6-7.

對(duì)RhMYB61在不同失水情況下的表達(dá)特性進(jìn)行了分析，結(jié)果如圖7所示，隨著失水脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，RhMYB61的表達(dá)呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，與正常瓶插植株相比，失水脅迫1 h的RhMYB61轉(zhuǎn)錄本水平差異不大，失水脅迫3，6 h誘導(dǎo)了RhMYB61表達(dá)水平的提高，相對(duì)表達(dá)量分別為1.56和1.87，隨后RhMYB61表達(dá)量逐漸降低，失水脅迫24 h表達(dá)量最低，為0.48。

圖6 不同時(shí)間乙烯處理RhMYB61的表達(dá)Fig.6 Expression analysis of RhMYB61 in response to ethylene in rose petals

圖7 RhMYB61在切花月季不同失水處理的表達(dá)Fig.7 Expression analysis of RhMYB61 expression under different dehydration time

上述結(jié)果表明,乙烯處理顯著誘導(dǎo)了RhMYB61的表達(dá)，失水脅迫處理對(duì)RhMYB61的表達(dá)影響不大。

3 討論

已有研究表明，MYB是植物體內(nèi)最大的一類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子家族之一，在植物次生代謝調(diào)控、激素和環(huán)境因子的應(yīng)答、細(xì)胞分化、細(xì)胞周期、器官的形成以及植物葉片的形態(tài)建成中發(fā)揮了重要作用。對(duì)多種植物中的MYB轉(zhuǎn)錄因子的功能研究發(fā)現(xiàn)，R2R3類(lèi)型MYB轉(zhuǎn)錄因子在植物響應(yīng)非生物脅迫逆境方面發(fā)揮了非常關(guān)鍵的作用，擬南芥AtMYB61[23]、水稻OsMYB91[24]、小麥TaMYB3R1[25]和大豆GmMYBJ7[26]中報(bào)道的R2R3類(lèi)型MYB轉(zhuǎn)錄因子均能夠提高植株對(duì)干旱、高鹽、低溫等非生物逆境脅迫的抵抗能力。而在切花月季中，未見(jiàn)有對(duì)花瓣MYB轉(zhuǎn)錄因子參與非生物脅迫逆境的研究報(bào)道。本研究中，通過(guò)高通量測(cè)序和RACE技術(shù)克隆了月季切花中R2R3類(lèi)型MYB轉(zhuǎn)錄因子RhMYB61，并利用定量PCR檢測(cè)了其在不同開(kāi)花級(jí)數(shù)、乙烯處理和失水脅迫過(guò)程中的表達(dá)變化。結(jié)果表明，RhMYB61廣泛參與了切花月季花朵開(kāi)放的過(guò)程，隨著開(kāi)花級(jí)數(shù)的逐漸增加，表達(dá)量逐漸升高，開(kāi)花級(jí)數(shù)5級(jí)時(shí)表達(dá)量最高，暗示著RhMYB61在月季花朵開(kāi)放和花瓣擴(kuò)展方面發(fā)揮著重要的作用，特別是花朵開(kāi)放后期，參與了月季花朵的衰老進(jìn)程。對(duì)RhMYB61的生物信息學(xué)分析表明，其生物學(xué)功能多集中在參與合成輔酶因子、嘌呤、嘧啶和脂肪酸代謝等方面，其參與月季花瓣衰老進(jìn)程是否通過(guò)上述過(guò)程進(jìn)行還有待進(jìn)一步研究。

切花月季在采收后，從花農(nóng)生產(chǎn)者到消費(fèi)者手中要經(jīng)歷長(zhǎng)時(shí)間的干式遠(yuǎn)距離運(yùn)輸，運(yùn)輸過(guò)程中的外源乙烯積累和失水脅迫極易導(dǎo)致切花開(kāi)放異常，對(duì)切花品質(zhì)和商品價(jià)值產(chǎn)生影響，是月季切花采后損耗的重要因素，因此了解不同切花月季品種對(duì)外源乙烯和失水脅迫的響應(yīng)機(jī)制，對(duì)于切花月季采后保鮮、提高流通質(zhì)量、改良現(xiàn)代月季育種技術(shù)等均具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。切花月季薩曼莎對(duì)外源乙烯非常敏感，外源乙烯處理能夠促進(jìn)月季花朵的開(kāi)放，乙烯抑制劑1-MCP能夠通過(guò)與乙烯受體的結(jié)合，阻斷乙烯的感受，進(jìn)而抑制花瓣內(nèi)源乙烯的自我催化，延緩花瓣的衰老啟動(dòng)，有效抑制花朵乙烯的生成。本試驗(yàn)中，乙烯處理顯著增加了RhMYB61的轉(zhuǎn)錄本水平表達(dá)，乙烯抑制劑1-MCP處理則抑制了RhMYB61的表達(dá)水平，暗示著RhMYB61參與了乙烯誘導(dǎo)的月季花朵開(kāi)放過(guò)程。研究表明，月季乙烯生物合成關(guān)鍵基因(RhACSs和RhACO1)和乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)關(guān)鍵基因(RhETRs和RhCTRs)在月季花朵開(kāi)放過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[27-28]，RhMYB61是否通過(guò)調(diào)控上述基因或者通過(guò)調(diào)控其他功能蛋白進(jìn)而參與對(duì)花瓣擴(kuò)展的調(diào)控，明確RhMYB61在月季花朵開(kāi)放中的調(diào)節(jié)機(jī)理將是后續(xù)研究中需要解決的重要問(wèn)題。

