趙良友，高雪麗，劉超男，申海龍，姜 南，萬偉泉，呂曉萍，鄭世民

(1.東北農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學學院，黑龍江省實驗動物與比較醫(yī)學重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030；2.黑龍江中醫(yī)藥大學，藥物安全性評價中心，黑龍江 哈爾濱 150040；3.大連大學 生命科學與技術(shù)學院，遼寧 大連 116622；4.浙江省湖州市長興縣農(nóng)業(yè)局，浙江 湖州 313100)

副豬嗜血桿菌vacJ基因缺失菌株構(gòu)建及其生物學特性分析

趙良友1，2，高雪麗1，劉超男1，申海龍4，姜 南3，萬偉泉1，呂曉萍1，鄭世民1

(1.東北農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學學院，黑龍江省實驗動物與比較醫(yī)學重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030；2.黑龍江中醫(yī)藥大學，藥物安全性評價中心，黑龍江 哈爾濱 150040；3.大連大學 生命科學與技術(shù)學院，遼寧 大連 116622；4.浙江省湖州市長興縣農(nóng)業(yè)局，浙江 湖州 313100)

為了探究副豬嗜血桿菌外膜脂蛋白編碼基因vacJ在其致病中的作用，以血清5型臨診分離株HS49為研究對象，構(gòu)建了vacJ基因缺失菌株(ΔvacJ)，進而比較了野生株與缺失株在生長特性、對細胞的黏附及入侵和毒力等方面的差異。結(jié)果顯示，與野生株相比較，缺失vacJ后的菌株生長速率明顯下降，對PK-15細胞的黏附和入侵能力則明顯降低，形成生物被膜的能力也顯著下降。缺失vacJ菌株對Balb/C小鼠感染模型的LD50是野生株的14倍，表明vacJ基因敲除后，副豬嗜血桿菌毒力明顯下降。表明vacJ基因與副豬嗜血桿菌生長、黏附入侵、生物被膜形成及毒力密切相關(guān)。

副豬嗜血桿菌；vacJ基因；生物學特性；毒力

副豬嗜血桿菌病又稱為革拉瑟氏病(Gl?sser′s disease)，是由副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis，HPS)引起的一種以纖維素性多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎及腦膜炎為特征的重要豬細菌性傳染病[1]。過去一直認為HPS主要是作為豬的一種呼吸道共棲菌存在，僅在特定條件下侵入機體導致發(fā)病[2]。然而近年來，隨著集約化養(yǎng)豬場的迅猛發(fā)展和養(yǎng)殖模式的不斷變化，HPS已成為嚴重危害養(yǎng)化豬業(yè)的三大細菌性傳染病病原之一，給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失[3]。

一直以來，由于遺傳操作工具的缺乏，對于HPS的致病機制及其毒力因子知之甚少，給該病預防和治療帶來了很大困難。最初針對HPS毒力因子的研究主要局限于常規(guī)毒力因子的范圍，如莢膜、外膜蛋白、菌毛、脂多糖等[4]，對臨診診斷及治療指導意義不大。近幾年，各種新型技術(shù)的涌現(xiàn)使得HPS分子生物學研究取得了明顯進展[5-7]。目前通常利用同源重組原理構(gòu)建HPS的基因缺失株，研究靶基因的各種生物學功能[8-9]。研究發(fā)現(xiàn)，HPS具有在自然條件下攝取外源DNA的能力。Bigas等[10]首次報道了HPS 利用腺苷酸環(huán)化酶(cAMP)依賴的自然轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，可接受攜帶有ACCGAACTC信號序列的外源DNA，據(jù)此成功構(gòu)建出了HPS胸苷酸合成酶 (Thy) 缺失株。馬艷平[11]利用結(jié)合轉(zhuǎn)移方法，利用帶有以蔗糖敏感系統(tǒng)為基礎的負向選擇標記的pDM4自殺載體成功構(gòu)建了密度感應信號相關(guān)基因luxS和鞭毛基因pilA的缺失株。但在實際操作中，上述2種方法的成功率并不高。Zhang等[12-13]從HPS全基因組序列中發(fā)現(xiàn)ACCGCTTGT序列與已報道的USS很相似，并證實了該序列適用HPS的自然轉(zhuǎn)化，成功建立了一種改進的自然轉(zhuǎn)化方法并對其進行優(yōu)化，分別構(gòu)建出了HPS ΔompP2和ΔompP5缺失株，為HPS遺傳操作和基因功能的研究提供了技術(shù)平臺。

