翟 瑩，張 軍，任巍巍，張 闖，趙 艷，張梅娟

(1.齊齊哈爾大學(xué) 生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所，黑龍江 齊齊哈爾 161005)

大豆低溫誘導(dǎo)啟動(dòng)子GmERF9P的克隆及活性鑒定

翟 瑩1，張 軍2，任巍巍1，張 闖1，趙 艷1，張梅娟1

(1.齊齊哈爾大學(xué) 生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所，黑龍江 齊齊哈爾 161005)

為獲得低溫誘導(dǎo)基因GmERF9啟動(dòng)子，并分析該啟動(dòng)子的功能，利用PCR技術(shù)從大豆葉片基因組DNA中克隆1 885 bp的GmERF9啟動(dòng)子序列GmERF9P。序列分析表明，GmERF9P序列中含有多種與逆境相關(guān)的順式作用元件。將GmERF9P構(gòu)建到植物表達(dá)載體pCAMBIA1301上并轉(zhuǎn)化煙草。通過(guò)PCR檢測(cè)共獲得6株T1陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因煙草株系。對(duì)野生型煙草和轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行低溫處理2 h，通過(guò)GUS組織化學(xué)染色和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)GUS基因的表達(dá)量。結(jié)果顯示GmERF9P在低溫處理下能夠提高GUS基因的表達(dá)量，具有低溫誘導(dǎo)啟動(dòng)活性。

大豆；GmERF9P；啟動(dòng)子；低溫誘導(dǎo)；轉(zhuǎn)基因煙草

啟動(dòng)子是DNA分子上位于結(jié)構(gòu)基因上游，具有多種順式作用元件的一段DNA序列，能夠結(jié)合RNA多聚酶從而啟動(dòng)結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄[1]。內(nèi)源或外源基因的表達(dá)效率主要取決于啟動(dòng)子的活性。按照基因的表達(dá)方式，植物基因啟動(dòng)子可以分為組成型啟動(dòng)子、組織特異型啟動(dòng)子及誘導(dǎo)型啟動(dòng)子[2]。組成型啟動(dòng)子雖然能夠有效地驅(qū)動(dòng)外源抗逆基因過(guò)量表達(dá)，但這種無(wú)組織、無(wú)環(huán)境、無(wú)時(shí)間特異性的表達(dá)不僅會(huì)造成植物營(yíng)養(yǎng)和能源的浪費(fèi)，甚至?xí)鹬参锷泶x紊亂，進(jìn)而影響植物的正常生長(zhǎng)發(fā)育。例如應(yīng)用CaMV35S啟動(dòng)子改良植物抗逆性時(shí)，引起了植株的矮化畸形[3-4]。而逆境脅迫誘導(dǎo)啟動(dòng)子在正常環(huán)境下不影響植物的正常生長(zhǎng)代謝，只在植物遭受不良環(huán)境時(shí)啟動(dòng)抗逆基因的超量表達(dá)，使植物表現(xiàn)出一定的抗逆性。因此，特定條件下的植物遺傳改良才是未來(lái)植物基因工程的研究方向。

目前，國(guó)內(nèi)外存在一些有關(guān)低溫誘導(dǎo)啟動(dòng)子的報(bào)道。例如擬南芥rd29A啟動(dòng)子是目前抗寒基因工程中應(yīng)用最廣泛的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，由rd29A驅(qū)動(dòng)DREB1A基因在煙草中表達(dá)可以提高轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)低溫的抗性，并且不會(huì)影響植株的正常生長(zhǎng)[5]。分別將CaMV35S組成型啟動(dòng)子和冷誘導(dǎo)rd29A啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的CBF基因在轉(zhuǎn)基因煙草中表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在低溫環(huán)境下由rd29A驅(qū)動(dòng)CBF的轉(zhuǎn)基因植株比由CaMV35S驅(qū)動(dòng)CBF的轉(zhuǎn)基因植株表型要正常[5]。擬南芥低溫誘導(dǎo)cor15a啟動(dòng)子在馬鈴薯中也同樣具有低溫誘導(dǎo)表達(dá)的能力，暗示不同植物的低溫反應(yīng)可能具有相同或相似的遺傳調(diào)控機(jī)制[6-7]。這些都為植物低溫誘導(dǎo)啟動(dòng)子的克隆及應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