前人研究表明，失水脅迫對(duì)乙烯具有誘導(dǎo)作用[29]。切花月季薩曼莎經(jīng)過(guò)乙烯處理和失水脅迫處理后花朵開(kāi)放狀態(tài)非常類(lèi)似，切花月季中可能存在水分脅迫和乙烯信號(hào)的交叉[30]。基于本試驗(yàn)結(jié)果，失水脅迫處理3，6 h提高了RhMYB61的轉(zhuǎn)錄本水平，而失水脅迫處理12，24 h則降低了其表達(dá)，說(shuō)明RhMYB61至少在轉(zhuǎn)錄水平上未參與月季切花失水脅迫與乙烯信號(hào)的交叉。本研究克隆了月季RhMYB61基因，對(duì)其進(jìn)行了初步研究，后期可進(jìn)一步對(duì)RhMYB61的功能和在切花月季響應(yīng)失水脅迫影響花瓣擴(kuò)展中的作用機(jī)制進(jìn)行研究，對(duì)于明確花瓣開(kāi)放機(jī)理和參與非生物脅迫耐性，利用現(xiàn)代生物育種技術(shù)改良現(xiàn)代切花月季品質(zhì)將具有一定的意義。

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CloningandExpressionCharacteristicsofRhMYB61GenefromRosahybrida

LI Shaocui，JIANG Xinqiang，DING Aiqin，LIU Qingchao，WANG Kuiling，LI Wei，LIU Qinghua

(College of Landscape Architecture and Forestry，Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109，China)

In order to determine the molecular characterization and expression patterns of MYB transcription factors involved in flower opening in Rose. According to the expressed sequence tags from transcriptome assembly and RACE PCR methods，we obtained a new MYB transcription factor gene，and namedRhMYB61(GenBank accession number is KY921844 )，inRosahybridaSamantha petals. The ORF ofRhMYB61 was 1 323 bp，which encoded 441 amino acids. Bioinformatics analysis showed that the molecular weight and theoretical isoelectric point of RhMYB61 was 49.1 kDa and 7.66，respectively，and the formula of RhMYB61 was C2123H3280N620O688S18. Phylogenic tree analysis showed that RhMYB61 was clustered with PpMYB86 and EjMYB8，and belonged to the R2R3-MYB type transcription factor. Multi-alignment of RhMYB61 of several plants found that RhMYB61 had the seven characteristic conservative motifs.Two conserved domains，including R2-MYB domain and R3-MYB domain，were found in its N-terminal. The nuclear localization sites was found in R3-MYB domain. Qualitative PCR analysis showed thatRhMYB61 expression was induced as the rose flower opening.RhMYB61 expression was accumulated at 12 h dehydration treatment，compared with control. In addition，RhMYB61 transcript was rapidly and dramatically induced by 6,12,24 h ethylene treatment compared with control，and was inhibited following 1-methylcyclopropene (1-MCP) treatment.These results above gave a clear data for understanding the biological function ofRhMYB61， and provided a foundation for further research of molecular breeding of rose plant.

Cut roses；RhMYB61；qRT-PCR；Expression characteristics

2017-07-21

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31501798)；山東省優(yōu)秀中青年科學(xué)家科研獎(jiǎng)勵(lì)基金項(xiàng)目(2014BSB01563)

李紹翠(1992-)，女，山東招遠(yuǎn)人，在讀碩士，主要從事園林植物種質(zhì)資源創(chuàng)新和利用研究。

劉慶華(1962-)，男，山東乳山人，教授，博士，博士生導(dǎo)師，主要從事園林植物種質(zhì)資源創(chuàng)新及園林植物種植設(shè)計(jì)研究。

Q78；S685.03

A

1000-7091(2017)05-0061-08

10.7668/hbnxb.2017.05.010