外膜脂蛋白在革蘭氏陰性菌中廣泛存在，是許多細菌的重要免疫原性蛋白，同時也被認為與致病菌的毒力密切相關(guān)[14-15]。VacJ脂蛋白存在于巴斯德菌科的多數(shù)成員中，但是其在HPS致病過程中的作用迄今尚未闡明。故本研究利用上述改進的自然轉(zhuǎn)化方法在成功構(gòu)建HPSvacJ基因缺失株的基礎上，并進一步分析了缺失株的生物學特性，以期闡明vacJ基因在HPS致病中的作用，為該病及其相關(guān)疾病的防治提供十分重要的科學參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1菌株和質(zhì)粒

本研究所用菌株和質(zhì)粒見表1。

表1 菌株及質(zhì)粒Tab.1 Bacterial strains and plasmids

1.2引物

根據(jù)NCBI中發(fā)布的HPS 5型菌株SH0165序列[16]設計所用引物(表2)，所用引物均由上海生工生物工程公司合成。

表2 引物及其序列Tab.2 Primers used for PCR amplification

注：下劃線部分為酶切位點。

Notes：The underlined part is the enzyme loci.

1.3HPSvacJ基因缺失菌株的構(gòu)建

利用細菌基因組試劑盒提取HPS 5型臨診分離株HS49基因組DNA，分別利用引物P1/P2和P3/P4從中擴增vacJ基因的上游同源臂片段(488 bp)和下游同源臂片段(461 bp)。以上下游同源臂片段為模板，用引物P1/P4進行重疊PCR擴增，純化回收PCR產(chǎn)物，克隆至pMD19-T載體獲得質(zhì)粒p1。用BamH Ⅰ和SalⅠ雙酶切質(zhì)粒p1后回收目的片段，將其克隆至用同樣酶雙酶切后的pK18mobsacB上得到質(zhì)粒p2。利用引物P5/P6擴增出卡那霉素抗性片段(935 bp)，并將其轉(zhuǎn)入質(zhì)粒p2得到質(zhì)粒p3，用優(yōu)化的自然轉(zhuǎn)化方法[12]將質(zhì)粒p3轉(zhuǎn)入HS49菌株，經(jīng)PCR鑒定獲得vacJ基因缺失株ΔvacJ。

1.4細菌生長速率的比較

將野生株HS49和缺失株ΔvacJ接種至TSB培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)過夜。取等量的2種菌株(OD600≈0.1)的菌液再次轉(zhuǎn)接后振蕩培養(yǎng)，每隔1 h測取OD600值，培養(yǎng)至12 h，繪制生長曲線，重復試驗3次。

1.5缺失菌株的穩(wěn)定性分析

菌株SS2-GD01ΔSsn A在 TSA 平板上劃線培養(yǎng)，挑取單菌落接種到TSB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12 h，增殖的菌液為1代。然后將1代菌液再于TSA平板上劃線培養(yǎng)，挑取單菌落接種到TSB培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)12 h，增殖的菌液為2代，如此反復在TSA和TSB培養(yǎng)基中進行傳代，連續(xù)培養(yǎng)20代，每隔2代對增殖的菌液用引物進行PCR擴增鑒定。