由于ERF類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子在植物應(yīng)對(duì)逆境環(huán)境時(shí)起重要的調(diào)控作用[8-9]，ERF基因的研究也越來(lái)越受到人們的關(guān)注。但是目前大部分研究仍停留在基因的功能和調(diào)控等方面，對(duì)其抗逆分子機(jī)制研究仍然欠缺，尤其是ERF啟動(dòng)子的相關(guān)研究很少。2013年于曉惠等[10]克隆了巴西橡膠的HbERF3啟動(dòng)子，但并未做功能驗(yàn)證。齊齊哈爾大學(xué)植物分子育種實(shí)驗(yàn)室在2014年克隆大豆的GmERF5啟動(dòng)子序列并進(jìn)行了初步的活性分析，發(fā)現(xiàn)其具有干旱和低溫誘導(dǎo)啟動(dòng)活性，但也未在植物中進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá)驗(yàn)證[11]。本實(shí)驗(yàn)室在前期研究工作中證實(shí)大豆GmERF9基因在低溫(4 ℃)處理下表達(dá)量升高，且在處理2 h時(shí)表達(dá)量升高最顯著[12]。本研究克隆GmERF9基因的啟動(dòng)子序列，與GUS基因融合構(gòu)建植物表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化煙草，進(jìn)而鑒定該啟動(dòng)子在低溫誘導(dǎo)下的啟動(dòng)活性，為其在植物抗寒基因工程育種中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1試驗(yàn)材料

試驗(yàn)中所用大豆品種合豐46、煙草NC89、植物表達(dá)載體pCAMBIA1301、大腸桿菌DH5α菌株及根癌農(nóng)桿菌EHA105菌株均由本實(shí)驗(yàn)室保存。所用引物的合成及測(cè)序工作均由上海生工公司完成。

1.2啟動(dòng)子克隆及序列分析

將已克隆的大豆乙烯響應(yīng)因子基因GmERF9的cDNA序列于大豆基因組數(shù)據(jù)庫(kù)GmGDB(http：//www.plantgdb.org/GmGDB/)中進(jìn)行Blast搜索，獲得其上游大概2 000 bp 的啟動(dòng)子序列。利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer 5設(shè)計(jì)該啟動(dòng)子序列引物(F：5′-ACGCGTCGACCCGTGCAACTTGATATTCGT-3′，下劃線代表SalⅠ酶切位點(diǎn)；R：5′-GGCCATGGTTTTTGG

TTGTGAAATTGAGG-3′，下劃線代表NcoⅠ酶切位點(diǎn))。采用植物基因組DNA提取試劑盒(購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)公司)提取大豆葉片基因組DNA。以基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR 程序：94 ℃ 8 min ；94 ℃ 40 s，56 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸8 min。將上述擴(kuò)增片段回收后與克隆載體pMD18-T(購(gòu)自TaKaRa公司)連接并測(cè)序。利用PlantCARE(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)和PLACE(http：//www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalup.html)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)啟動(dòng)子中的順式作用元件進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。

1.3植物表達(dá)載體構(gòu)建

用SalⅠ和NcoⅠ2種限制性?xún)?nèi)切酶(各種限制性?xún)?nèi)切酶均購(gòu)自TaKaRa公司)雙酶切pMD18-T-GmERF9P質(zhì)粒，將酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠DNA純化回收試劑盒(購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)公司)純化后，與同樣用SalⅠ和NcoⅠ雙酶切的pCAMBIA1301載體(目的為切除CaMV35S啟動(dòng)子)連接，連接產(chǎn)物經(jīng)熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。菌液擴(kuò)繁后經(jīng)質(zhì)粒提取試劑盒(購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)公司)提取質(zhì)粒。質(zhì)粒經(jīng)SalⅠ和NcoⅠ雙酶切驗(yàn)證后轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌EHA105。

1.4煙草轉(zhuǎn)化及篩選

利用農(nóng)桿菌侵染煙草葉盤(pán)法將pCAMBIA1301-GmERF9P重組載體轉(zhuǎn)化煙草NC89[13]，同時(shí)轉(zhuǎn)化pCAMBIA1301空載體作為陽(yáng)性對(duì)照。經(jīng)潮霉素(8 mg/L)篩選，獲得T0抗性轉(zhuǎn)化苗。提取抗性轉(zhuǎn)化苗葉片DNA作為模板，提取野生型煙草葉片DNA作為陰性對(duì)照模板，以pCAMBIA1301-GmERF9P質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選T0陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株。單株收獲T0陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株的種子，將其在MS培養(yǎng)基(含潮霉素6 mg/L)中繼續(xù)篩選，獲得T1轉(zhuǎn)基因植株。對(duì)T1轉(zhuǎn)基因植株再次進(jìn)行PCR檢測(cè)(方法同上)，取T1陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因煙草植株進(jìn)行功能鑒定。