1.6細胞黏附及入侵試驗

將PK-15細胞鋪于24孔細胞培養(yǎng)板長成單層，吸取上清，用無菌PBS洗滌細胞3次。按照細菌與細胞比例100∶1加入用RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋的菌液1 mL。孵育2 h后去掉培養(yǎng)液，用PBS洗5次，加含0.25% 胰蛋白酶(Trypsin)/0.02% EDTA的PBS 100 μL 裂解細胞。將細胞破碎液倍比稀釋涂布于TSA平板，置于37 ℃培養(yǎng)，過夜生長后計算菌落數(shù)量，比較不同菌株對細胞黏附的差別。入侵試驗是于黏附試驗結(jié)束后，每孔加入1 mL含100 μg鏈霉素和5 μg青霉素的PBS孵育1 h。

1.7vacJ基因缺失對HPS生物被膜形成的影響

準備潔凈的玻璃試管數(shù)支并分為3組，每支試管加入1 mL新鮮TSB培養(yǎng)基(含新生牛血清和NAD)。分別向每組試管中接入20 μL的野生菌或缺失菌。試管在37 ℃下靜置培養(yǎng)18 h，用移液槍移除菌液并用PBS輕輕沖掉游離菌體，于室溫下用1.5 mL 1%的結(jié)晶紫溶液染色5 min；之后用流水輕緩沖洗3～5 min直至沖洗液變?yōu)闊o色為止，自然風干后觀察結(jié)果[17]。設立空白對照，每組設立3個重復。

1.8野生株HS49與缺失株ΔvacJ對小鼠的致病力比較

選取7周齡雌性Balb/C小鼠，用于小鼠半數(shù)致死量(LD50)測定試驗。將野生株HS49和缺失株ΔvacJ培養(yǎng)至對數(shù)生長期后離心，以適量TSB培養(yǎng)液重懸菌體沉淀，分別按照預試驗測定的LD0與LD100，在兩者劑量區(qū)間內(nèi)分別設置5 個劑量組，經(jīng)腹腔感染小鼠0.5 mL/只。陰性對照組小鼠(5只)給予等量TSB培養(yǎng)基，觀察記錄小鼠發(fā)病及死亡情況，然后計算兩者的LD50。

2 結(jié)果與分析

2.1HPSvacJ基因缺失株篩選及其鑒定

將構(gòu)建的自然轉(zhuǎn)化質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至HPS野生株 HS49中，涂布含Kan抗性的TSA平板進行篩選，獲得Kan抗性的接合子。通過PCR進一步鑒定缺失菌株，利用HPS 16S rRNA引物擴增野生株HS49和缺失株ΔvacJ均能得到510 bp 大小的片段；利用P9/P10引物擴增目的基因vacJ時，HS49 能擴增出一條747 bp大小的目的條帶，而ΔvacJ無此條帶擴出；利用引物對P1/P4 分別擴增出2條大小不同的目的帶，表明ΔvacJ缺失株是由Kan抗性片段取代野生菌HS49中vacJ基因目的片段而成(圖1)。

M.DL2000 Marker；1～2.野生株HS49和缺失株ΔvacJ的16S rRNA片段擴增；3～4.野生株HS49和缺失株ΔvacJ的vacJ基因擴增；5～6.野生株HS49和缺失株ΔvacJ的上游同源臂+插入片段+下游同源臂片段擴增。

M.DL2000 Marker；1-2.TheH.parasuis16S rRNA fragment from the wild-type HS49，and ΔvacJstrains；3-4.ThevacJgene from the wild-type HS49，and ΔvacJstrains；5-6.The segments (the upstream homologous arm region，the intermediate region，and the down homologous arm region ofvacJ) were amplified from the wild-type HS49，and ΔvacJstrains.