1.5GUS組織化學(xué)染色

將6周T1轉(zhuǎn)基因煙草置于4 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行低溫處理。剪取未處理的T1轉(zhuǎn)基因煙草葉片和低溫處理2 h的T1轉(zhuǎn)基因煙草葉片，同時(shí)剪取未處理和低溫處理2 h的野生型煙草葉片作為陰性對(duì)照，進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色：加入GUS染色液，于37 ℃溫育過(guò)夜，用75%的乙醇脫色至底色完全消失[14]。

1.6實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

將6周T1轉(zhuǎn)基因煙草置于4 ℃培養(yǎng)箱中低溫處理2 h。剪取低溫處理2 h和未處理的T1轉(zhuǎn)基因煙草葉片0.1 g，同時(shí)剪取pCAMBIA1301 T1轉(zhuǎn)基因煙草葉片作為陽(yáng)性對(duì)照，迅速置于液氮中，-80 ℃保存?zhèn)溆?。提取煙草葉片總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈(試劑盒均購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)公司)。以cDNA作為模板，選取煙草組成型表達(dá)基因α-tubulin(GenBank登錄號(hào)：AB052822)作為內(nèi)參基因(F：5′-ATGAGAGAGTGCATATCGAT-3′；R：5′-TTCACTGAAGAAGGTGTTGAA-3′)，在BIO-RAD CFX96 Real-time PCR儀上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。GUS基因擴(kuò)增引物如下，F(xiàn)：5′-GATCGCGAAAACTGTGGAAT-3′；R：5′-TAATGAGTGACCGCATCGAA-3′[15]。反應(yīng)體系參照Z(yǔ)hai等[12]進(jìn)行，各處理均做3次重復(fù)，采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1GmERF9P克隆及序列分析

經(jīng)PCR擴(kuò)增得到GmERF9 基因啟動(dòng)子序列，命名為GmERF9P，長(zhǎng)度1 885 bp(圖1)。將GmERF9P序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源性Blast，沒(méi)有得到與其具有較高同源性的啟動(dòng)子序列，表明GmERF9P是一個(gè)新的啟動(dòng)子序列。利用在線數(shù)據(jù)庫(kù)PlantCARE和PLACE對(duì)GmERF9P進(jìn)行序列分析，結(jié)果顯示(圖2)，GmERF9P序列中含有4個(gè)可能賦予GmERF9基因高轉(zhuǎn)錄水平的5′ UTR Py-rich stretch元件，2個(gè)水

楊酸響應(yīng)元件TCA-element，3個(gè)防御與脅迫響應(yīng)元件TC-rich repeats，1個(gè)厭氧誘導(dǎo)元件ARE、10個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)、4個(gè)MYC轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)和4個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。以上結(jié)果表明GmERF9P可能對(duì)逆境脅迫存在響應(yīng)。

M.DL2000 Marker；1.GmERF9P PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

圖2 GmERF9P序列

2.2植物表達(dá)載體構(gòu)建

通過(guò)SalⅠ和NcoⅠ 2個(gè)限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)，將GmERF9P構(gòu)建到植物表達(dá)載體pCAMBIA1301上，替換pCAMBIA1301載體上GUS基因上游的CaMV35S啟動(dòng)子。經(jīng)質(zhì)粒雙酶切，獲得與目的基因大小相同的酶切條帶(圖3)，表明目的基因已整合進(jìn)植物表達(dá)載體。將含有目的基因的重組載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌EHA105。

M.DL2000 Marker；1～2.GmERF9P質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物。M.DL2000 Marker；1-2.Products of GmERF9P plasmid double digestion.