圖1HPS缺失株ΔvacJ的鑒定
Fig.1IdentificationoftheΔvacJdeletionstrain

2.2缺失株ΔvacJ的生物學特性分析

在相同培養(yǎng)條件下，于TSB 培養(yǎng)基中37 ℃振蕩培養(yǎng)野生株和缺失株，以培養(yǎng)時間為橫坐標，OD600

值為縱坐標繪制生長曲線。如圖2所示，ΔvacJ生長速度明顯比野生株緩慢。將缺失株反復在TSA和TSB培養(yǎng)基中進行傳代，連續(xù)培養(yǎng)20代，分別以每代菌液作為模板所擴增的結(jié)果均無差別，表明構(gòu)建的基因缺失菌株ΔvacJ能夠穩(wěn)定遺傳。

2.3缺失株ΔvacJ與野生株HS49對宿主細胞黏附入侵力的比較

采用PK-15細胞驗證缺失株ΔvacJ和野生株HS49的黏附能力，試驗重復3次，每次3復孔。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，缺失株ΔvacJ對PK-15 細胞的黏附率明顯低于野生株HS49，統(tǒng)計學上有極顯著差異(P<0.01)

(圖 3-A)。同樣，細胞侵襲試驗也得到相似結(jié)果(圖3-B)。表明HPS的vacJ基因缺失后，其對宿主細胞無論是黏附力還是入侵力均明顯降低。

圖2 野生型HS49和缺失株ΔvacJ生長特性比較Fig.2 Growth of the wild-type HS49，and ΔvacJ deletion strains

**.P<0.01。

2.4野生株HS49與缺失株ΔvacJ生物被膜形成能力的比較

以玻璃試管為載體，通過結(jié)晶紫染色方法，觀察比較野生株HS49與缺失株ΔvacJ的生物被膜形成能力。如圖4顯示，vacJ基因缺失后HPS菌株的生物被膜形成能力明顯下降。

圖4 野生型HS49與缺失株ΔvacJ生物被膜形成比較Fig.4 Biofilm formation of the wild-type HS49，and ΔvacJ deletion strains

2.5野生株HS49與缺失株ΔvacJ對小鼠致病力的比較

如表3所示，HPS基因缺失株ΔvacJ的LD50約為野生株HS49的14倍，表明vacJ基因敲除后，HPS毒力明顯下降。提示vacJ參與了5型HPS的致病過程，是一種新的毒力相關(guān)因子。

表3 缺失株ΔvacJ與野生株HS49對小鼠致病力的比較Tab.3 Virulence of the deletion strain ΔvacJ and the wild-type HS49 strain in mice

注：衰減倍數(shù).與野生株HS49比較，缺失株ΔvacJ對小鼠致病力的衰減倍數(shù)。

Notes：Fold attenuation.Fold attenuation normalised to the wild-type strain.

3 討論

VacJ脂蛋白最早被發(fā)現(xiàn)存在于弗氏志賀菌中，與其傳播有密切關(guān)系[18]。隨后研究證明，VacJ對非分型流感嗜血桿菌的血清抗性和IgM蛋白結(jié)合功能起到重要作用，并能夠調(diào)節(jié)細菌逃避補體殺傷作用[19]。最新研究證實，VacJ是HPS的一個重要免疫原性蛋白，能夠?qū)π∈笃鸬胶芎玫拿庖弑Ｗo作用[20]。為進一步分析vacJ作為潛在毒力因子在HPS致病過程中的作用，本研究選取HPS 血清5型臨診分離株作為研究對象，將vacJ基因敲除后獲得ΔvacJ缺失株，并對其生物學特性進行了分析。

細菌黏附是其寄生活動的基礎和前提條件，細菌黏附宿主細胞后，在該局部組織定居，大量繁殖，產(chǎn)生毒素或侵入深部，損傷或破壞組織，進而造成感染。研究證實，opsX、CDT、rfaD、rfaE和lgtF等基因是HPS的重要黏附因子，均能顯著降低HPS對宿主細胞的黏附力[8]。在本研究中，vacJ基因缺失后HPS菌株對于PK-15細胞的黏附力以及入侵力均明顯下降，提示vacJ基因可能是HPS的黏附因子之一，或是通過調(diào)節(jié)其他黏附因子表達而起作用，其具體作用機制還有待進一步研究證實。

生物被膜形成能力是病原菌一種重要的毒力標志，多數(shù)血清型的HPS菌株能在體外形成生物被膜，被認為與其能抵抗不利環(huán)境和發(fā)揮致病作用有關(guān)[17]。研究已證實，某些在病原菌致病作用中發(fā)揮重要作用的基因，如流感嗜血桿菌的lsgB和siaA基因缺失后能導致細菌生物被膜的丟失[21]。本研究將HPS的vacJ基因缺失后，其生物被膜形成能力明顯降低，進一步提示vacJ基因與HPS毒力相關(guān)。

為了進一步證實vacJ基因?qū)PS毒力的影響，本項目進而開展了小鼠體內(nèi)致病性研究，比較了野生株和缺失株對小鼠的LD50。VacJ缺失株相比于野生株需要更高的劑量才能導致小鼠半數(shù)致死，表明該基因缺失導致HPS 毒力降低。據(jù)此推測vacJ基因缺失可能影響了某些致病性相關(guān)基因表達從而引起表型改變，但其對HPS毒力的具體調(diào)控機制還需要進一步探討。

本研究成功構(gòu)建了HPS 5型臨診分離株HS49的vacJ基因缺失株，通過一系列生物學特性比較顯示，vacJ基因缺失對HPS 生長速度、生物被膜形成、黏附入侵及毒力均有調(diào)節(jié)作用，這一研究結(jié)果對進一步探究vacJ基因在HPS致病中的作用奠定了基礎，并為研究相關(guān)弱毒疫苗提供了科學試驗依據(jù)。

[1] Oliveira S，Pijoan C.Haemophilusparasuis：new trends on diagnosis，epidemiology and control[J]. Veterinary Microbiology，2004，99(1)：1-12.

[2] M?ller K，Kilian M. V factor-dependent members of the family Pasteurellaceae in the porcine upper respiratory tract[J]. Journal of Clinical Microbiology，1990，28(12)：2711-2716.

[3] Cerdà-Cuéllar M，Naranjo J F，Verge A，et al. Sow vaccination modulates the colonization of piglets byHaemophilusparasuis[J]. Veterinary Microbiology，2010，145(3/4)：315-320.

[4] Costa-Hurtado M，Aragon V. Advances in the quest for virulence factors ofHaemophilusparasuis[J]. Veterinary Journal，2013，198(3)：571-576.

[5] Hill C E，Metcalf D S，Macinnes J I. A search for virulence genes ofHaemophilusparasuisusing differential display RT-PCR[J]. Veterinary Microbiology，2003，96(2)：189-202.

[6] Sack M，Baltes N. Identification of novel potential virulence-associated factors inHaemophilusparasuis[J]. Veterinary Microbiology，2009，136(3/4)：382-386.

[7] Lillie B N，Hammermueller J D，Macinnes J I，et al. Porcine mannan-binding lectin A binds toActinobacillussuisandHaemophilusparasuis[J]. Developmental and Comparative Immunology，2006，30(10)：954-965.

[8] 曾 澤，何 歡，岳 華，等. 副豬嗜血桿菌lgtF基因缺失株的構(gòu)建及其部分生物學特性[J]. 畜牧獸醫(yī)學報，2015，46(11)：2056-2062.

[9] Huang J，Wang X，Cao Q，et al. ClpP participates in stress tolerance and negatively regulates biofilm formation inHaemophilusparasuis[J]. Veterinary Microbiology，2016，182：141-149.

[10] Bigas A，Garrido M E，De Rozas A M，et al. Development of a genetic manipulation system forHaemophilusparasuis[J]. Veterinary Microbiology，2005，105(3/4)：223-228.

[11] 馬艷平. 副豬嗜血桿菌生物被膜形成相關(guān)基因luxS和pilA的克隆和功能鑒定[D]. 北京：中國農(nóng)業(yè)科學院，2010.

[12] Zhang B，F(xiàn)eng S，Xu C，et al. Serum resistance inHaemophilusparasuisSC096 strain requires outer membrane protein P2 expression[J]. FEMS Microbiology Letters，2012，326(2)：109-115.