2.3煙草遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株篩選

取無(wú)菌煙草葉片進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，在愈傷組織中篩選抗性芽，待抗性芽生長(zhǎng)至1 cm左右時(shí)(圖4-A)，將其分離并轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基中。4～5周后抗性芽長(zhǎng)出根系并逐漸成苗(圖4-B)。經(jīng)PCR檢測(cè)(圖5)，GmERF9P序列成功整合到煙草基因組中，共獲得GmERF9P陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因煙草6株。

圖4 GmERF9P轉(zhuǎn)基因煙草篩選

M.DL2000 Marker；1～6.GmERF9P轉(zhuǎn)基因煙草；7.野生型煙草；8.pCAMBIA1301-GmERF9P陽(yáng)性質(zhì)粒。M.DL2000 Marker；1-6.Transgenic tobacco of GmERF9P；7. Wild typetobacco；8. Positive plasmid of pCAMBIA1301-GmERF9P.

2.4GmERF9P的低溫誘導(dǎo)啟動(dòng)活性分析

前期研究表明，低溫處理可使GmERF9表達(dá)量升高，且處理2 h效果最明顯。所以對(duì)GmERF9P轉(zhuǎn)基因煙草低溫處理2 h并進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色和實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析。首先，煙草葉片的GUS組織化學(xué)染色結(jié)果如圖6所示，未處理和低溫處理2 h的野生型煙草葉片沒(méi)有被染成藍(lán)色；未處理的T1轉(zhuǎn)基因煙草葉片被染成藍(lán)色，但著色較淺，表明GmERF9P具有啟動(dòng)子的啟動(dòng)活性；低溫處理2 h的T1轉(zhuǎn)基因煙草葉片被染成藍(lán)色且著色較深，表明GmERF9P的啟動(dòng)活性在低溫處理2 h時(shí)被誘導(dǎo)，使下游報(bào)告基因GUS的表達(dá)量增高。

A.未處理野生型煙草葉片；B.低溫處理2 h野生型煙草葉片；C.未處理T1轉(zhuǎn)基因煙草片；D.低溫處理2 h T1轉(zhuǎn)基因煙草片。A.Leaves of untreatment wild type tobacco；B.Leaves of wild type tobacco under cold treatment for 2 h；C.Leaves of untreatment T1 transgenic tobacco；D.Leaves of T1 transgenic tobacco under cold treatment for 2 h.

另外，GUS基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR結(jié)果如圖7所示，在正常條件下GmERF9P轉(zhuǎn)基因煙草中GUS基因的表達(dá)量較低，低溫處理2 h時(shí)GmERF9P轉(zhuǎn)基因煙草中GUS基因的表達(dá)量明顯升高，再次證明GmERF9P具有低溫誘導(dǎo)啟動(dòng)活性。

圖7 低溫處理 2 h轉(zhuǎn)基因煙草中GUS基因表達(dá)量Fig.7 The expression of GUS in GmERF9P transgenic tobacco under cold treatment for 2 h

3 討論

本研究采用生物信息學(xué)和PCR方法對(duì)大豆ERF轉(zhuǎn)錄因子GmERF9基因5′端調(diào)控區(qū)進(jìn)行了克隆，得到了1 885 bp的GmERF9基因啟動(dòng)子序列。對(duì)該序列進(jìn)行在線軟件預(yù)測(cè)分析，結(jié)果顯示，該序列含有多種脅迫相關(guān)的順式作用元件。例如MYB元件在擬南芥抗逆相關(guān)基因rd22、rd17和rd19啟動(dòng)子中均存在[1，16]；擬南芥中受低溫誘導(dǎo)表達(dá)的CBF1、CBF2和CBF3基因啟動(dòng)子中均含有MYC元件[17]；旋蒴苣苔BhGolS1基因啟動(dòng)子中含有4個(gè)WRKY元件與WRKY基因一起參與植物的脫水脅迫[18]。表明MYB、MYC和WRKY轉(zhuǎn)錄因子可能調(diào)節(jié)GmERF9基因的表達(dá)[19]。根據(jù)以上預(yù)測(cè)結(jié)果推測(cè)，GmERF9P可能與逆境脅迫誘導(dǎo)相關(guān)，具有逆境誘導(dǎo)啟動(dòng)活性，當(dāng)然還需進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。此推論與大豆中GmERF9基因在高鹽、干旱和低溫處理下表達(dá)量升高的結(jié)果相吻合[12]，這些表達(dá)量的升高可能與GmERF9P序列中存在響應(yīng)逆境脅迫的順式作用元件相關(guān)。以往研究也表明，ERF家族基因廣泛參與植物的多種逆境應(yīng)答。例如，玉米ZmERF1的表達(dá)可以被高鹽、高溫和滲透脅迫共同誘導(dǎo)[20]。大豆中的另一個(gè)ERF轉(zhuǎn)錄因子GmERF5可以被大豆疫霉菌、乙烯、脫落酸和水楊酸誘導(dǎo)表達(dá)，其啟動(dòng)子的啟動(dòng)活性還可以被高鹽和干旱脅迫所誘導(dǎo)[21]。