[13] Zhang B，Xu C，Zhou S，et al. Comparative proteomic analysis of aHaemophilusparasuisSC096 mutant deficient in the outer membrane protein P5[J]. Microbial Pathogenesis，2012，52(2)：117-124.

[14] Sutcliffe I C，Harrington D J，Hutchings M I. A phylum level analysis reveals lipoprotein biosynthesis to be a fundamental property of bacteria[J]. Protein & Cell，2012，3(3)：163-170.

[15] Cloeckaert A，Vizcaíno N，Paquet J Y，et al. Major outer membrane proteins ofBrucellaspp.：past，present and future[J]. Veterinary Microbiology，2002，90(1/4)：229-247.

[16] Yue M，Yang F，Yang J，et al. Complete genome sequence ofHaemophilusparasuisSH0165[J]. Journal of Bacteriology，2009，191(4)：1359-1360.

[17] Jin H，Zhou R，Kang M，et al. Biofilm formation by field isolates and reference strains ofHaemophilusparasuis[J]. Veterinary Microbiology，2006，118(1/2)：117-123.

[18] Suzuki T，Murai T，F(xiàn)ukuda I，et al. Identification and characterization of a chromosomal virulence gene，vacJ，required for intercellular spreading ofShigellaflexneri[J]. Molecular Microbiology，1994，11(1)：31-41.

[19] Nakamura S，Shchepetov M，Dalia A B，et al. Molecular basis of increased serum resistance among pulmonary isolates of non-typeableHaemophilusinfluenzae[J]. PLOS Pathogens，2011，7(1)：e1001247.

[20] Li M，Li C，Song S，et al. Development and antigenic characterization of three recombinant proteins with potential for Gl?sser′s disease prevention[J]. Vaccine，2016，34(19)：2251-2258.

[21] Greiner L L，Watanabe H，Phillips N J，et al. NontypeableHaemophilusinfluenzaestrain 2019 produces a biofilm containing n-acetylneuraminic acid that May mimic sialylated o-linked glycans[J]. Infection and Immunity，2004，72(7)：4249-4260.

ConstructionandBiologicalCharacterizationofvacJGeneDeletionStrainofHaemophilusparasuis

ZHAO Liangyou1，2，GAO Xueli1，LIU Chaonan1，SHEN Hailong4，JIANG Nan3，WAN Weiquan1，Lü Xiaoping1，ZHENG Shimin1

(1.College of Veterinary Medicine，Northeast Agricultural University，Heilongjiang Key Laboratory for Laboratory Animals and Comparative Medicine，Harbin 150030，China；2.Drug Safety Evaluation Center of Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China；3.College of Life Science and Technology，Dalian University，Dalian 116622，China；4.Agriculture Bureau of Changxing，Huzhou 313100，China)

To investigate the role of thevacJgene inHaemophilusparasuis(HPS) virulent strain HS49，thevacJgene-deletion mutant ΔvacJstrain was constructed. To better assess the role ofvacJgene in the virulence of HPS，growth characteristics，adhesion and invasion to host cells，and experimental infection of mice were performed. The results supported that compared to the wild-type strain，the growth rate ofvacJdeletion strain was decreased. The ΔvacJdeletion strain exhibited a significantly decrease ability to adhere to and invade PK-15 cell. Furthermore，the ΔvacJwas attenuated in a murine (Balb/C) model of infection and its LD50value was approximately fourteen-fold higher than the wild-type. The data obtained in this study indicate thatvacJplays an essential role in growth，adherence to and invasion of host cells，biofilm formation，and related to HPS and further suggest a putative role ofvacJlipoprotein in virulence regulation.

Haemophilusparasuis；vacJgene；Biological characteristics；Virulence

2017-08-03

國家自然科學基金項目(31472169)

趙良友(1982-),男,黑龍江哈爾濱人,助理研究員,在讀博士,主要從事動物免疫病理和毒性病理研究。

鄭世民(1959-),男,黑龍江哈爾濱人,教授,博士,主要從事動物免疫病理研究。

Q78

A

1000-7091(2017)05-0019-06

10.7668/hbnxb.2017.05.004