為了明確GmERF9P的低溫誘導(dǎo)表達(dá)特性，將該啟動(dòng)子與GUS基因相連，構(gòu)建成植物表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化煙草。在低溫處理?xiàng)l件下，轉(zhuǎn)基因煙草中GUS基因表達(dá)量增加，證明該啟動(dòng)子具有低溫誘導(dǎo)表達(dá)特性。同時(shí)也說(shuō)明GmERF9P啟動(dòng)子序列中的順式作用元件與轉(zhuǎn)錄因子相互作用，在分子水平上調(diào)節(jié)植物對(duì)低溫脅迫的抗性[1，22]。但是由于植物內(nèi)基因表達(dá)調(diào)控方式非常復(fù)雜，在這些預(yù)測(cè)的順式作用元件中到底哪些發(fā)揮了作用還需進(jìn)一步的驗(yàn)證。另外我們也對(duì)GmERF9P在干旱和高鹽處理2 h下的誘導(dǎo)活性進(jìn)行了鑒定，但與對(duì)照相比并沒(méi)有顯示出明顯差異，說(shuō)明GmERF9P對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)是多方面而且復(fù)雜的，還可能涉及啟動(dòng)子序列長(zhǎng)度以及逆境處理時(shí)間等因素的影響，這方面仍需做進(jìn)一步研究。本研究對(duì)了解逆境脅迫下植物ERF轉(zhuǎn)錄因子的分子調(diào)控機(jī)制具有重要的理論意義，同時(shí)為植物抗寒育種提供有利工具。

本研究利用PCR技術(shù)從大豆葉片基因組DNA中克隆1 885 bp的GmERF9P啟動(dòng)子。序列分析表明GmERF9P序列中含有多種與逆境相關(guān)的順式作用元件。將GmERF9P構(gòu)建到植物表達(dá)載體pCAMBIA1301上并轉(zhuǎn)化煙草。GUS組織化學(xué)染色和實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，GmERF9P在低溫處理下能夠提高GUS基因的表達(dá)量，具有低溫誘導(dǎo)啟動(dòng)活性。

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CloningandActivityAnalysisofColdInducedGmERF9PPromoterfromSoybean

ZHAI Ying1，ZHANG Jun2，REN Weiwei1，ZHANG Chuang1，ZHAO Yan1，ZHANG Meijuan1

(1.College of Life Science and Agro-Forestry，Qiqihar University，Qiqihar 161006，China； 2.Heilongjiang Institute of Veterinary Science，Qiqihar 161005，China)

Promoters play a key role in the regulation of gene expression. The objective of this study is to isolate and characterize theGmERF9 promoter (GmERF9P) from soybean. TheGmERF9Pwas amplified with PCR from the genome DNA of soybean，which had a length of 1 885 bp. Sequence analysis indicated thatGmERF9Pcontained a number of stress-related elements. TheGmERF9Pwas cloned into plant expression vector of pCAMBIA1301 and transformed into tobacco NC89. The regenerated plants were analyzed by PCR and showed that the promoter fragments were integrated into six genomes of tobacco plants. Histochemical staining of GUS activity and Real-time fluorescent quantitative PCR of the transgenic plants showed that the expression ofGUSgene was increased under cold treatment for 2 h，which proved thatGmERF9Pwas an efficient cold-inducible promoter.

Soybean；GmERF9P；Promoter；Cold induced；Transgenic tobacco

2017-06-21

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31301335)；黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(12541889)；黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(C201458)；黑龍江省普通本科高等學(xué)校青年創(chuàng)新人才培養(yǎng)計(jì)劃(UNPYSCT_2016090)

翟 瑩(1982-)，女，吉林人，副教授，博士，主要從事大豆分子育種研究。

Q78；S565.03

A

1000-7091(2017)05-0013-06

10.7668/hbnxb.2017.05.003